Procédé de repliement efficace et la Purification des chémorécepteurs Ligand Binding Domain

Summary

Une procédure est présentée pour le repliement de la domaine de liaison du ligand périplasmique dCACHE de Campylobacter jejuni zone chémoréceptrice Tlp3 de corps d’inclusion et de la purification pour produire des quantités de milligramme de protéine.

Abstract

Identification des ligands naturels des chémorécepteurs et études structurelles visant à élucider les bases moléculaires de la spécificité de ligand peut être grandement facilitée par la production de quantités de milligramme de domaines de liaison du ligand pur, plié. Tentatives de façon hétérologue express domaines de liaison du ligand périplasmique de chémorécepteurs bactériennes Escherichia coli (Escherichia coli) souvent entraîner leur ciblage dans les corps d’inclusion. Ici, on présente une méthode pour la récupération de la protéine de corps d’inclusion, son repliement et la purification, le domaine de liaison du ligand dCACHE périplasmique de Campylobacter jejuni (c. jejuni) zone chémoréceptrice Tlp3 en prenant comme exemple. L’approche implique l’expression de la protéine d’intérêt avec un CLIVABLES son₆-tag, l’isolement et induite par l’urée solubilisation des corps d’inclusion, protéine de repliement de l’appauvrissement de l’urée et de purification par chromatographie d’affinité, suivi par chromatographie d’enlèvement et d’exclusion stérique tag. La spectroscopie de dichroïsme circulaire est utilisée pour confirmer l’état plié de la protéine pure. Il a été démontré que ce protocole est généralement utile pour la production de quantités de milligramme de domaines de liaison du ligand périplasmique dCACHE des autres chémorécepteurs bactériennes sous forme soluble et cristallisable.

Introduction

Le chimiotactisme et la motilité ont démontré que jouent un rôle important dans la pathogenèse de Campylobacter jejuni en favorisant la colonisation bactérienne et l’invasion de l’hôte^1,2,3. Chimiotaxie permet aux bactéries de s’orienter vers un environnement optimal pour la croissance, que guidés par des signaux chimiques. Ce processus implique la reconnaissance de signaux chimiques intracellulaires et de l’environnement par un ensemble de protéines appelées chémorécepteurs, ou protéines de type transducteur (PLT). La plupart des chémorécepteurs sont des protéines m....

Protocol

1. l’expression de son₆-Tlp3-LBD chez e. coli

1. Inoculer 150 mL de bouillon Luria-Bertani (LB) stérile contenant 50 µg, ampicilline des^-1 mL avec BL21-Codon-Plus (DE3) - cellules RIPL transformées avec le vecteur pET151/D-TOPO pour l’expression de son₆- Tlp3-LBD (résidus d’acides aminés 42-291), et Incubez il à 37 ° C dans un agitateur (diamètre de l’orbite, 25 mm) avec 200 tr/min pendant la nuit.
2. Préparer six flacons Erlenmeyer de 2 L contenant 800 mL de bouillon LB stérile et le 50 µg mL^-1 ampicilline. Inoculer chaque flacon de 20 mL de la culture au jour le jour obtenue à l’étape 1.1. Les incube....

Results

Recombinante expression de son₆-Tlp3-LBD chez e. coli a abouti au dépôt de protéines dans le corps d’inclusion. L’expression de 1 L de culture bactérienne calculée à l’étape 2.13 représentait environ 100 mg de son₆-Tlp3-LBD déposé au corps d’inclusion. La technique d’isolation de protéine, décrit ici et illustré dans la Figure 1, se compose de la solubilisation des corps d’inclusion, le repliement des protéines et la purificatio.......

Discussion

Une procédure simple pour l’expression et le repliement de corps d’inclusion de la LBD périplasmique de la zone chémoréceptrice bactérienne Tlp3 est présentée. Préparation de la protéine pure implique la surexpression du gène codées en pET-plasmide dans e. coli, de purification et de solubilisation des corps d’inclusion, repliement de la protéine dénaturée et sa purification par l’affinité consécutive et étapes de la chromatographie d’exclusion stérique. L’urée-facilité de dénaturation et dilution/dialyse-mediat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Base Tris	AMRESCO	497
Chlorure de sodium (NaCl)	MERK MILLIPORE	1064041000
Ampicilline	G-BIOSCIENCES	A051-B
Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)	MERCK	52332
Triton x-100	AMRESCO	694
Isopropyle &bêta ;-D-thiogalactoside (IPTG)	ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
Urée	AMRESCO	VWRC0568
Dithiothreitol	ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD	C-1029
Monochlorhydrate de L-arginine	SIGMA-ALDRICH	A5131
L-glutathion réduit	SIGMA-ALDRICH	G4251
L-glutathion oxydé	SIGMA-ALDRICH	G4376
Phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4)	SIGMA-ALDRICH	7558-79-4
Phosphate monobasique de sodium (NaH2PO4)	SIGMA-ALDRICH	10049-21-5
Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique déshydraté (EDTA)	AMRESCO	VWRC20302.260
Imidazole	SIGMA-ALDRICH	I2399
Glycérol	ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD
Chlorure de nickel (NiCl2)	SIGMA-ALDRICH	339350
Glycine	AMRESCO	VWRC0167
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	SIGMA-ALDRICH	L4509
Échelle protéique non colorée, large Gamme (10-250 kDa)	NEW ENGLAND BIOLABS	P7703
Concentrateur centrifuge Amicon Ultracel (Millipore)	MERCK	UFC901096
50 mL Tube Falcon		FALCON BDAA352070
Tube de dialyse	LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY	Dialyse
Tube de dialyse Snakeskin	THERMO SCIENTIFIC&trade ;	68100
Colonne HP, chélation HiTrap préemballée	GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES	17-0408-01
Homogénéisateur haute pression EmulsiFlex-C5	AVESTIN	EmulsiFlex&trade ; - C5
Pompe péristaltique P-1	GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES	18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 colonne d’exclusion de taille.	GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES
JASCO J-815 spectropolarimètre	JASCO	J-815