Isolement de cellules dendritiques de l’appareil reproducteur féminin humain pour des études phénotypiques et fonctionnelles

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour isoler et purifier les cellules dendritiques de différents compartiments anatomiques dans le tractus reproducteur femelle humain pour l’évaluation de leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles. Cette méthode peut être adaptée pour isoler des autres cellules immunitaires ou autres tissus muqueux, les cellules dendritiques.

Résumé

Il est difficile en raison de la difficulté à obtenir des échantillons de la caractérisation des cellules dendritiques humaines (DCs) résidents dans les tissus muqueux, et le faible nombre de DCs présents par tissu. Pourtant, que le phénotype et la fonction des contrôleurs de domaine n’est modifiée par l’environnement tissulaire, il est nécessaire d’analyser les populations résidentes de DC tissu, puisque le sang provenant DCs incomplètement refléter les complexités des contrôleurs de domaine dans les tissus. Nous présentons ici un protocole visant à isoler les contrôleurs de domaine de l’humain appareil reproducteur féminin (FRT) à l’aide de spécimens de l’hystérectomie qui permet des analyses phénotypiques et fonctionnelles. Le protocole se compose de digestion de tissu pour générer une seule cellule mixé suspension cellulaire, suivie par la sélection des billes magnétiques positifs. Notre protocole de digestion du tissu ne pas se fendent de marqueurs de surface, ce qui permet une analyse phénotypique et fonctionnelle des contrôleurs de domaine dans l’état d’équilibre, sans une nuit d’incubation ou cellule d’activation. Ce protocole peut être adapté pour l’isolement des autres types de cellules immunitaires ou l’isolement des contrôleurs de domaine provenant d’autres tissus.

Introduction

La DRF a la double fonction de protection contre les agents pathogènes tout en permettant l’implantation et la grossesse¹. Pour ce faire, le TRAF est compartimenté, avec chaque région anatomique affiche des caractéristiques histologiques, immunologiques et fonctionnelle unique¹.

DCs présents à surfaces muqueuses prendre contact avec les microbes dans les poumons, le tube digestif et l’appareil génital et assurer la surveillance immunitaire d’éventuels agents pathogènes². Contrôleurs de domaine ont la capacité unique apprêter naïf T-cellules et de déclencher des réponses....

Protocole

Études sur des sujets humains ont été menées selon les principes exprimés dans la déclaration d’Helsinki. Études ont été approuvées par le Comité pour la Protection des sujets humains (SSPC) et Dartmouth College Institutional Review Board. Consentement éclairé a été obtenu avant l’intervention de femmes séronégatives subissant des hystérectomies au Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Lebanon, NH). Pathologistes formés sélectionné des échantillons de tissus de l’EM, CX et ECX, exempte de lésions pathologiques et éloigné des sites de pathologie. Des échantillons de sang ont été prélevés de donneurs sains volontaires recrutés à Dartmouth Hitchcock Medical Center. Les don....

Résultats

Digestion de tissus suivant, la sortie des feuilles épithéliales et des glandes peut être observée, comme illustré à la Figure 1 a; Il s’agit d’un contrôle positif qui indique la digestion enzymatique a été un succès. Le nombre de cellules viables totales et DCs récupérés par gramme de tissu est également indiqué dans la Figure 1 b et de la Figure 1, respectivement. Les cellules immunitaires représen.......

Discussion

DCs muqueuses sont une population de cellules rares fortement influencée par l’environnement tissulaire, qui change leur phénotype et leurs fonctions une fois qu’ils pénètrent dans les tissus³. Bien que dérivé du sang DCs sont un modèle très utile, ils ne représentent pas complètement la diversité des populations de DC trouvé dans les tissus. Pour comprendre les caractéristiques uniques de muqueuses DCs, isolement de cellules primaires des tissus est donc nécessaire. Isolement des contrôleurs de d.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	Hyclone	SH30015.03
Pénicilline-streptomycine	Hyclone	SV30010
HEPES (1M)	Hyclone	15630-080
Collagénase IV	Sigma	C5138
Désoxyribonucléase I	Worthington Biochimique	LS002140
D-glucose	Sigma Aldritch	50-99-7
0,22 μm Stericup 500 mL  ; filtre	Millipore	SCGPU05RE
100mm x 15mm boîte de Pétri en polystyrène	Fisherbrand	FB0875712
150mm x 15mm 150mm x 15mm Boîte de Pétri en polystyrène	Fisherbrand	FB0875714
150mm x 25mm	430599	ning	Boîte de
Incubateur Isotemp	Fisher Scientific	FICO3500TABB	5,0 % CO2
American Rotator V	American DADE	R4140
250 um maille nylon	Sefar	03-250/50
20 um maille nylon	Sefar	03-20/14
Beckman GS-6R Centrifugeuse	Beckman	358702
X-VIVO 15 avec gentamicine L-Gln, Rouge de phénol, 1 L	Lonza	04-418Q
Humain AB Serum	Valley Biomedical	HP1022
Histopaque-1077	Sigma Aldritch	10771
Solution tampon de phosphate (PBS)	National Diagnostics	CL-253	pH 7.4
Kit d’élimination des cellules mortes	Miltenyi Biotec	130-090-101
Filtre de pré-séparation (30um)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Colonne LS	Miltenyi Biotec	130-042-410
Séparateur Quadro MACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
Socle multiple MACS	Miltenyi Biotec	130-042-303
EDTA	USB	15694
CD1a Microbilles, humaines	Miltenyi Biotec	130-051-001
CD14 Microbilles, humaines	Miltenyi Biotec	130-050-201
eFluor 670 colorant de prolifération cellulaire	eBiosciences	65-0840-85
96 plaque inférieure ronde bien ronde	Falcon	9/8/2866
Zombie jaune colorant de viabilité	Biolegend	423104
CD3 APC/Cy7, anti-humain	Tonbo Biosciences	25-0038-T100
CD4 PE, anti-humain	eBiosciences	12-0048-42
CD8a FITC, anti-humain	Tonbo Biosciences	35-0086-T100
Gallios Cytomètre en flux	Beckman Coulter Life Sciences	B43618	10 couleur, VBR
MACSquant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	130-096-343	8 couleurs, VBR

Cor culture cellulaire traitée