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Article de méthode

Micro-dissection de l’organe de l’émail des incisives mandibulaires de Rats exposés à des substances toxiques environnementales

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DOI :

10.3791/57081

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29 mars 2018

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1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

Dans cet article

Résumé

Comprendre les émail des altérations de la formation et, éventuellement, il faut l’étude de l’activité de l’Odam. Nous décrivons ici une méthode fiable et cohérente pour micro-disséquer les organes émail contenant des améloblastes de sécrétion et de maturation des stades qui peuvent être utilisés pour les procédures expérimentales quantitatives et qualitatives.

Résumé

Anomalies de l’émail résultant de conditions environnementales et les modes de vie sont des préoccupations de santé publique en raison de leur prévalence élevée. Ces défauts résultent de l’activité altérée des cellules responsables de la synthèse d’émail nommée améloblastes, qui présentent à l’organe de l’émail. Au cours de l’Amélogenèse, améloblastes suivent une séquence spécifique et précise des événements de la prolifération, la différenciation et la mort. Un rat sans cesse croissante des incisives est un modèle expérimental pour étudier les étapes de l’activité et la différenciation Odam dans des conditions physiologiques et pathologiques. Nous décrivons ici une méthode fiable et cohérente pour micro-disséquer organe de l’émail des rats exposés à des substances toxiques environnementaux. L’épithélium dentaire micro-disséqués contiennent des améloblastes de sécrétion et de maturation des stades qui peuvent être utilisés pour des expériences qualitatifs, tels que les dosages de l’immunohistochimie et hybridation in situ , ainsi que pour les analyses quantitatives telles que RT-qPCR, RNA-seq et éponger occidental.

Introduction

Plusieurs anomalies de l’émail du développement peuvent résulter de l’exposition aux substances toxiques environnementaux et/ou de style de vie inapproprié1,2,3,4. Caractérisation de perturber les événements et les molécules d’Amélogenèse en utilisant la procédure décrite actuellement favorisera l’utilisation des anomalies de l’émail qui en résulte comme marqueurs précoces de l’exposition à plusieurs substances toxiques et peut-être aider à reconstituer l’histoire de la santé de chaque patient pendant la période périnatale, quand l’émail est synthétisée1,2. Synthèse de l’émail peut être divisée en quatre grandes étapes selon Odam activité5. La première étape regroupe la prolifération cellulaire et pré-Odam précurseur. Au cours de la deuxième étape, les améloblastes différenciées sécrètent émail protéines de la matrice (PGE), principalement amélogénine, enamelin et ameloblastin, qui détermine l’épaisseur de l’émail final. Ainsi, toute perturbation de la synthèse de l’EMP conduit à des anomalies quantitatives de l’émail. Après la déposition de l’épaisseur de l’émail complet, commence la phase de maturation. Au cours de cette étape, croissance cristallites apatite en largeur et en épaisseur permet à l’émail atteindre le plus haut ratio de minéralisation dans un tissu biologique, avec jusqu'à 96 % en poids. Défauts d’émail des événements perturbateurs qui se produisent au cours de la maturation étape conduit à qualitative. Enfin, améloblastes entrent dans une phase de maturation post, également appelée pigmentation chez les rongeurs et apoptose au cours de l’éruption de dents faisant des anomalies de l’émail (le cas échéant) irréparable et irréversible, donc défauts potentiel enregistrement rétrospective de Odam souligne. Chez les rongeurs, Amélogenèse suit une séquence d’événements avec la particularité que leurs incisives poussent en permanence, ce qui en fait un modèle approprié pour étudier le processus général d’Amélogenèse similaire. Ainsi, toute perturbation d’Amélogenèse provoque des altérations de l’émail de qualité ou quantité, selon la fenêtre de temps de l’événement qui perturbent. En ce sens, l’exposition à la dioxine, du plomb et produits chimiques perturbant le système endocrinien (SPSE) comme le bisphénol A (BPA), génistéine et vinclozoline, ont démontré que générer émail hypomineralizations1,2,3 ,6,7,8. Des taches opaques blanches asymétriques ont été identifiés sur les incisives des rats exposés à une dose BPA de faibles doses pendant la période fœtale et le premier mois après la naissance1. Ces anomalies de l’émail chez les rats et celles des incisives molaire humaine hypomineralization (MIH), partagent des caractéristiques cliniques, structurales et biochimiques semblables. MIH est une pathologie décrite récemment l’émail dentaire, dont l’étiologie demeure encore peu clair9,,10 , malgré les nombreux facteurs de causalité ayant émis l’hypothèse9,10,11 ,,12.

Une autre pathologie de hypominéralisation émail important en raison de facteurs environnementaux est la fluorose dentaire (DF), qui est la conséquence d’une absorption excessive de fluorure (> 0,1 mg/kg/jour)13,14. La principale source de fluor est l’eau potable qui est complétée ou naturellement enrichie en fluor. Le fluorure est également souvent prescrit pour prévenir la carie dentaire, mais la dose prophylactique n’est que 50 % plus bas que le toxique un (≤ 0,05 mg/kg/jour). MIH et DF, deux pathologies fréquentes résultant de l’exposition à des facteurs environnementaux peuvent présenter des caractéristiques communes qui doivent être caractérisés en raison de la potentialisation des effets de hypomineralizing de fluorure combinée avec d’autres substances toxiques telles que le CDE2 ou amoxicilline15.

Micro-dissection de l’organe de l’émail rat contenant les améloblastes à des stades différents de la différenciation vous aidera à comprendre le mécanisme d’action des molécules capables de perturber l’activité Odam et causer des anomalies de l’émail d’être diagnostiqués après l’éruption de la dent. En d’autres termes, la caractérisation des modifications d’émail gene expression et émail composition de la matrice en raison des substances toxiques environnementales permet la reconstitution de l’histoire de l’exposition aux substances toxiques et facilite le contrôle de la sécurité environnementale pour le public santé.

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Protocole

Tous les animaux utilisés dans la présente étude ont été maintenues conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Ministère Français de l’Agriculture (A-75-06-12).

1. animale exposition aux substances toxiques

  1. Avant d’effectuer ce protocole, obtenir l’approbation institutionnelle nécessaire et s’assurer de se conformer à toutes les directives de protection des animaux.
  2. S’appliquent à la conception du protocole de recherche permettant la constitution de différents groupes expérimentaux afin de tester l’impact de la molécules étudiées sur la phase de sécrétion Odam et la phase de maturation Odam. Ici, quatre groupes de rats Wistar mâles ont été constitués selon leur exposition au fluorure (NaF) en combinaison ou non avec BPA (Figure 1 a)2. Tous les animaux ont été observées et disséquées jour 65 (Figure 1 b).

2. dissection de Hemi-mandibules des Rats adultes

  1. Euthanasier des rats de CO2 asphyxie, éventuellement suivi par décapitation à la tête séparée du reste du corps. Exposer des rats à CO2 pendant 5 min dans une zone dédiée à16.
  2. Retirez toute la peau de la lèvre inférieure à l’aide d’un scalpel #11 afin d’obtenir un accès facile pour les incisives inférieures.
  3. Avec le scalpel même, faites une incision entre les deux incisives inférieures avec une légère pression et la mandibule sera divisée en deux moitiés.
  4. Couper l’articulation mandibulaire temporale avec un scalpel pour détacher la mâchoire et tenir l’hémi-mandibule avec pince fine.
  5. Couper les tissus mous environnants avec un scalpel et enlever tous les muscles, tendons et ligaments à l’aide d’un racloir jusqu'à ce que l’OS est parfaitement propre.

3. isolement des incisives17,18

  1. Raser avec soin l’OS en plaçant la lame parallèle à l’axe longitudinal majeur de l’incisive. Commencez à la crête osseuse près les conseils de l’incisive (extrémité proximale) jusqu'à la fin de l’incisive près de la boucle du col utérin. La motion de l’incision part de proximale à la direction distale.
  2. Faites une première coupe distale à la boucle du col avec le scalpel pour enlever la gonion de l’hémi-mandibule et permettre de décoller de l’incisive facilement sans endommager la boucle col de l’utérus ou le stade sécrétoire des améloblastes (ligne rouge dans la Figure 2).
  3. Faire une deuxième coupe au-dessous de la deuxième molaire et insérez le scalpel entre l’os et la surface médiale de l’incisive. Lorsque tout l’OS basal est levée, faire pivoter vers l’extérieur l’incisive et enlevez-le soigneusement pour éviter l’émail organe tissu porter atteinte à l’aide de pinces fines.

4. micro-Dissection de l’organe de l’émail sous lentille binoculaire

  1. Déposer 200 µL de tampon Phosphate salin (PBS 1 X) sur l’incisive à l’aide d’une pipette. Prendre l’incisive avec pince fine avec la face labiale vers le haut. Faire un scalpel marque entre l’incolore et les parties orange du tissu. Cette note correspond à la tache blanche sous-jacente qui est observable par la suite (Figure 2).
  2. Gratter, avec une pelle ou un outil équivalent, la surface de la cellule de la marque de scalpel à l’extrémité apicale correspondant à sécrétion améloblastes de scène (incolore) et de la marque de bistouri Swann-Morton à la pointe de l’incisive pour les améloblastes de phase (orange) de maturation.
  3. Enlever le tissu de 2 mm, correspondant à la phase de transition, comme précédemment décrit19. Ne pas ouvrir l’incisive au cours de la dissection orgue émail pour éviter la contamination par le mésenchyme.
  4. Couper la boucle col de l’utérus située immédiatement à la partie apicale de l’incisive (Figure 2) tel que décrit précédemment20.
  5. Ramasser en solution à 10 % de formol ou lyse pour complément d’enquête (voir Table des matières).

5. collection de tissus organes séparés émail pour d’autres recherches

  1. Déposer 200 µL de tampon PBS 1 X sur l’incisive.
  2. Avec une lame de bistouri #11, soigneusement détacher les cellules épithéliales dentaires progressivement dans la mémoire tampon, séparément pour chaque étape avec l’aide de la marque de bistouri faite précédemment.
  3. Pour cellule RNA et extractions de protéine, mettre le tissu dans une solution de lyse qui permet l’extraction de protéines et ARN (voir Table des matières).
    NOTE : Préparez RNAs de haute qualité en tournant la tissu-pelle dans le tube et ensuite ponçage les cellules jusqu'à l’obtention d’un mélange homogène. Le mélange est prêt pour des extractions ARN et des protéines selon la procédure par le fabricant, qui a été précédemment décrit2,8,17. Habituellement, environ 5-10 µg au total RNAs et 150 µg de protéines totales ont été obtenus pour chaque préparation.
  4. Pour les analyses histologiques, immunohistochimie et hybridation in situ (ISH), mettent la couche de cellules dans 10 % de formol pendant 2 h, puis conserver à 4 ° C dans du PBS 1 X. Les tissus peuvent ensuite être incorporés dans cire/paraffine ou tissu OCT pour coupes congelées.
  5. Pour les extractions EMP, prendre l’incisive avec pince fine. Après une courte exposition à l’air (déshydratation légère), une tache blanche sera visible autour de la partie médiane de la face labiale de l’incisive, qui représente l’initiation de la minéralisation de l’émail. Cette tache blanche correspond à la transition- / tôt-la phase de maturation des améloblastes, donc l’utiliser comme indicateur pour l’extraction de PGE21.

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Résultats

Plusieurs émail défauts, tels que la fluorose dentaire12,13, peut résulter de conditions environnementales en raison de l’absorption excessive de fluorure ou d’un émail hypominéralisation semblable au MIH dus à l’exposition à des perturbateurs endocriniens1, 7,,22. Ces anomalies de l’émail du développement peuvent être reproduits expérim...

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Discussion

Odam altérée activité et/ou perturbé Odam prolifération, différenciation et maturation processus responsable d’anomalies de l’émail irréversible et, par conséquent, la caractérisation des anomalies de l’émail peut aider à développer la compréhension de l’altération Odam activité pendant Amélogenèse. Ainsi, les études sur l’organe de l’émail isolés sont déterminants pour élucider les événements pathologiques conduisant à l’émail défauts quels que soient leur origine, environnemental ou génétique.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par l’Université Paris-Diderot, l’Institut National Français de la santé et la recherche médicale (INSERM) et l’Institut Français pour la recherche odontologique (IFRO).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bisphénol ASigma Aldrich, Saint Louis MO239658
formol 10 %Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOHT5012
Tri-RéactifEuromedex, FranceTR118
RLT tamponQiagen, Les Ulis, France74126RNeasy Protect Mini Kit
Anticorps anti-récepteur des androgènesSanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)sc-816anticorps polyclonal de lapin
PBS 10xEUOMEDEXET330. A
Fluorure de sodium (NaF)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOS-1504
paraplast régulierLeica microsystems, Nanterre cedex,  ; France39601006appelé was/paraffine dans le tissu de texte
OCTVWR, Fontenay-sous-Bois, France411243
Ciseaux de Bonn extra fins - Droits/8,5 cmPHYMEP , Paris, France14084-08
Manche pour lames de scalpel - 12,5 cmPHYMEP, Paris, France10035-12
Lame de bistouri incurvéePHYMEP , Paris, France10035-20
Couteau à dissectionner - Pointe fine/droitePHYMEP , Paris, France10055-12
Couteau circulairePHYMEP, Paris, France10059-15
lames de scalpel n° ; 11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, France233-0024
lentille binoculaireLeica biosystems, Nanterre cedex,  ; FranceMZFLIII

Références

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