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Article de méthode

Développement de protéines recombinantes pour traiter la douleur chronique

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DOI :

10.3791/57071

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11 avril 2018

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1Laboratory of Translational Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Department of Rheumatology & Clinical Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Laboratory of Neuroimmunology and Developmental Origins of Disease, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

Dans cet article

Résumé

Dans cet article nous fournir des détails pour les méthodes de production et de contrôle de la qualité d’une protéine de fusion recombinantes IL4-10. Nous montrons aussi comment tester l’efficacité de cette protéine afin de résoudre la douleur dans un modèle murin de la douleur inflammatoire.

Résumé

La douleur chronique est difficile à traiter et de nouvelles approches pour résoudre la douleur persistante sont urgent. Cytokines anti-inflammatoires sont prometteurs pour le traitement débilitantes de douleur en raison de leur capacité à réguler les interactions neuro-immunitaire aberrantes. Cependant, physiologiquement, ils travaillent en réseau de diverses cytokines, et donc leur effet thérapeutique est peut-être pas optimale lorsqu’il est utilisé comme drogue autonome. Pour contourner cette limitation, nous avons mis au point une protéine de fusion des cytokines anti-inflammatoires IL4 et IL10. Ici, nous décrivons les méthodes de production et de contrôle de la qualité de la protéine de fusion recombinantes IL4-10 et nous avons testé l’efficacité de la protéine de fusion IL4-10 afin de résoudre la douleur dans un modèle murin de la douleur inflammatoire persistante.

Introduction

La douleur chronique demeure l’un des problèmes médicaux les plus débilitantes et mal traitée du XXIe siècle, affectant > 20 % de la population adulte1,2. Cependant, les traitements pour fournir le soulagement de la douleur chronique sont souvent inefficaces ou doivent être interrompues en raison des effets secondaires graves3. Ce qui est important, actuellement médicaments disponibles seulement apporter un soulagement symptomatique, mais ne pas sensiblement modifier ou guérir la douleur chronique. Bien que la douleur chronique semble être un trouble neurologique, preuves suggère l’implication du système immunitaire dans la douleur chronique développement4,5. En outre, les approches axées sur les immunitaire pour traiter la douleur font leur apparition. Par exemple, des cytokines anti-inflammatoires empêchent la douleur en plusieurs modèles de douleur chronique6,7,8. Cependant, les cytokines anti-inflammatoires ont une demi-vie courte, en réduisant leurs effets potentiels inhibant la douleur. Par ailleurs, des cytokines anti-inflammatoires fonctionne de manière plus optimale de concert avec les autres. Pour surmonter ces limitations, nous avons fusionné récemment l’interleukine-4 de cytokines anti-inflammatoires (IL4) et l’interleukine-10 (IL10) dans une molécule. La protéine de fusion IL4-10 montre une efficacité supérieure dans l’inhibition de la douleur inflammatoire et neuropathique chronique par rapport à l' individuel cytokines9. Ici nous décrivons comment ces protéines de fusion est produit, purifié, et comment sa qualité est contrôlée.

Protéine de fusion IL4-10 est produite dans les cellules humaines par transfection transitoire des cellules HEK293-F avec un vecteur d’expression de pUPE transportant la séquence d’ADNc codant la protéine de fusion IL4-10. Les cellules HEK293-F sont choisis pour permettre une modification post-traductionnelle de la protéine, quelque chose qui ne se produit pas dans les systèmes d’expression bactérienne. Afin d’optimiser le glycane couvrant avec l’acide sialique, ADNc codant la beta-galactoside-2, 3-sialyl-transférase est incorporée dans le vecteur comme un transgène deuxième. La protéine de fusion est purifiée à l’aide de purification de protéines d’affinité de surnageant de la culture, parce qu’il est plus puissant que la purification par d’autres méthodes par exemple exclusion stérique ou l’échange d’ions chromatographie10,11. Pour purifier la protéine de fusion IL4-10, nous avons utilisé des anticorps monoclonaux en interne contre IL4. Évaluation de la pureté et la bioactivité de la protéine de fusion purifiée IL4-10 sont effectuées dans le cadre de contrôle de la qualité. La pureté des produits lots est évaluée sur Gel de Polyacrylamide de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS-PAGE) et la chromatographie d’Exclusion taille haute pression (HP-SEC). La bioactivité de la protéine de fusion IL4-10 est évaluée en mesurant sa capacité à inhiber les lipopolysaccharides (LPS)-induit la production de facteur de nécrose tumorale-alpha (TNFα) dans les cultures de sang total et en le comparant à la combinaison de l’individu cytokines.

Enfin, afin de tester la capacité des protéines de fusion IL4-10 pour inhiber la douleur chronique, nous décrivons comment la protéine de fusion peut être testée comme analgésique dans les modèles murins largement utilisé de la douleur inflammatoire persistante12,13,14 . Nous décrivons ici les méthodes d’un modèle de douleur inflammatoire. Cependant, il est important de noter que les autres modèles de la douleur peut être utilisé (par exemple, les modèles de douleur neuropathique), selon les recherches des questions qui doivent recevoir une réponse. Pour évaluer la douleur dans ces modèles, il est important d’utiliser une variété de mesures comportementales qui incluent évoquées et non évoquée par la douleur. Ici, nous avons décrit les méthodes d’évaluation des changements dans les réponses comportementales induites mécaniquement et thermiquement. Mécanique sensibilité aux stimuli inoffensifs est évaluée en utilisant le critère de Von Frey, tandis que la sensibilité thermique est évaluée au moyen de l’essai de Hargreaves. Ce qui est important, non évoquée par hyperalgésie/allodynie est mesuré par le test dynamique portant le poids. Ces mesures sont largement considérées comme des mesures de la douleur et donnent des informations importantes sur les seuils de douleur et de douleur potentielle subis par les animaux15,16,17. D’autres mesures visant à évaluer non évoquée par la douleur (par exemple, stimulation indépendante), tels que le test de préférence de place conditionnée, peut être précieuse18. Pour évaluer le potentiel de la drogue pour inhiber la douleur, nous avons effectué l’administration intrathécale de la protéine de fusion, comme avec cette voie d’administration moins dose de protéine est nécessaire pour atteindre les zones liées à la douleur et éviter les effets systémiques (côté-)19, 20.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices internationales et l’approbation préalable du Comité local d’éthique expérimentale. Sang a été obtenue auprès du Service de donneur de Mini (Mini donneur Dienst, MDD) à l’University Medical Center Utrecht (UMCU) aux Pays-Bas. La MDD a été positive approuvée par le Comité d’éthique médicale de la UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) pour le protocole numéro 07-125/v.

1. caractérisation et Production de protéines

  1. Culture cellulaire
    Remarque : Consultez la Table des matières pour le milieu de culture utilisé.
    1. Décongeler les cellules HEK293-F à 37 ° C jusqu'à ce qu’il y a un petit bouquet de glace. Transférer les cellules dégelées immédiatement dans 10 mL de milieu glacé (4 ° C) et centrifuger la suspension de cellules à température ambiante (RT) pendant 4 minutes (min) à 500 x g.
    2. Retirez le support et Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu frais à ta, suivi par centrifugation à 500 g pendant 4 min.
    3. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu à RT. ajouter la suspension cellulaire directement dans un flacon de 125 mL contenant 25 mL de milieu préchauffé (37 ° C). La culture des cellules à 37 ° C, 8 % CO2et 95 % d’humidité dans un agitateur orbital tourne à une vitesse de 125 tr/min.
    4. Repiquer les cellules deux fois par semaine. Utilisez une cellule automatisée contre (voir Table des matières) pour évaluer le nombre de cellules et de la viabilité cellulaire. Cellules viables de semences à une concentration de 3 x 105 cellules/mL dans des fioles d’Erlenmeyer. Gardez le volume total du milieu de culture à 1/5 du volume total des Erlenmeyers de culture en permanence pour maintenir l’aération optimale.
  2. Transfection
    Remarque : Repiquer les cellules de trois à quatre fois avant la transfection et transfecter eux quand la viabilité cellulaire est > 90 %. La viabilité des cellules est évaluée par un automatisé (champ électrique multi-canal) cellcounting système basé sur l’intégrité de la membrane plasmique. Voir la Table des matières pour le réactif de transfection.
    1. Centrifuger les cellules à ta pendant 4 min à 500 x g ; Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture pré chauffé (37 ° C) et diluer la suspension cellulaire à ~1.0 x 106 cellules/mL dans un volume total de 1 L. aliquote la suspension cellulaire dans 10 parties aliquotes de 100 mL en flacons Erlenmeyer de 500 mL.
    2. Diluer 1 mg de l’ADN de plasmide dans un milieu essentiel minimal 33 mL sérum réduit (MEM, voir Table des matières) en mélangeant doucement. Dans une éprouvette, diluer 1 330 µL de réactif de transfection dans MEM en mélangeant doucement. Incuber les deux solutions à ta pendant 5 min. Ajouter et mélanger l’ADN dilué dans MEM pour le réactif de transfection dans MEM et incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante.
    3. Ajouter le mélange réactif d’ADN-transfection pour les cellules (cultivés dans la section 1) ; Ajouter 6,6 mL du mélange à chaque 500 mL fiole Erlenmeyer contenant 100 mL de cellules dans un milieu de culture. Maintenir les cellules dans les conditions de culture mentionné précédemment. Récolter le surnageant de culture contenant des protéines de fusion IL4-10 sécrètent trois jours après la transfection.
    4. Déterminer la concentration de la protéine de fusion IL4-10 dans le surnageant de culture en effectuant un ELISA IL10 selon le protocole du fabricant (voir Table des matières).
      NOTE : Dans des conditions de culture optimales, la concentration de la protéine de fusion peut être devrait se situer entre 2,5 et 5 µg/mL.
  3. Purification par chromatographie d’affinité des protéines
    Remarque : La chromatographie d’affinité est réalisée à température ambiante. Cependant, toutes les fractions (fractions de surnageant, charge, traversent et élution de culture) sont conservées sur la glace lors de la procédure.
    1. Couple 10 mg d’un in-house-made anticorps monoclonal dirigé contre IL4 à 1 g de CNBr - activé Sépharose 4 b, selon le protocole du fabricant (voir Table des matières). Versez 2,5 mL de Sépharose couplés perles lentement dans la colonne chromatographique de verre (30 cm de longueur et 1,5 cm de diamètre interne, voir la Table des matières).
    2. Bloquer les autres sites de perles de fixation en passant 50 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 % d’albumine sérique Bovine par le biais de la colonne. Laver la colonne avec 25 mL de PBS (pH = 7,4) suivie de 12,5 mL de tampon Glycine 0,1 M (pH = 2,5) et 25 mL de PBS (pH = 7,4).
    3. Passez surnageant à travers la colonne 100 mL de 10 fois la culture de cellules HEK293 concentrée à un débit de 1 mL/min. laver la colonne avec 50 mL de PBS.
    4. Éluer la protéine de fusion IL4-10 liée avec 12,5 mL de tampon Glycine 0,1 M (pH = 2,5) à un débit de 1 mL/min et virées fractions de 2,5 mL. Ajouter 350 µL de tampon Tris 1 M (pH = 9) à chacune des fractions pour amener le pH à 7. Dialyser fractions neutralisées pendant la nuit contre 2 L de PBS (pH = 7,4).
      1. Utiliser de tubes de dialyse avec sec 16 mm de diamètre et un seuil de poids moléculaire de 3,5 K. STERILE filtrer les fractions dialysées utilisant des filtres jetables avec 0,45 µM de diamètre de pore. Stocker la solution stérile de la protéine du fusion IL4-10 en aliquotes à-80 ° C.
    5. Évaluer la pureté de la protéine de fusion IL4-10 éluée par teinté bleu de Coomassie 12 % gel de SDS-PAGE et HP-SEC (colonne 3 µm SEC-2000). Pour l’analyse des HP-SEC, charger 40 µL de protéine à une concentration de 1 mg/mL sur la colonne. Utiliser 100 mM tampon Phosphate de Sodium avec 150 mM de chlorure de Sodium (pH = 6,8) comme une phase mobile. Régler le débit à 1 mL/min.
    6. Déterminer la concentration de chaque lot de protéine purifiée de fusion IL4-10 par ELISA IL10 et Bicinchoninic acide Protein Assay (BCA Protein Assay Kit, voir Table des matières) selon des protocoles par le fabricant.
    7. IL10 humaine recombinante permet de créer une courbe d’étalonnage du test ELISA. Pour corriger la différence de taille entre IL10 recombinante (18 kDA) et la protéine de fusion IL4-10 (34 kDa), multipliez la concentration obtenue par un facteur de 1,8.
  4. Bioactivité de la protéine de fusion IL4-10
    Remarque : L’analyse de sang est réalisée pour chaque lot de protéine de fusion IL4-10 produit et l’activité des différents lots est comparée dans le cadre de contrôle de la qualité. L’analyse de sang est effectuée dans le sang humain frais prélevé le jour de l’essai sur des tubes héparine. Sang provenant des volontaires sains dans notre service donateur interne. Les échantillons doivent être manipulés comme les risques potentiellement biologiques.
    1. Préparer 3 voies des dilutions successives avant de la protéine de fusion IL4-10 purifiée dans un milieu RPMI (voir Table des matières) au-delà d’une concentration de la gamme 5-1 215 ng/mL.
    2. Préparer des dilutions de LPS (100 ng/mL) et de sang humain qui est diluée 4 fois dans un milieu RPMI.
    3. Pipetter les dilutions avant de la protéine de fusion IL4-10, LPS et le sang humain dans une plaque de 48 puits. Dans chaque puits, ajouter 50 protéine de fusion IL4-10 µL (concentration finale 1-243 ng/mL), 75 µL de milieu RPMI, 25 µL LPS (concentration finale 10 ng/mL) et le sang humain 100 µL (final dilué).
      Remarque : Le volume Total par puits est 250 µL.
    4. Incuber les plaques à 37 ° C, 8 % CO2et 95 % d’humidité pendant 18 h.
    5. Évaluer la concentration de TNFα dans les surnageants de culture à l’aide d’un ELISA TNFα, selon le protocole du fabricant.
    6. Calculer l’inhibition de la réponse inflammatoire de la protéine de fusion IL4-10 selon la formule : % d’inhibition = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
      NOTE : Ici A = taux TNFα dans les cultures stimulées LPS traités avec la protéine de fusion IL4-10, B = taux de TNFα dans la culture non stimulée et C = taux TNFα dans culture stimulée LPS.

2. souris modèle pour douleur inflammatoire persistante

Remarque : Il est important d’utiliser des souris mâles et femelles (C57Bl/6), parce que cela permettra l’identification des effets dépendants de sexe. En général, les souris utilisées sont entre 8 à 16 semaines. Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires, les calculs de puissance doivent être effectuées. Outils Web pour effectuer ces calculs se trouvent facilement sur internet (par exemple, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).

  1. Induction de la douleur inflammatoire chronique
    NOTE : Induire une douleur inflammatoire persistante chez la souris adulte, avec des injections intraplantaires de carraghénane ou Adjuvant complet de Freud (CFA). Les différents tests n’interfèrent pas entre eux.
    1. Préparer le carraghénane (2 % p/v) en dissolvant les λ-carraghénane (voir Table des matières) à 0,9 % NaCl en passant la solution par une aiguille de calibre 23 pour s’assurer que le carraghénane est bien dissous. Préparer une nouvelle solution directement avant l’injection est effectuée.
    2. Sinon, si le CFA est utilisé, mélanger la solution CFA correctement avant de l’injecter intraplantarly, parce que le CFA est une émulsion eau-dans-huile contenant 1 mg de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) chaleur tués et séché, huile de paraffine 0,85 mL, et 0,15 mL mannide monooléate (voir Table des matières).
      Remarque : Seringues de verre Hamilton avec pistons métalliques sont recommandés pour injecter ce composé parce que les plongeurs en caoutchouc peuvent réagir avec l’huile dans l’adjuvant.
    3. Injection intraplantaire
      1. Maintenir le composé (étapes 2.1.1 ou 2.1.2) dans la seringue à ta pendant au moins 15 minutes avant l’injection pour permettre un réglage à RT. injecter 20 µL du composé (ou dissolvant comme témoin) par voie sous-cutanée dans la patte arrière de la souris non anesthésiés à l’aide d’un calibre 30 aiguille.
      2. Insérer l’aiguille à la base de la mise en scène pouce jusqu’au talon et injecter le composé lorsque l’aiguille est insérée environ 0,5 cm. Après l’injection, rétracter lentement l’aiguille en tournant légèrement la seringue pour éviter toute fuite de solution hors du site d’injection.

3. douleur Mensurations

Remarque : Veiller à ce que les chercheurs effectuent des expériences comportementales sont aveugles pour le traitement de souris. Il est important de s’y acclimater les animaux destinés à l’environnement de test avant d’effectuer toute mesure. De préférence, la semaine avant de commencer les expériences, animaux est placées 1 à 2 fois pendant 15-30 min dans chacun des différents dispositifs employés pour exécuter les tests. Lors de la manipulation des mâles et des femelles dans la même expérience, évaluer les hommes indépendamment de femelles. Cages propres et surfaces largement entre les différents groupes pour éviter d’éventuels effets indésirables sur le comportement des différents sexes. Mesurer les latences de retrait planifié ou seuils mécaniques deux à trois fois avec précision de déterminer les seuils de référence et déterminer si ceux-ci sont stables avant l’injection intraplantaire de tous les composés.

  1. Test de von Frey : sensibilité mécanique aux stimuli inoffensifs
    1. Placez les animaux individuellement dans des cages acryliques sur un support de maille de fil et laisser les souris s’acclimater pendant au moins 15 minutes avant la mesure.
    2. Évaluer la sensibilité mécanique en mesurant le seuil de retrait de patte en réponse à une série calibrée de poils von Frey allant de 0,02 à 4 g. envisager tout mouvement de la patte des cheveux appliquée comme une réponse positive de retrait. Appliquer les filaments perpendiculairement à la surface de la patte avec une force suffisante pour provoquer une flexion légère sur la peau pendant ~ 3 s. Assurez-vous bien sûr les cheveux tournez pas lors de l’application à la patte.
    3. Calculer le seuil de patte-retrait de 50 % à l’aide de la méthode va-et-vient15,21.
      Remarque : Le premier filament à appliquer est de 0,4 g (les autres filaments de départ peuvent être utilisés selon les seuils de ces souris affichent au départ). Une absence de réponse à un filament indique que le filament épais suivant est utilisé dans l’après la stimulation, tandis qu’une réponse positive indique l’utilisation du prochain plus mince filament. Le nombre de présentations des cheveux est déterminé par la première réponse différentielle ; Après cela, plus de 5 demandes sont effectuées. Calculer que le seuil de 50 % selon les méthodes décrites précédemment15,21.
  2. Sensibilité thermique : test de Hargreaves
    1. Placer les animaux dans des cages sur une plaque de verre préalablement chauffée (30 ° C) et laisser les souris s’acclimater pendant au moins 15 minutes avant les mesures, d’attendre que les animaux s’asseoir encore.
    2. Déterminer les temps de latence pour le retrait thermique en chauffant la patte des animaux par un faisceau concentré de lumière visible à l’aide d’un appareil de Hargreaves (voir Table des matières).
      Remarque : L’intensité du faisceau est fixée à 12 %, car ce paramètre intensité déterminées expérimentalement, le faisceau lumineux évoque une réponse de retrait d’une durée moyenne de 8 s au départ sur des souris C57Bl/6. Le réglage de l’intensité doit être déterminé par la machine individuelle et la souche de souris. Temps de coupure maximal de 20 s ou plus sont utilisés pour éviter toute blessure aux animaux.
    3. Mesurer les temps de latence de retrait ~ 4 fois par animal. Moyenne de toutes les réponses mesurées. Mesurer chaque patte indépendamment et avec au moins 1 min d’intervalle entre les mesures ultérieures de la même patte.
  3. Les déficits posturaux : test de roulement de poids dynamique
    1. Mesurer le poids de chaque animal avant l’essai, car poids portant analyse nécessite le poids de chaque animal comme paramètre d’entrée.
    2. Placer les animaux individuellement dans un système de poids-roulement en dynamique d’instrumentation sol assemblé sur un couvercle supportant une caméra qui enregistre les mouvements de souris. Laisser l’animal s’acclimater pendant 0,5 à 1 min avant l’enregistrement pendant 5 min.
      Remarque : Dans cet essai, seul animal librement mobile peut être évalué à la fois.
    3. Effectuez les réglages pour effectuer le roulement de poids et d’analyser les données.
      Remarque : Dans ces expériences, nous utilisons les paramètres suivants : seuil de poids (i) faible de 0,6 g : c’est le poids minimum nécessaire d’activer une des cellules du capteur. (ii) seuil haut poids de 1 g : ce chiffre indique le poids nécessaire pour activer complètement une seule cellule. (iii) la surface seuil de 2 cellules : ce chiffre indique le nombre de cellules adjacentes à l’autre qui a besoin d’être activé pour être pris en considération. (iv) le nombre d’images est 5 : il faut 0,1 s pour capturer chaque image. Le nombre indique le nombre minimal d’images dans lequel la souris ne bouge pas. Par conséquent, une valeur de 5 signifie que la souris posture doit être stable pour > 0,5 s pour obtenir une mesure qui est prise en compte pour l’analyse.
    4. Effectuer l’analyse de chaque vidéo en relisant la vidéo et faire en sorte que chaque membre est reconnu correctement par le logiciel dans les délais indiqués par le logiciel.
      NOTE : Un minimum de 1 min du temps enregistré doit être validé. La masse dynamique portant le logiciel calcule et fournit les paramètres suivants : (i) le poids supporté par chaque patte individuel en grammes et en pourcentage du poids du corps entier. (ii) le poids supporté par la combiné patte avant ou arrière combiné les pattes en grammes et en pourcentage du poids du corps entier. (iii) le rapport entre la droite/gauche pattes roulement de poids ou avant/arrière roulement de poids. (iv) la superficie de chaque patte ou des pattes avant/arrière combinés qui a activé le tampon de pression sensible. (v) moyenne et écart-type pour chaque paramètre. (vi) la durée des différentes postures (élevage, 3 pattes ou 4 pattes) pendant l’expérience entière. (vii) heure (s) de chaque patte a poids pendant l’expérience entière.

4. protéine de fusion intrathécale Injection IL4-10 pour l’analgésie

NOTE : Confirmer que la ventilation de la salle est ouverte pour assurer un débit d’air appropriée. Pour tester l’efficacité de la protéine de fusion IL4-10 (1 µg/souris ; 5 µL injection total volume), il devrait être testé contre les injections de véhicule et des injections de la combinaison des cytokines individuels (IL10, 0,5 µg, IL4 + 0,5 µg/souris, volume de fonds totale de 5 µL).

  1. Anesthésier la souris à l’isoflurane 3-4 % avec un débit d’oxygène de 2 L/min dans la chambre de l’induction. Vérifiez que la souris est correctement anesthésiée en pinçant la patte pour s’assurer que l’animal n’est pas recevable.
  2. Place la souris sur la table avec sa tête placé dans le cône de nez de l’appareil et de maintenir la sédation de souris à l’isoflurane de 1,5 à 2 % avec un débit d’oxygène de 2 L/min, tout en effectuant l’injection intrathécale.
  3. Remblayer les composés injectables dans un verre propre 25 µL seringue Hamilton relié à une aiguille de calibre 27.
  4. Maintenez la souris fermement par la colonne vertébrale postérieure aux nervures et soulevez légèrement la souris. Placez l’aiguille verticalement entre la vertèbre lombaire L5 et L6 et insérez-la délicatement à travers la peau dès le milieu des vertèbres lombaires. Placer l’aiguille dans l’espace intervertébral.
    NOTE : Trouver l’espace intervertébral peut exiger certains « recherche » de déplacer l’aiguille le long de l’axe ventrale rostral, en pressant légèrement l’aiguille jusqu'à ce qu’une perte de résistance du tissu osseux se fait sentir.
    1. Confirmer un ciblage correct en vérifiant qu’un coup de queue s’est produite. Injecter lentement les 5 µL du composé, attendre quelques secondes et puis rétracter lentement l’aiguille. Si seulement un coup de patte unique est observé, l’aiguille est probablement ne pas correctement placée.
  5. Après l’injection, vérifier la souris étroitement pendant les 30 premières minutes après de l’anesthésie pour s’assurer de l’absence de toute déficience moteur/paralysie.
    Remarque : Les comportements de douleur peuvent être mesurées (comme décrit dans la section 3) 15 minutes après la reprise.

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Résultats

Une image représentative d’un gel SDS-PAGE contenant différentes fractions obtenues au cours de la purification par chromatographie d’affinité est montrée dans la Figure 1A. Dans la charge (L) et le débit par le biais de fractions (FT), toutes les protéines présentes dans le surnageant HEK293 sont observées. Aucune protéine n’est observée dans la fraction de lavage (W). Dans la fraction d’élution (E), deux bandes de 35 et 37 kDa sont observée...

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Discussion

Ce manuscrit décrit des méthodes pour la production et la caractérisation d’une recombinaison protéine de fusion IL4-10 et les méthodes pour tester son efficacité pour inhiber l’hyperalgésie inflammatoire dans des modèles murins de la douleur inflammatoire persistante. La production et la purification de la protéine de fusion IL4-10 s’effectue à petite échelle. Les cellules HEK293 sont sélectionnés comme un système d’expression pour la production de protéines car elles permettent des modifications post-traductionnelles n...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Partie de ce travail a été financé par un Utrecht University Life Sciences accorder

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules FreeStyle 293-FInvitrogenR790-07Cellules rénales embryonnaires humaines.
Technologies GIBCO FreeStyle 293 Expression MediumLife12338018Milieu de culture
293fectin RéactifInvitrogen12347019Réactif de transfection
GIBCO Opti-MEM + GlutaMAXLife Technologies51985026Milieu sérique réduit pour une utilisation lors de transfections de lipides cationiques  ;
GIBCO RPMI Medium 1640 (1x)Life technologies52400-025
Cépharose activé par CNBr 4BGE Healthcare17-0430-01Milieu pré-activé pour le couplage d’anticorps ou d’autres grandes protéines
Fumée d’acide chlorhydrique 37 %  ;Merck1003171000
Chlorurede sodium SigmaS7653-1kg
Bicarbonate de sodium  ;Sigma31437
Chlorhydrate de TrizmaSigmaT3253-500GChlorhydrate TRIS  ;
Acide acétique 100 %  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;Merck1.00063.1000  ;
Glycine-HCl  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;SigmaG2879° ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
PBS  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;Pharmacie, UMCUSaline tamponnée au phosphate
10X TGSBIO-RAD161-0772Tampon Tris/Glycine/SDS pour électrophorèse SDS
Mini-PROTEAN TGX GelsBIO-RAD456-104612 % SDS gels préfabriqués
Trans-Blot Turbo Transfer PackBIO-RAD170-4157Packs de transfert Western blot
Yarra 3u SEC-2000 colonnePhenomenex
Teinture protéique InstantBlueExpedeonISB1Lprête à l’emploi Coloration protéique Coomassie pour gels de polyacrylamide
Humain IL-10 DuoSet ELISAR& DDY217B
Humain TNF&alpha ; Kit ELISADiaclone851570020
BCA Pierce Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
CarrageenanSigma-Aldrich22049mucopolysaccharide végétal
CFASigma-AldrichF5881adjuvant
Seringue Hamilton SeringueverreSigma-Aldrich20779
Enclos animalIITC Life Science433Animal Enclosure
Von Frey support en mailleIITC Life Science410Stand en maille
von Frey hairs  ;Stoelting58011test tactile sondes sensorielles
Test plantaire (méthode Hargreaves)IITC Life Science390Gtest plantaire avec verre chauffant
Test de mise en charge dynamiqueBiosebBIO-DWB-AUTO-Mtest de déficit postural
Colonnes Econo-Column en verre, 1,5 × ; 30 cmBIO-RAD7371532   ;
Tubulure de dialyse SnakeSkin  ;Thermo Scientific88242
Minisart NML Filtre à seringue  ;Sartorius16555-K unité defiltration à usage unique, 0,45 &mu ;
Compteur et analyseur de cellules M CASYRoche
vaccin en Colonne de chromatographie en verre

Références

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