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Mise en culture des cellules épithéliales pigmentaire sur un modèle Ex Vivo de la Membrane de Bruch humain âgé

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DOI :

10.3791/57084

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12 avril 2018

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1Department of Ophthalmology and Visual Science, Yale School of Medicine, 2Edward S. Harkness Eye Institute, Columbia University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Le but du présent protocole est de démontrer la mise en culture de cellules épithéliales de (RPE) pigmentaire sur âgées et/ou malades humains la membrane de Bruch. Cette méthode convient à étudier le comportement de cellules RPE sur une matrice extracellulaire compromise.

Résumé

Mis à part des vitamines et des antioxydants recommandés par la main-d'œuvre Eye Disease Study, il n’y a pas de traitement efficace pour « sec » ou atrophique âge dégénérescence maculaire (DMLA) qui représente 90 % des cas. Traitements sont nécessaires pour ralentir ou retarder le développement de l’atrophie géographique (GA), et comprendre la pathologie de membrane de Bruch fait partie de ce processus. Altérations de la membrane de Bruch humain précèdent la progression de la DMLA en contribuant aux dommages de l’épithélium pigmentaire (RPE) des cellules. Compte tenu de l’absence de modèles animaux suffisantes pour étudier les AMD, modèles ex vivo de la membrane de Bruch humain âgé servent comme un outil utile pour étudier le comportement des cellules RPE d’immortalisé et lignées cellulaires primaires ainsi que les lignes RPE issu de souches pluripotentes induites cellules (CISP). Nous présentons ici une méthode détaillée qui permet de déterminer les effets du comportement de cellules RPE ensemencées sur explants de membrane de Bruch humain récoltés de donneurs humains, y compris la fixation, l’apoptose et la prolifération, capacité à phagocyter les photorécepteurs externe segments, mise en place de la polarité et l’expression des gènes. Cet essai fournit un modèle ex vivo de la membrane de Bruch âgés afin d’évaluer les caractéristiques fonctionnelles des cellules RPE lorsqu’ensemencées sur personnes âgées/compromise de la matrice extracellulaire.

Introduction

Changements structurels liés à l’âge de la membrane de Bruch humain, qui est causée par plusieurs facteurs, y compris nitrosative et le stress oxydatif, exerce de multiples effets délétères sur la fonction du pigment rétinien épithélial (RPE) des cellules et contribue à la pathologie de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Lors de l’examen cellulaire substitutive pour la DMLA atrophique avancée ou atrophie géographique, traitement nécessitera probablement la transplantation de cellules sur un lit de l’atrophie des cellules RPE. Liée à l’âge des changements au sein de la membrane de Bruch humaine peuvent nuire à la réussite des greffes de cellules RPE transplantés, étant donné les dommages à la matrice extracellulaire6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. homme recherche biologie de la membrane de Bruch et comment les changements structurels au sein de la matrice contribuant à la progression d’AMD est essentiel à la compréhension de la maladie. Ainsi, il y a un besoin essentiel pour les chercheurs dans le domaine de le œil liée à l’âge de développer des protocoles qui décrivent la récolte ex vivo d’âgées et/ou malades humains la membrane de Bruch.

Historiquement, il a été difficile de troubles liées à l’âge de modèle comme atrophie géographique et la membrane d’un Bruch humain âgé dans animaux23. Cette difficulté résulte de plusieurs facteurs, y compris la longévité des humains par rapport aux rongeurs et autres espèces fréquemment utilisé pour la modélisation de la maladie, ainsi que l’absence d’une macule dans la plupart vertébrés24. L’avantage de la méthode décrite ici est que les cellules peuvent être testés directement sur la membrane de Bruch extraite de post mortem yeux de personnes âgées ou malades. L’objectif général du présent article est de fournir une méthodologie détaillée pour un modèle ex vivo d’âgées et/ou malades humains la membrane de Bruch, y compris l’isolement des humain Bruch membrane explants provenant de donneurs humains et l’ensemencement de RPE des cellules pour expériences en aval. Ce modèle peut servir comme un modèle pertinent pour étudier la contribution d’endommagement de la matrice extracellulaire le RPE cellule fonction et pathologie20,25,26,27,28.

Protocole

Le protocole suivant est exécuté conformément aux principes de la déclaration d’Helsinki et aux directives de la Yale University Human Research Ethics Committee.

1. sourcing donneur humain yeux

  1. Obtenir des globes de donneur humain de la National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphie, PA). Selon le projet, préparer pas moins de trois paires d’yeux de donneur pour chaque groupe expérimental.
  2. Enucleate yeux de donateurs au sein de 10 h et le navire dans les 48 h post-mortem. Puis transporter les yeux au laboratoire dans mis à jour le Eagle moyen (DMEM) milieu de culture de stériles Dulbecco sur la glace. Études ont démontré antérieurement qu’yeux des bailleurs de fonds récoltés et transportés dans ce mode conserve les caractéristiques biologiques et les activités de la membrane de Bruch25,26,29.

2. la cueillette de la Membrane de Bruch humain des Explants

  1. Place chaque œil sur une gaze de 1,5 x 1,5 pouces imbibé de médias DMEM indépendant du dioxyde de carbone dans une boîte de Petri de 100 mm, utilisation fine lame ciseaux et faire une incision à travers la sclère 3 mm postérieur à la limbe et sur sa circonférence s’étendant dans les deux sens.
  2. Faire un incision circonférentielle de pleine épaisseur (pénétrer dans le corps vitré) 1 mm postérieur à l' ora serrata. Retirer et jeter le segment antérieur (cornée, lentilles et iris), le corps vitré et la rétine.
  3. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire quatre incisions radiales entre la sclérotique et la choroïde et ensuite décoller la sclérotique de la périphérie vers le nerf optique, tout en prenant soin d’éviter le déchirement de la membrane de Bruch/choroïde complexes.
  4. Ensuite, faire une incision circonférentielle à travers l’espace suprachoroidal le long de l' ora serrata et peler complexe membranaire-choroïde de la RPE-Bruch postérieure de la sclérotique.
  5. Supprimer des cellules RPE natives en baignant l’explant avec de l’hydroxyde d’ammonium 0,02 M en tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD) dans un polystyrène de 60 x 15 mm boîte de Pétri pendant 20 min à température ambiante, il lavée trois fois au SPD (Figure 1).
  6. Flotteur explant complexe de membrane de Bruch dans des milieux sans dioxyde de carbone sur une membrane de 65 µm d’épaisseur polytétrafluoroéthylène non stratifiés, hydrophobe avec 0,2 µm pores, avec la couche de la couche basale de chaque explant face à la membrane.
  7. Placer une membrane de polytétrafluoroéthylène avec explant de membrane de Bruch sur un support de verre fritté dans un système de porte-filtre vide de microanalyse de verre.
  8. Aplatir les bords ondulés du côté choroïdienne avec une pince fine recouverte de téflon, prenant soin de ne pas pour la toucher de la Bruch membrane basale laminine.
  9. Faire chauffer 15 mL de gel d’agarose (4 % au SPD) et puis refroidir à 37 ° C. Puis versez 15 mL de gel liquidized sur complexe choroïde-membrane de Bruch depuis le côté choroïdienne tout en appliquant une légère succion pour garantir que l’explant ne reste plat. Maintenir le tissu à 4 ° C pendant 2-3 min solidifier l’agarose et peler puis la membrane de polytétrafluoroéthylène loin.
  10. Placer explant de membrane de Bruch (1,5 pouces de diamètre, au sein de gel d’agarose solidifiée) dans un 60 x 15 mm en polystyrène cell culture plat (avec la membrane de Bruch vers le haut) qui a été bordée d’une agarose liquide chaude sur le fond du plat pour fixer la membrane de Bruch explantation sur le fond du puits avec l’explant laminine basale couche vers le haut.
  11. L’agarose consolidera dans 2-3 min à température ambiante pour stabiliser les explants de membrane de Bruch dans la boîte de Pétri. Couverture dans la culture des explants de la membrane de Bruch plat avec SPD et stocker le plat à 4 ° C pour une utilisation future. Figure 2 a montre que la membrane de Bruch l’isolé des explants dans une boîte de Petri de 60 x 15 mm.
  12. Si le système de culture souhaité est une plaque à 96 puits, placer explant de membrane de Bruch (1,5 pouces de diamètre, avec le gel d’agarose solidifiée) sur une feuille de téflon plane avec la laminine-face vers le haut.
  13. À l’aide d’un trépan, coupez cinq ou six, 6 boutons mm-circulaire de la membrane de Bruch complexe explant et placer chacun sur 4 % d’agarose à 37 ° C dans un polystyrène non traitées bien d’une plaque de 96 puits. L’agarose consolidera dans 2-3 min à température ambiante pour fixer des explants de membrane de Bruch (boutons) en bas de chaque puits.
    Remarque : La Figure 2 b montre boutons à membrane de Bruch trephined dans une plaque à 96 puits. En général, 9-11 boutons ou des explants peuvent être récoltées de chaque œil.

3. mise en culture des cellules épithéliales (RPE) pigmentaire sur la Membrane de Bruch humain des Explants

  1. Dès réception des yeux donneur, nettoyer les tissus extra-oculaires avec le SPD. Faire une incision circonférentielle 5 mm au-dessous de la sclère-iris touch point (pars plana) dans l’espace sous-rétinienne. Jeter le segment antérieur, le vitré et la rétine.
  2. Laver le œilleton, qui contient de la Bruch membrane et feuille de RPE, avec SPD froid. Dissocier les cellules RPE avec 5 mL de 0,25 % de trypsine pour pas plus de 10 min pour chaque échantillon de le œil. Étancher la réaction de la trypsine 25 ml de milieu DMEM complet 15 % sérum bovin fœtal (SVF) chauffé à 37 ° C dans un tube de 50 mL.
  3. Centrifuger les cellules à 200 × g pendant 10 min à 24 ° C et Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu complet DMEM (avec 15 % FBS).
  4. Compter les cellules et 15 000 cellules viables de RPE sur la lame basale membrane de chaque Bruch ans divers explants de (boutons) dans une plaque de 96 puits dans 200 µL de médias essentielles minimales sans sérum (MEM) contenant des antibiotiques de graines (100 UI/mL de pénicilline G, 100 mg / mL de streptomycine, gentamicine 5 mg/mL et 2,5 mg/mL amphotéricine B). En supposant un diamètre cellulaire de 20 µm, plaquant à cette densité permettra aux cellules RPE à couvrir environ 15 % de la surface de placage.
  5. Plaque des cellules vers le bouton, auquel cas la densité cellulaire puis peutêtre progressivement vers le haut jusqu'à confluence 100 % selon l’effet de chaque paramètre sur le comportement de la cellule.
  6. Permettre les cellules attacher à l’explant pendant 24 h dans une atmosphère humidifiée de 95 % air/5% CO2 à 37 ° C. Doucement changer de milieu DMEM complet chaud.

Résultats

Lorsque ce protocole est effectué correctement, on peut déterminer les effets d’âgées et/ou malades humains la membrane de Bruch sur la fonction des cellules RPE par la mise en place de la polarité et la barrière rétinienne externe sang, sécrétion polarisée de facteurs de croissance et cytokines, et de la phagocytose des segments externes de photorécepteur tige.

Nous avons généré des données qui montrent un phénotype de la maladie sur la membrane de Bruch humain âgé. Par exemple, mise en culture sur cellules RPE de rattachement de cellule pre pour explants de membrane de Bruch humain diminue (Figure 3). Les cellules RPE cultivés sur la membrane de Bruch humain âgé diminue la capacité de ces cellules à phagocyter les segments externes de tige (ROS), une fonction critique de la RPE (Figure 4). En outre, les cellules apoptotiques peuvent être identifiés et comparés ces explants de bouton à l’aide d’une tache de (TUNEL) marquage transférase dUTP nick terminale de deoxynucleotidyl tel que décrit dans les précédents travaux26. Les effets d’un âgées et/ou malades humains la membrane de Bruch sur profil d’expression génique RPE cellulaire peuvent être déterminées à l’aide de la technologie des puces. Nous avons démontré que l’expression des gènes cellulaires RPE est modifiée lorsqu’il est cultivé sur la membrane de Bruch humain des individus plus âgés par rapport à des explants de jeunes individus (Figure 5)27. Pour l’analyse statistique, explants provenant de donneurs humains au moins 3 à 5 sont utilisés par le groupe.

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Figure 1. Représentation schématique de l’isolement de la membrane de Bruch humain des yeux donneur. Membranes de Bruch humain sont récoltés en enlevant la sclère, rétine, segment antérieur, vitré, et native retinal pigment cellules épithéliales (RPE). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 2. Isolé de membrane de Bruch humain (BM) dans une boîte de Pétri. (A) schéma d’explants de membrane de Bruch humaine (chaque 1,5 pouces de diamètre, avec le gel d’agarose solidifiée) placé dans un 60 × 15 mm cellule polystyrène boîte de Petri (BM face vers le haut) rempli d’une agarose liquide chaude sur le fond du plat. Explant de membrane de Bruch un humain (B) qui a été trephined dans quelques boutons circulaire 6 mm (explants), chaque OE qui a été ensuite placé sur 4 % d’agarose à 37 ° C dans un polystyrène non traitées bien d’une plaque de 96 puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 3. Taux de rattachement sur les jeunes et plus humaine de la membrane de Bruch (BM) de cellules épithélium rétinien pigmentaire (RPE). Des cellules primaires de RPE ont été ensemencés sur l’homme, la membrane de Bruch explants provenant de jeunes (< 50-year-old, n = 3) ou plus âgés (> 70 ans, n = 5) yeux donneur pendant trois semaines. Taux d’attachement cellulaire a été mesurée par analyse de viabilité de cellules MTT. Membranes de Bruch humain plus réduit le taux d’attachement cellulaire RPE de 24 % (jeune BM 100 +/-8,54 S.E. vs anciennes BM 76,65 +/-1,44 S.E.). p < 0,05, S.E. = écart-type.

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Figure 4. La phagocytose (RPE) de cellule épithéliale pigmentaire rétinien est affectée par l’âge de la membrane de Bruch de l’humain (BM). Des cellules primaires de RPE cultivés sur l’homme plus âgé la membrane de Bruch explants avaient une capacité réduite à phagocyter les segments externes de tige (ROS) (jeune BM 873 +/-9.3 S.E., n = 5 vs anciennes BM 608 +/-25,4 S.E., n = 5). p < 0,01, S.E. = écart-type.

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Figure 5. Nombre de rétinal pigment epithelial gènes de cellule (RPE) exprimées dans tous les échantillons cultivés sur jeunes ou de la membrane de Bruch humain plus âgés des explants. Il y avait des nuages de points plus le nombre de gènes exprimés dans des cellules primaires de RPE ensemencées sur plus âgés par rapport à la membrane de Bruch humain jeune (6201 ± 388 6439 ± 80, respectivement) ; cinq des explants ont été testées pour chaque groupe d’âge. Présenté avec l’autorisation complète de tous les auteurs de la Cai, H et al. 27. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Membrane de Bruch humain âgé (matrice extracellulaire) contribue à la progression de la maladie de la DMLA et donc il est nécessaire de comprendre comment cette matrice altérée contribue à la dysfonction des cellules RPE. Compte tenu de l’absence de modèles animaux suffisantes pour étudier les changements liés à l’âge de AMD, ex vivo le systèmes de modèles qui simulent les effets de la maladie peut servir comme un outil précieux pour comprendre la physiopathologie. La méthode décrite dans ce manuscrit peut être utilisée pour isoler systématiquement humaine explants de la membrane de Bruch et RPE de la culture de cellules, y compris les lignées de cellules RPE primaires, immortalisées ou cellules souches dérivées.

Tel que mentionné précédemment, les explants de membrane de Bruch humain proviennent de la NDRI. Un protocole est établi avec NDRI qui spécifie les critères fixés pour les yeux de donneur être acceptable. Par exemple, les donateurs ne doivent avoir aucune maladie connue rétine, yeux/globes sont récupérées dans les 10 h après la mort et globes arrivent au laboratoire dans les 48 h après la mort (via une livraison de paquet sur glace). Indiquez la tranche d’âge approprié et le nombre d’yeux nécessaires pour l’analyse statistique de l’étude, par exemple., cinq paires de globes de donneurs âgés de 20 à 49 ans à cinq paires de globe de donneurs âgés de 50 à 89 ans.

La disponibilité des globes oculaires varie, généralement en moyenne dix paires de globes disponibles chaque mois. Le paquet d’oeil arrive avec des informations de base, dépersonnalisées donneur : l’âge, la race, le moment de son décès, son décès et brève des antécédents médicaux (liste de maladies ou affections concomitantes).

Plus important encore, récolte des explants de membrane de Bruch humain nécessite l’enlèvement du segment antérieur de le œil et le corps vitré, permettant l’isolement du complexe membranaire-choroïde de la RPE-Bruch. Une fois que la membrane de Bruch est isolée, cellules RPE peuvent être ensemencées sur les explants acellulaires à diverses concentrations et cultivés pour des expériences en aval. La préparation et le traitement procédural tel que décrit ci-dessus est critique, en faisant attention à l’orientation de la membrane de Bruch l’isolé pour s’assurer que la surface alvéolaire est orienté en place alors que vous touchez ne pas la surface mécaniquement pour éviter d’endommager le structure de surface de la matrice extracellulaire.

Il convient également de noter que lors de l’utilisation de systèmes d’explant de membrane de Bruch, il y a quelques variables qui pourraient affecter les résultats des expériences en aval comme arrière-plan génomiques de donateurs individuels, âge de la membrane de Bruch, ou post-mortem de la Bruch membrane et l’emplacement de la membrane de Bruch, i.e., central ou périphérique fait partie des explants de membrane de Bruch. Comme pour toute autre étude de tissus humains, on doit recruter le nombre d’échantillon œil donneur approprié pour avoir la puissance statistique nécessaire et correspondre l’âge oculaire de donateurs le cas échéant. Établissant des critères stricts pour accepter les yeux des rives de le œil est un paramètre essentiel. N’acceptent que les yeux qui sont énucléé post-mortem de moins de 10 h et préparation de membrane de Bruch peut être récoltée sous 24-48 h après la mort. Le site du nerf optique peut être utilisé comme marqueur pour l’orientation et utiliser les mêmes emplacements pour expérimental et le groupe d’étude témoin. En prenant ces mesures, on peut réduire la variabilité expérimentale.

En résumé, compréhension de membrane choroïde complexe de la RPE-Bruch et comment elle est affectée par l’âge et la maladie est essentielle à la compréhension de sa contribution à la physiopathologie de la DMLA. Modéliser des systèmes qui utilisent des techniques de ex vivo constituent un outil précieux pour étudier ces effets à l’aide de tissus humains. Ici, nous décrivons une méthodologie qui emploie des explants donneur humain comme modèle pertinent ex vivo de la membrane de Bruch âgés. Cette technique permet d’utiliser âgées et/ou malades humains la membrane de Bruch comme un outil de recherche pour étudier comment les changements structurels au sein de la matrice peut affecter superposant RPE comportement cellulaire y compris la pièce jointe, la prolifération et gene expression25 , 27. mise au point de systèmes de modèles similaires ex vivo va approfondir notre compréhension de la DMLA et faciliter le développement de nouvelles options thérapeutiques.

Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs ont toute divulgations commerciales à déclarer.

Remerciements

Cette recherche est appuyée par la recherche pour prévenir la cécité, New York, www.rpbusa.org et le Greater New York Center rétiniennes dégénératives maladie Foundation Fighting Blindness, www.blindness.org. Les auteurs aimeraient remercier Luanna Bartholomew, Ph.d., pour son examen critique de ce manuscrit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Globes de donneurs humainsNational Disease Research Interchange, NDRI
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995-065
Média indépendant du dioxyde de carboneThermo Fisher Scientific18045-088
Boîte de Pétri en polystyrène de 60 mmCorning Inc.
solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco, PBSThermo Fisher Scientific14190144
Hydrophobe 65 & micro ; membrane en polytétrafluoroéthylène d’épaisseur M avec 0,2 & micro ; Pores MMerck MilliporeJGWP04700
Fisherbrand système de porte-filtre sous vide pour microanalyse en verre  ;Thermo Fisher Scientific09-753-102
AgaroseSigma-AldrichA2576-5G
35 × ; Antenne de culture 10mmVWR International25373-041
TrephineAccutomeAM0570 60
96 plaque de puitsCorning Inc.3595
Supports essentiels minimaux (MEM)  ;Thermo Fisher Scientific11095-080  ;
Pénicilline GSigma-AldrichP3032-1MU
StreptomycineSigma-AldrichS6501
GentamicineSigma-AldrichG1914
Amphotéricine BSigma-Aldrich1397-89-3
Solution d’hydroxyde d’ammoniumSigma-Aldrich1336-21-6
351007

Références

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