Article de méthode

Un protocole Facile à générer des protéines relativement acétylées chez Escherichia Coli

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DOI :

10.3791/57061

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9 décembre 2017

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Dans cet article

Résumé

Expansion du code génétique est un outil puissant pour étudier un large éventail de processus biologiques, y compris l’acétylation protéique. Nous démontrons un protocole facile à exploiter cette technique pour générer de façon homogène acétylé de protéines à des sites spécifiques dans les cellules d’Escherichia coli .

Résumé

Les modifications post-traductionnelles qui se produisent à des positions spécifiques des protéines ont démontré que jouent un rôle important dans divers processus cellulaires. Parmi eux, acétylation de la lysine réversible est l’un du plus largement distribué dans tous les domaines de la vie. Bien que de nombreuses études acetylome basé sur la spectrométrie de masse ont été effectuées, outre caractérisation de ces cibles d’acétylation putative a été limitée. Une des raisons est qu’il est difficile de produire des protéines purement acétylées aux positions souhaitées par la plupart des approches biochimiques classiques. Pour relever ce défi, la technique d’expansion de code génétique a été appliquée pour utiliser la paire de variante de machiné pyrrolysyl-tRNA synthétase et son ARNt délivre-t-il des espèces de Methanosarcinaceae , pour diriger l’incorporation présent d’acetyllysine sur le site spécifique de la protéine d’intérêt. Après la première application à l’étude de l’acétylation des histones, cette approche a facilité des études d’acétylation sur une variété de protéines. Dans ce travail, nous avons démontré un protocole facile pour produire des protéines relativement acétylés en utilisant la bactérie modèle Escherichia coli comme hôte. Malate déshydrogénase a été utilisée comme un exemple de démonstration dans cet ouvrage.

Introduction

Les modifications post-traductionnelles des protéines (PTMs) surviennent après le processus de traduction et sont addition covalente de groupes fonctionnels aux résidus d’acides aminés jouant un rôle important dans presque tous les processus biologiques, y compris le gène transcription, réponse au stress, différenciation cellulaire et métabolisme1,2,3. À ce jour, environ 400 distinctif SPTM ont été identifiés4. La complexité du génome et le protéome est amplifiée dans une large mesure par la protéine SPTM, car ils régulent la localisation et l’activité de la protéine et affectent l’interaction avec d’autres molécules comme les protéines, acides nucléiques, lipides et cofacteurs5.

L’acétylation protéique a été à l’avant-garde des études SPTM dans les derniers vingt ans6,7,8,9,10,11,12. Acétylation de la lysine a été découvert en histones il y a plus de 50 ans13,14, a été bien étudié et est connue dans plus de 80 facteurs de transcription, les régulateurs et diverses protéines15, 16,17. Études sur l’acétylation protéique ont non seulement nous a fourni une meilleure compréhension de ses mécanismes de réglementation, mais aussi guidé les traitements pour un certain nombre de maladies causées par l’acétylation dysfonctionnel18,19, 20 , 21 , 22 , 23. on a cru que l’acétylation de la lysine n’arrive que chez les eucaryotes, mais des études récentes ont montré cette acétylation protéique joue également des rôles clés dans la physiologie bactérienne, y compris la chimiotaxie, résistance aux acide, activation et stabilisation de îles de pathogénicité et autre virulence des protéines24,25,26,27,28,29.

Une méthode couramment utilisée pour caractériser biochimiquement acétylation de la lysine est à l’aide de mutagenèse dirigée. Glutamine est utilisée comme un imitateur d’acetyllysine en raison de sa taille et sa polarité similaire. Arginine est utilisé comme un imitateur de lysine acétylée non, car il conserve sa charge positive dans des conditions physiologiques, mais ne peut pas être acétylée. Toutefois, les deux imitateurs ne sont pas des vrais isostères et ne donnent pas toujours les résultats escomptés30. L’approche plus rigoureuse consiste à générer des protéines homogènement acétylées aux résidus de lysine spécifique, qui est difficile, voire impossible, pour des méthodes plus classiques en raison de la faible stoechiométrie d’acétylation de la lysine dans nature7,11. Ce défi a été élucidé par la stratégie d’expansion de code génétique, qui emploie une ingénierie pyrrolysyl-tRNA synthétase variant de Methanosarcinaceae espèces de facturer les ARNtPyl avec acetyllysine, utilise l’hôte translationnelle machines pour réprimer l’UAG arrêtez le codon de l’ARNm et ordonne à l’incorporation d’acetyllysine en position conçue des protéines cibles31. Récemment, nous avons optimisé ce système avec une amélioration de l’EF-Tu-liaison ARNt32 et une mise à niveau acetyllysyl-ARNt synthétase33. En outre, nous avons appliqué ce système amélioré d’incorporation dans les études d’acétylation de malate déshydrogénase34 et tyrosyl-tRNA synthétase35. Ici, nous montrons le protocole pour générer des protéines purement acétylés depuis le clonage moléculaire d’identification biochimique à l’aide de la malate déshydrogénase (MDH), dont nous avons longuement étudié comme un exemple démonstratif.

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Protocole

1. mutagenèse du gène cible

Note : MDH est exprimée par un promoteur T7 dans le vecteur de pCDF-1 avec l’origine de CloDF13 et un nombre de copies de 20 à 4034.

  1. Introduire le codon ambre à la position du gène 140 amorces (avant apprêt : GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG et amorce de marche arrière : GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), suivant les instructions de la trousse de mutagenèse dirigée.
  2. Amplifier le plasmide de modèle contenant le gène de déshydratase sauvage malate, puis insérez la mutation du codon stop par la polymérase chain reaction (PCR). Dans le mélange réactionnel, incluent 12,5 µL du mélange d’enzymatique 2 X ADN polymérase, 1,25 ml d’apprêt avant de 10 µM, 1,25 ml d’apprêt inverse de 10 µM, 1 µL d’ADN (20 ng/µL) (pCDF-1 plasmide contenant le gène de type sauvage MDH) et 9 µL d’eau exempte de nucléase.
    1. Utilisez les paramètres de réaction PCR comme suit : Initial dénaturation à 98 ° C pendant 30 s ; 25 cycles de 10 s à 98 ° C, 30 s à 55 ° C et 3 min à 72 ° C ; extension finale à 72 ° C pendant 3 min. Après les PCR, ajouter le matériel amplifié directement au mélange enzyme Kinase-Ligase-DpnI du kit pendant 1 h à température ambiante pour l’enlèvement de circularization et de modèle.
      Remarque : Le mélange réactionnel contient 1 µL de produit PCR, 5 µL de 2 X tampon de réaction, 1 µL du mélange d’enzyme Kinase-Ligase-DpnI X 10 et 3 µL d’eau exempte de nucléase.
  3. Ajouter 5 µL du mélange réaction au tube de 25 µL décongelés compétentes d' e. coli DH5α cellules du kit. Soigneusement glissement du tube pour mélanger et placer le mélange sur la glace pendant 30 minutes un choc thermique du mélange à 42 ° C pendant 30 s et le lieu sur la glace pour supplémentaire 5 min.
    1. Distribuer 600 µL de température ambiante optimale Super bouillon avec les médias (SOC) la répression catabolique du kit dans le mélange, incuber à 37 ° C pendant 60 min avec agitation à 250 tr/min, répandre 100 µL sur une gélose de bouillon (LB) de lysogénie avec l’antibiotique correspondant et incuber une nuit à 37 ° C sous agitation à 250 tr/min.
  4. Prélever des colonies seul 4-6 en 6 mL de milieu frais de LB avec l’antibiotique correspondant et incuber à 37 ° C pendant la nuit, avec agitation à 250 tr/min. Extraire les plasmides de chaque culture au jour le jour par le kit de purification de plasmide, suivant le manuel du fabricant, puis envoyer des plasmides de séquençage de l’ADN selon le protocole du fournisseur de service pour confirmer la mutation de codon d’arrêt à la position correcte.
  5. Stocker la souche avec la séquence correcte à-80 ° C en mélangeant culture nuit 1 mL et 300 µL 100 % DMSO.

2. expression de la protéine acétylée

  1. Insérer les gènes d’optimisé acetyllysyl-ARNt synthétase33 et optimisé tRNAPyl 32 dans le plasmide pTech . Placer le gène de la synthétase de tRNA sous le promoteur constitutif lpp . Placer le gène d’ARNt sous le constitutive proK promoteur34.
    1. A transformer l’expression le vecteur de34 contenant le gène muté de TAG contenant de la malate déshydrogénase et le plasmide hébergeant le système d’intégration acetyllysine optimisé, dans 25 µL décongelés compétentes d' e. coli BL21 (DE3) cellules par choc thermique à 42 ° C pendant 10 s et le lieu sur la glace pour supplémentaire 5 min.
    2. Distribuer 600 µL de médias SOC température ambiante dans le mélange, incuber à 37 ° C pendant 60 min avec agitation à 275 tr/min, propagation de 100 µL dans une assiette avec 100 µg/mL de streptomycine et 50 µg/mL chloramphénicol et incuber une nuit à 37 ° C sous agitation à 275 tr/min.
  2. Ramasser une seule colonie de la plaque et ensemencer dans 15 mL de milieu frais de LB avec 100 µg/mL de streptomycine et au chloramphénicol 50 µg/mL dans un tube de 50 mL une nuit à 37 ° C sous agitation à la vitesse de 250 tr/min. Transfert de la culture de nuit 15 mL à 300 mL de milieu frais de LB avec des antibiotiques dans un ballon jaugé de 1 L et incuber à 37 ° C sous agitation à 250 tr/min.
  3. Dissoudre acetyllysine avec de l’eau pour rendre la solution mère de 100 mM, conserver à 4 ° C. Ajouter acetyllysine de 5 mM et 20 mM nicotinamide (inhibiteurs de désacétylases) au milieux de croissance lorsque absorbance atteint 0,5 à 600 nm.
    1. La croissance de cellules pour un supplémentaire 1 h à 37 ° C, agitation à 250 tr/min, puis ajouter 0,5 mM IPTG pour l’expression de la protéine et du jour au lendemain, la croissance de cellules à 25 ° C sous agitation à 180 tr/min.
      Remarque : Les conditions d’expression peuvent besoin d’optimisation pour différentes protéines.
  4. Prélever des cellules par centrifugation à 3 000 x g à 4 ° C pendant 15 minutes, éliminer le surnageant et laver les granules des cellules avec le tampon Phosphate salin (PBS) tampon (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM). Recueillir des cellules lavées à 10 000 x g à 4 ° C pendant 5 min, jeter le surnageant et stocker les granulés de cellule à-80 ° C.

3. purification de la protéine acétylée

  1. Décongeler les granules cellulaires congelés sur la glace et remettre en suspension avec 15 mL de tampon de lyse (50 mM tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris) de pH 7.8, 300 mM NaCl, imidazole de 20 mM et 20 mM nicotinamide), 5 µL de β-mercaptoéthanol et nucléase de Benzonase 1 µL (250 unités).
  2. Briser les cellules par sonication 40kHz à 70 % de puissance de sortie avec 10 cycles de 10 s courtes rafales, suivies par intervalles de 30 s pour le refroidissement d’extrait brut de forme. Centrifugeuse brut extrait à 20 000 x g pendant 25 min à 4 ° C. Filtrer le liquide surnageant avec la membrane filtrante de 0,45 µm et introduisez dans une colonne contenant 1 mL de résine de (Ni-NTA) acide nitrilotriacétique-nickel, équilibrée avec 20 mL d’eau et 20 mL de tampon de lyse.
    Remarque : Les cellules pourraient aussi être ventilés par un détergent doux, si sonication n’est pas disponible.
  3. Laver la colonne avec 20 mL de tampon de lavage (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, imidazole de 50 mM et 20 mM nicotinamide) et éluer ensuite avec 2 mL de tampon d’élution (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, imidazole de 150 mM et 20 mM nicotinamide).
  4. Dessalement de la fraction d’élution avec dessalage tampon (25 mM Tris pH 7,8 et 10 mM NaCl) par la colonne PD-10, le manuel du constructeur. Mesurer la concentration de la protéine éluée en suivant les instructions de la réactif d’analyse de protéines Bradford. La protéine de morue dessalée est prête pour d’autres expériences.
    Remarque : Faire le stock de glycérol de 50 % de la protéine et conserver à-80 ° C pour le stockage.

4. biochimique caractérisation de la protéine acétylée

  1. Analyses de spectrométrie SDS-PAGE et la masse.
    1. Dénaturation des protéines avec le sodium dodecyl sulfate (SDS) tampon (5 µL protéine d’échantillon avec 2 µL 4 X tampon échantillon SDS) dans un tube de 2 mL à 105 ° C pendant 5 min, centrifuger le mélange à 2000 g pendant 10 s, charge sur le 4-20 % sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroph gel d’oresis (SDS-PAGE) et en se rendant à 200 V pendant 30 min.
    2. Laver le gel avec de l’eau distillée et agiter doucement pendant 5 min, en répétant le processus 3 fois. Jeter l’eau et colorent le gel avec la tache de bleu de Coomassie pendant 1 h avec agitant doucement. Hors Souillez le gel avec de l’eau distillée, agiter doucement pendant 30 min et répéter cette-tache 3 fois.
    3. Couper la bande à 33 kDa sur gel SDS-PAGE teinté bleu de Coomassie et envoyez-le vers les installations de la spectrométrie de masse ou entreprises pour confirmer que la acetyllysine a été incorporé à la position conçue.
      Remarque : Le protocole d’analyse par spectrométrie de masse a suivi la précédente expérience34.
  2. Western Blot
    1. Exécutez le gel SDS-PAGE avec le même protocole au point 4.1. Après le gel de courir, faire tremper le gel avec le tampon de transfert (25 mM Tris, glycine 192 mM, pH 8,3 et 20 % de méthanol) pendant 15 min.
    2. Activer un 0,2 µm, 7 x 8,5 cm polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane avec du méthanol pendant 1 min et rincer avec tampon de transfert avant de préparer le sandwich de transfert.
      Remarque : Le méthanol est dangereux en cas de contact avec la peau, contact avec les yeux, ingestion ou inhalation. Surexposition sévère peut entraîner la mort.
    3. Faire le sandwich de transfert de cathode à l’anode (éponge, papier filtre, SDS-PAGE gel, PVDF membrane, papier filtre et éponge). Mettez la pile dans le réservoir de transfert, à courant constant 350 mA pour 45 min.
      Remarque : Temps de transfert peut besoin d’optimisation.
    4. Laver la membrane en PVDF avec 25 mL du tampon Tris salin, 0,1 % Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1 % de Tween-20, pH 7,6) tampon pendant 5 min avec agitant doucement. Bloquer la membrane avec 5 % sérum d’albumine Bovine (BSA) dans le tampon TBST pendant 1 h à température ambiante.
    5. Incuber la membrane avec acetyllysine-anticorps conjugué HRP avec une concentration finale de 1 µg/mL dilué avec 5 % de BSA dans TBST à 4 ° C durant la nuit avec agitant doucement.
      Remarque : Pour des résultats plus rapides, cette étape peut être effectuée à température ambiante pendant 1 h. La dilution d’anticorps peut être nécessaire d’optimisation.
    6. Nettoyer la membrane avec 20 mL de tampon de TBST pendant 5 min avec agitant doucement, répéter l’étape 4 fois. Appliquer le substrat de la chimiluminescence pour la membrane en suivant les instructions du fabricant. Capter le signal avec un imageur de caméra-basée de dispositif à couplage de charge (CCD).

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Résultats

Le rendement d’acétylés protéine MDH est 15 mg / culture 1 L, tandis que celle du type sauvage MDH a été 31 mg / culture 1 L. Protéines purifiées ont été analysés par SDS-PAGE, comme illustré à la Figure 1. Le MDH sauvage a été utilisé comme un contrôle positif à34. La protéine purifiée de cellules contenant le système d’intégration acetyllysine (AcK) et le gène mutant mdh , sans accusé de réception dans les milieux de croissa...

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Discussion

La constitution génétique des acides aminés non canonique (ANAC) est basée sur la répression d’un codon affectée, principalement l’arrêt ambre codon UAG36,37,38,39, de l’ARNt chargé ncAA contenant l’anticodon correspondante. On sait le codon UAG est reconnu par la release factor-1 (RF1) chez les bactéries, et il peut également être supprimée par près de tRNA délivre-t-il des hôtes pratiqués par...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les NIH (AI119813), la mise en marche de l’Université de l’Arkansas et le prix de l’Institut de Biosciences de l’Arkansas.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bradford dosage des protéinesBio-Rad5000006Concentration en protéines
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747Tampon d’échantillon SDS
Coomassie G-250 Colorationau gel Bio-Rad1610786SDS-PAGE
4-20 % SDS-PAGE ready gelBio-Rad4561093Détermination des protéines
Ac-K-100 (HRP Conjugué)Cell Signalisation6952
Anticorps IPTGCHEM-IMPEX194Inducteur d’expression
N&epsilon ; -Acétyl-L-lysineCHEM-IMPEX5364d’acides aminés non canoniques
-10GE Healthcare 17085101Desalting
Q5 Kit de mutagénèse dirigée NEBE0554Présentation du codon stop
Cellules BL21 (DE3)NEBC2527Expression de la souche
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27106Extraction de plasmides
Résine Ni-NTAQIAGEN30210Résine de purification d’affinité
nicotinamideSigma-AldrichN3376Inhibiteur de la désacétylase
&bêta ;-MercaptoéthanolSigma-AldrichM6250Agent réducteur
BugBuster Réactif d’extraction de protéinesSigma-Aldrich70584Cellules cassantes
Benzonase nucléaseSigma-AldrichE1014DNase
ECL Western Blot SubstratThermoFisher32106Chimiluminescence
Prémélangé LB BouillonVWR97064Milieu de croissance cellulaire
Albumine sérique bovineVWR97061-416Blocage des Western Blots
Colonne de dessalage

Références

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Expansion du code g n tiqueac tylation site sp cifiqueincorporation d ac tyllysinepyrrolysyl ARNt synth tasecodon stop ambreexpression chez Escherichia colipurification de prot inesWestern blotspectrom trie de masse en tandemcellules BL21 DE3

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