Bouillon Microdilution In Vitro Screening : une méthode simple et rapide pour détecter les nouveaux composés antifongiques

Résumé

Une méthode de microdilution bouillon simple et adaptable pour le dépistage des substances antifongiques et extraits.

Résumé

Les infections fongiques sont devenues une condition médicale importante dans les dernières décennies, mais le nombre de médicaments antifongiques disponibles est limité. Dans ce scénario, la recherche de nouveaux médicaments antifongiques est nécessaire. Le protocole rapporté ici en détail une méthode aux peptides de l’écran pour leurs propriétés antifongiques. Il repose sur le test de sensibilité de microdilution bouillon des lignes directrices du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3, avec des modifications pour répondre à la recherche de peptides antimicrobiens comme de potentiels nouveaux antifongiques. Ce protocole décrit une analyse fonctionnelle afin d’évaluer l’activité des composés antifongiques et peut être facilement modifié pour convenir à une quelconque classe de molécules incriminés. Comme les tests sont effectués en plaques 96 puits à l’aide de petits volumes, un dépistage à grande échelle peut être complété en un court laps de temps, surtout si réalisée dans un cadre de l’automatisation. Cette procédure illustre comment un protocole clinique standardisé et réglable peut aider à la poursuite de banc-travaux de nouvelles molécules pour améliorer le traitement des maladies cryptogamiques.

Introduction

Les infections fongiques sont devenus une préoccupation médicale importante ces dernières décennies, ayant considérablement augmenté principalement en raison d’une augmentation du nombre des individus immunodéprimés tels que ceux qui subissent le traitement du cancer et ceux qui vivent avec le VIH/sida ou transplanter des organes^1,2. Cependant, un éventail très limité de médicaments antifongiques disponibles et le nombre croissant de rapports sur la résistance fongique à eux contribuent aux problèmes majeurs concernant la thérapeutique des mycoses systémiques³.

Une source potentielle de nouveaux composés antifongiques sont des peptides antimicrobiens (ampères), petits peptides cationiques produites par nombreux organismes dans le cadre de leur réponse immunitaire innée à l’infection⁴. Néanmoins, la méthode de dépistage pour tester ces composés contre les pathogènes fongiques n’est pas standardisée. Procédures différentes ont été utilisées pour évaluer l’activité antifongique des amplis, parfois pour le même modèle micro-organisme^5,6,7. Ces différences et le manque de précision dans certains protocoles compliquent les comparaisons entre reproductibilité de composés et de paniers.

Normaliser les tests de nouveaux candidats-médicaments consiste à suivre les lignes directrices permettant de définir la sensibilité aux antifongique en milieu clinique, tels que la clinique et Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. Toutefois, ces tests de sensibilité antifongiques sont trop restrictives et ne prennent pas en variation de la contrepartie dans le métabolisme de toutes les espèces, telles qu’elles ont été établies uniquement pour quelques agents sélectionnés. Par exemple, ils ne tiennent pas compte des besoins métaboliques des levures fermentant le non.

Ce protocole permet l’évaluation de l’activité des éventuels composés antifongiques et est mis en place ici pour la recherche de peptides antifongiques. Il repose sur le test de sensibilité de microdilution bouillon des lignes directrices du CLSI M27-A3, avec les adaptations qui permettent d’optimiser le dépistage des nouveaux composés^8,9. Ces modifications permettent l’utilisation de faibles quantités de composés, les variations de température ou initiale d’inoculum et différents médias pour une croissance optimale pré-test, tout en standardisant les résultats avec l’utilisation d’antifongiques de référence sous forme de contrôles. Cette méthode, avec l’utilisation de plaques multipuits culture, rend possible un grand nombre de composés de l’écran rapidement et sûrement.

En raison de sa souplesse inhérente, ce protocole peut être utilisé avec différentes classes chimiques des composés et contre d’autres micro-organismes, avec quelques adaptations.

Protocole

1. les solutions et les médias

1. Préparer 2 milieu de 1640 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI), en solution saline tamponnée au phosphate (PBS), bouillon de Sabouraud dextrose et la Sabouraud dextrose agar conformément au tableau 1.

2. champignons Inoculum des Conditions de croissance

1. Stocker toutes les souches fongiques comme stocks congelés en glycérol de 35 % à-80 ° C, jusqu'à ce que nécessaire.
2. Effectuez les opérations suivantes avant de chaque expérience.
   1. Pour les souches de Candida albicans :
      1. Décongeler un flacon de stock et transférer 200 µL à 10 mL de bouillon de Sabouraud dextrose dans un tube en polypropylène stérile de 50 mL avec un bouchon et de la culture du jour au lendemain à 30 ° C sous agitation (200 tr/min). N’oubliez pas d’incliner le tube et laisser le bouchon légèrement ouverte pour une meilleure aération de la culture.
   2. Pour les souches de Cryptococcus neoformans :
      1. Gratter la surface gelée d’un flacon de stock. Plaque des cellules sur des plaques de Gélose Sabouraud dextrose et incuber pendant 48 h à 30 ° C. Après croissance visible de colonies isolées, garder les assiettes dans le réfrigérateur (4 ° C) operculée avec film de paraffine pendant 15 jours.
      2. Recueillir une colonie isolée moyennes de la plaque à l’aide d’un cure-dent stérile ou une boucle inoculation stérile et ensemencer 10 mL de bouillon de Sabouraud dextrose dans un tube conique stérile de 50 mL. Incuber pendant environ 24 heures à 30 ° C sous agitation (200 tr/min).
      3. Ne pas dépasser le 24 h d’incubation. N’oubliez pas d’incliner le tube et laisser le bouchon légèrement ouverte pour une meilleure aération. Il est toujours bon de normaliser le stade de croissance des cellules avant chaque essai, puisqu’il s’agit d’un facteur important affectant la résistance aux antimicrobien.
         Remarque : Les deux champignons ont été cultivées à 30 ° C pour une propagation rapide dans nos expériences, mais la température peut être modifiée pour refléter les objectifs de l’étude, le traitement par exemple clinique (37 ° C). Surtout, ce temps d’incubation initiale doit être établi au préalable pour chaque isolat fongique et maintenu pendant tous les essais afin d’assurer la reproductibilité.
3. Après la croissance fongique, recueillir les cellules par centrifugation des tubes coniques à 1 200 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et ajouter 10 mL de PBS.
4. Remettre en suspension les cellules et centrifuger à nouveau à 1 200 g pendant 5 min à température ambiante.
5. Répéter le lavage PBS et centrifugation de deux fois plus. Après le troisième lavage, remettre en suspension les cellules de 5 mL (selon la taille de granule) de 2 X RPMI-1640 moyenne.
6. Préparer 1 mL d’une dilution au 1/100 ou 1 : 1 000 dans un tube de microcentrifuge (en fonction de la turbidité de la suspension cellulaire).
7. Aliquote de 10 µL de cette dilution, placez-le dans une chambre hémocytomètre et compter le nombre total de cellules dans les quadrants de quatre coin sous le microscope. Calculer la concentration par la formule suivante : (total cellule numéro/4) x dilution facteur x 10⁴ (constante de dilution de chambre).
   1. Envisager une viabilité de 100 % si les conditions dénombrements et croissance de viabilité ont été systématiquement corrélées pour l’isolat à l’étude.
      NOTE : La normalisation et le contrôle de la qualité des comtes de viabilité peuvent être faits par l’arrière-électrodéposition en accord avec le Comité européen sur la méthode de Concentration inhibitrice Minimum (CMI) antifongique Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) pour levures¹⁰ .
   2. Si la corrélation de croissance/viabilité n’a pas été établie pour l’isolat à l’étude, mesurer la viabilité fongique par comptage des cellules vivantes dans un hémocytomètre avec l’aide de colorants cette couleur sélectivement les cellules mortes, comme le phloxine B¹¹, le bleu de trypan ¹², ou Janus vert¹³. Utiliser les cellules fongiques pour ce protocole seulement si la viabilité de la population à ce stade est de 90 % ou plus.
      NOTE : Colorants morts/vivants ne fonctionnent pas bien avec le champignon de choix. S’il vous plaît de les tester avant de l’utiliser. Par exemple, le colorant bleu trypan ne fonctionne pas bien avec c. neoformans.
8. Après cela, préparer les suspensions de cellules dans un milieu RPMI-1640 de X 2 (2 X ajusté inoculum dans un milieu RPMI-1640). Pour les plaques à 96 puits envisager un volume de 5 mL pour chaque plaque.
   1. Pour toutes les souches de c. albicans , préparer une suspension de cellules stock de 4 x 10³ cellules/mL. Cette concentration est 2 X de la concentration de la dernière cellule dans chaque puits (2 x 10³ cellules/mL).
   2. Pour les souches de c. neoformans , préparer une culture de réserve de cellules 2 x 10⁴ cellules/mL. Cette concentration est deux fois la concentration de la dernière cellule dans chaque puits (1 x 10⁴ cellules/mL).
   3. Pour les autres champignons, tester avec un antifongique connu dont la concentration sera idéale pour l’étude en particulier en ce qui concerne le temps d’incubation. Compte tenu de temps le métabolisme et la duplication du champignon.

3. peptides (Agent inconnu)

1. Stocker les peptides lyophilisés à-20 ° C et les dissoudre dans l’eau désionisée avant chaque expérience. La durée de conservation maximale une fois dissoute dans l’eau dépendra de la nature de chaque peptide.
2. Préparer des aliquots de deux fois la plus forte concentration finale analysés avec le test (2 X). Idéalement, préparer un petit nombre de parties aliquotes avec assez de peptide pour un usage de temps afin d’éviter les cycles de gel-dégel.
   Remarque : Le choix de la concentration devrait reposer sur la littérature et les propriétés du peptide. Il est recommandé de commencer la série de dilutions avec environ 100 µM du peptide et ensuite augmenter ou diminuer cette gamme de concentration en fonction des résultats obtenus.

4. reference antifongiques (témoins positifs)

1. Pour ceux dilué dans l’eau : préparer une solution de X 2 de la plus forte concentration de l’analyse (voir Section 5 : dosage antifongique pour les étapes de dilution).
   1. Pour les souches de c. albicans , préparer une solution de 128 µg/mL de fluconazole ou 128 µg/mL de la caspofungine. La concentration de la plaque pour les deux soit 64 µg/mL.
   2. Pour les souches de c. neoformans , préparer une solution de 32 µg/mL d’amphotéricine B (solution soluble dans l’eau). La concentration de la plaque soit 16 µg/mL.
      Remarque : Normalement amphotéricine B est dilué dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), étant donné que l’anti-fungiques est peu soluble dans l’eau. Cependant, il y a les préparations solubles dans l’eau amphotéricine B disponibles dans le commerce.
2. Pour antifongiques dilués dans un solvant organique : Préparez un 100 X solution dans du DMSO, puis diluer à 10 X dans l’eau pendant l’utilisation.
   Remarque : Ainsi, dans le puits, la concentration finale de DMSO ne dépassera pas 1 %. Il faut un puits où le champignon se développera dans des milieux contenant 1 % DMSO comme contrôle compte tenu du fait que certains champignons ne tolèrent pas bien cette concentration du solvant. N’oubliez pas que le DMSO est photosensible, donc couvrir la plaque avec une feuille ou placez-le dans une chambre noire pour la durée de la période d’incubation.

5. antifongique Assay

NOTE : In vitro antifongique analyses basé sur le test de sensibilité de microdilution bouillon de directives Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 avec quelques modifications.

1. Préparer une dilution en série double de chaque peptide et antifongique en Microplaque 96 puits en polystyrène pour un volume final de 50 µL de contrôle.
   1. À l’aide d’une pipette ajouter 100 µL de l’antifongique/peptide dans la concentration X 2 de la plus haute désiré concentration finale dans les colonnes 1 à 3, en ligne A.
   2. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 50 µL d’eau stérile dans les autres puits, dans les rangées B à H.
   3. Enlever 50 µL des puits ayant la plus forte concentration (ligne A), transfert à l’autre bien de la prochaine concentration (ligne B) et homogénéiser.
   4. Répétez les étapes ci-dessus jusqu'à ce que le bien avec la concentration la plus faible et jeter 50 µL de ce puits (colonne H). Laissez les colonnes 11 et 12 (lignes A, B, C) avec de l’eau seule pour contrôle à blanc ou contrôle négatif/croissance.
   5. Ajouter 50 µL de la 2 X inoculum ajusté dans un milieu RPMI-1640 dans chaque cupule (colonnes 1-3 plus colonne 11 (contrôle négatif/croissance)) ; la concentration finale de c. albicans sera 2 x 10³ cellules/mL et la concentration finale pour les souches de c. neoformans sera 10⁴ cellules/mL.
   6. Préparer les contrôles vides (50 µL d’eau + 50 µL 2 X RPMI-1640 moyen sans cellules) et contrôle négatif/croissance (50 µL d’eau + 50 µL ajusté inoculum 2 X RPMI-1640 moyennes sans antifongique) et la charge dans la plaque bien comme décrit ci-dessus.
2. Répétez la procédure pour chaque composé à tester et le contrôle choisi antifongique (colonnes 4-10).
   Remarque : Les dilutions en série peuvent s’effectuer verticalement comme l’expérience ci-dessous, ou horizontalement dans la plaque (c'est-à-dire, si le nombre de dilutions de l’extrait/composé donné qui doit être testé est de huit ou plus).
   1. Si les composés, référence médicaments, ou un de ses composants sont photosensibles, effectuer le test en lumière réduite, recouvrir les plaques avec du papier ou placer dans une chambre noire au cours d’incubations.
3. Examiner les recommandations facultatives ci-après.
   1. Sceller la plaque avec un couvercle transparent qui permet les échanges gazeux, comme cette aide à réduire l’évaporation.
   2. Placer la plaque dans une chambre humide ; Il contribuera également à réduire l’évaporation.
4. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h ou 48 h pour toutes les souches de c. albicans et pendant 48 h avec 200 tr/min, secouant pour c. neoformans. Le volume final inférieur (100 µL) veille à ce qu’aucun débordement se produit.
   Remarque : Aucune différence significative n’a été observée entre les lectures de MIC après 24 h et 48 h pour les souches de c. albicans . Néanmoins, les lectures à 48 h sont plus faciles à visualiser.
5. Observer tous les puits, avec l’aide d’un microscope optique inversé, avant la période d’incubation et après pour vérifier les changements dans la morphologie ainsi pour contrôler les signes de contamination.
   Remarque : Les lectures peuvent être faits visuellement et photographiés à la fin de l’expérience. Avant chaque lecture, homogénéiser légèrement la plaque. Le lit peut également être effectué en mesurant son OD à 600 nm, si la cellule des touffes ou filamentation ne sont pas respectées.
6. Réaliser les expériences au moins trois fois à des dates distinctes.

Résultats

Le MIC est définie comme la plus faible concentration de composés antimicrobiens qui inhibe complètement la croissance fongique visible à la fin de la période d’incubation. Étant donné que l’objectif de ce protocole est une méthode rapide pour les potentiels antifongiques écran, un puits avec claire médias similaires à blancs est considéré comme un résultat positif, alors qu’un puits une turbidité analogue dans les puits de contrôle négatif/croissance est considéré comme négatif. Toutefoi...

Discussion

Tests de microdilution peuvent analyser l’activité antifongique potentielle d’un composé à l’aide de petites quantités de ce composé de la cible et en même temps le tester dans une gamme de concentrations. En conséquence, le présent protocole est recommandé dans un premier temps dans le dépistage de potentiels nouveaux composés antifongiques. Le protocole présenté ici est basé sur le protocole M27-A3, initialement conçu pour aider dans le choix du traitement antifongique dans les cliniques et peut s’adapter à une variété...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu <> fort et réactifs
RPMI 1640 avec l-glutamine, sans bicarbonate de sodium	Thermo Fisher	31800-022
3-(N-morpholino) propane acide sulfonique (MOPS) (o que a gente usa tem um só ; dio, completa o nome dele please)	Sigma-Aldrich		Utiliser pour tamponner 2X RPMI medium
Chlorure de sodium (NaCl)	Dinâ ; mica	1528-1	137 mM pour solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
Chlorure de potassium (KCl)	J.T.Baker	3040-01	2,7 mM pour solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
Phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	V000129	10 mM pour solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	60230	2 mM pour solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
BD Difco Sabouraud Bouillon de dextrose	BD	238230
BD Difco Sabouraud Dextrose Agar	BD	210950
Glycérol	Sigma-Aldrich	V000123	35 % pour (soluç ; ã ; o de estoque ? Criopreservaç ; ã ; o ?)
Eau			Para diluiç ; ã ; o das drogas na diluiç ; ã ; o seriada
Antifungals
Amphotéricine B	Sigma-Aldrich	A2942
Fluconazole	Sigma-Aldrich	F8929
Caspofungin	Sigma-Aldrich	PHR1160
Plastics
Tube	conique de 50 mLSarstedt	62.547.254
Boîte de pétri	J.Prolab	0304-5
Plaque à 96 puits	Corning	3595
Réservoir de solution stérile	KASVI	K30-208	Utiliser pour filtrer les solutions à l’aide du microscope optique multicanaux pippet
Equipment et autres matériaux
Microscope optique	Nikon	E200MV
Centrifuge	Thermo Fisher	MegaFuge 16R
Incubateur	Ethik Technology	403-3D	réglé à 37° ; C
Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E25	réglé sur 37° ; C, 200 tr/min
Chambre de comptage de cellules, Neubauer	BOECO Allemagne	BOE 13
Pipette multicanaux	HTL	5123