Une méthode Optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’Expression génique dans les Interactions cellule-cellule

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à analyser le transfert de cellule à cellule de renseignements oscillatoires par optogenetic contrôle et suivi de l’expression génique en direct. Cette approche constitue une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.

Abstract

Cellules doivent répondre correctement à l’évolution dans le temps des environnements qui sont influencés par divers facteurs d’entourant les cellules. L’encoche voie de signalisation est l’une de ces machines moléculaires essentielles pour les communications de cellule à cellule, qui joue un rôle clé dans le développement normal des embryons. Cette voie implique un transfert de cellule à cellule d’informations oscillatoires avec rythme ultradien, mais malgré les progrès des techniques de biologie moléculaire, il a été difficile à élucider l’impact des interactions multicellulaires sur gène oscillatoire dynamique. Nous présentons ici un protocole qui permet le contrôle d’optogenetic et de surveillance en direct des modèles d’expression de gène de manière temporelle précise. Avec succès, cette méthode a révélé que les entrées périodiques intracellulaires et intercellulaires de signalisation Notch monter oscillations intrinsèques de réglage de fréquence et déphaseurs à la résolution de cellule unique. Cette approche est applicable à l’analyse des caractéristiques dynamiques des différentes voies de signalisation, fournissant une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.

Introduction

Cellule-cellule communication joue un rôle crucial dans la structuration embryonnaire dans le processus de développement. Chez les embryons de vertébrés, les structures métamérique appelées somites sont forment le long de l’axe antéro-postérieur corps avec une précision temporelle sous le contrôle d’une horloge de chronométrage, appelée la segmentation horloge¹. Au cours de ce processus, un groupe de cellules somitiques mésoderme (PSM) sont périodiquement convertis en somites de manière synchrone. Ce processus implique l’expression des gènes oscillatoire synchronisé et cellules PSM qui oscillent en phase forment les somites mêmes. La période de l’expression génique oscillatoire est environ 2 à 3 h chez la souris et environ 30 min chez le poisson zèbre. Lorsque dissociées, les cellules PSM perdent la synchronie^2,3, mais quand ils sont re-agrégés, qu’ils puissent s’organiser et récupérer la population synchronie⁴, ce qui suggère que le couplage cellule-cellule est une clé pour la synchronisation oscillations.

Des efforts considérables ont révélé que des molécules de signalisation de la voie Delta-encoche sont correctement raccordés aux oscillations des gènes segmentation horloge synchronisées. Inhibiteurs pharmacologiques ou mutations génétiques de la signalisation Notch désynchroniser la population des oscillateurs. Chez le poisson zèbre, mutants de Notch signalisation composants, tels que DeltaC, DeltaD et Notch1a, affichent les oscillations asynchrone^5,6. Chez les embryons de poulet ou de la souris, non seulement le ligand Notch Delta-like1 (Dll1), mais aussi l’encoche modulateur Lunatic fringe (LNFG) est nécessaire pour des oscillations synchronisées^7,8,9. Cependant, il a été difficile à tester la capacité de telles molécules pour le transfert des informations dynamiques de cellule en cellule, parce que des résolutions temporelles des classique perturbation de la dynamique de règlement de gène n’étaient pas suffisantes pour enquêter sur les processus de délais de 2 à 3 h (rythme ultradien).

Nous avons récemment mis au point une méthode intégrée pour contrôler et surveiller profils d’expression génique dans les cellules de mammifères,¹⁰. Cette technologie permet l’induction d’impulsions d’expression de gène par une illumination lumineuse périodique sur des échelles de temps ultradiennes. Ce protocole représente les méthodes pour établir des lignées de cellules photosensibles et observer les réactions dynamiques des cellules journaliste par luminescence de cellules vivantes suivi dans les contextes de communication de cellule à cellule. Cette méthode est applicable à l’analyse des nombreuses autres voies de signalisation.

Protocol

1. génération de lignées cellulaires stables par le système Tol2

1. Transfecter des vecteurs de plasmide (Figure 1 a) des modules axés sur les Tol2 optogenetic ainsi que le vecteur d’expression transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) dans les cellules C2C12. Dans toutes les étapes, les cellules de culture avec un milieu DMEM additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et de la pénicilline-streptomycine à 37 ° C (tableau 1), en présence de 5 % CO₂, notée dans le cas contraire.
   1. Compter les débris de cellules avec un compteur de cellules et plaque 5 x 10⁴ C2C12 cellules / puits dans une plaque de 12 puits un jour avant la transfection.
   2. Transfecter Co 0,375 μg de vecteurs de base Tol2 optogenetic (pAI177 ou pAI218), 0,125 µg d’un vecteur de choix du médicament (pAI170) et 0,5 μg de pCAGGS-mT2TP vector à l’aide de lipofection réactif.
   3. Trypsinize cellules transfectées et leur plaque dans les récipients de culture de 100 mm, un jour après la transfection.
   4. Échange de milieu de culture pour les cellules transfectées de milieu de culture additionné de 100 mg/mL hygromycine.
   5. Cellules en culture pendant 3 jours pour éliminer les cellules non transfectées. Notez que le changement médiatique n’est pas nécessaire.
2. Trypsinize cellules transfectées et purifier une population de cellules exprimant des protéines fluorescentes pour la sélection. Pour les cellules réceptrices transportant des pAI177, la valeur la porte triage canal vert-PE pour la purification de la population de cellules mCherry-positif. Pour les cellules photosensibles expéditeur transportant pAI218, réglé la tri porte sur APC canal pour la purification de la population de cellules iRFP713-positif.
3. (facultatif) Établir une population clonale de cellules par les méthodes usuelles, telles que la dilution limitée ou unicellulaires Tri par FACS.

2. evaluation de la Photo-la sensibilité des cellules modifiées au niveau des populations

NOTE : Cette partie décrit un protocole pour vérifier l’induction dynamique des protéines ligand Dll1 sur l’éclairage en lumière bleu par des tests biochimiques, comme qPCR et éponger occidental.

1. Mis en place deux types d’incubateurs avec ou sans sources lumineuses pour une maladie induite par la lumière ou une condition sombre, respectivement. Intensité lumineuse mise en place d’un bleu-trans-Illuminateur LED, comme le montre l' Figure 1 b, à l’aide d’un luxmètre. Programme horaires et durée de l’éclairement lumineux en chargeant un script de contrôle à un micro-contrôleur monocarte qui permet des horaires programmables pour l’éclairage (Figure 1).
2. Comte trypsinisés cellules avec un compteur de cellules et transportant des pAI218 et pAI170 sur la vaisselle de culture en plastique de 35 mm de diamètre (plus de 12 plats pour l’état lège et 1 plat pour condition sombre) de cellules photosensibles expéditeur de⁵ plaque 1,0 x 10 et la valeur de la vaisselle séparer les incubateurs pour conditions de clair/sombre. Après avoir configuré les plats, garder les portes des incubateurs fermées jusqu’en collectant les lysats cellulaires.
3. Un an et demi jours après l’ensemencement, commencer léger éclairage (cellules devraient être plus de 80 % confluentes). Ne pas exposer à la lumière pour éviter les indésirables de photo-stimulation des cellules.
   NOTE : Horaires d’éclairage dépend le but des expériences. Notez qu’une condition d’éclairage durable (e.g. intervalles de durée et 10 min 1 min avec 40 µmol/m2/s intensité lumineuse) est suffisant pour un simple contrôle du photo-induction et cette forte illumination lumineuse est nocif pour les cellules. Ainsi, vérifiez que les paramètres inoffensifs pour l’illumination sont sélectionnés.
4. Environ 2 jours après l’ensemencement, préparer cellule-lysat avec intervalles de 30 min. Passer des plats échantillon d’incubateurs à sur la glace et commencer à préparer des lysats de cellules pour une analyse ultérieure.

3. dynamique expéditeur-destinataire test au niveau des populations : surveillance en temps réel des réponses cellulaires lors de la Stimulation optique par PMT

1. Trypsinize et compter le nombre de l’expéditeur et les récepteur des cellules avec des méthodes standard. Préparer un volume total de 1 mL du mélange suspension de 2,5 x 10⁴ récepteur et 1,25 x 10⁵ cellules d’expéditeur (ratio de 1:5).
   NOTE : 2:1, 1:1 ou 1:2 expéditeur-destinataire ratios également travaillent avec un nombre total de cellules de 1,5 x 10⁵. ¹⁰
2. Plaque mixé des cellules dans chaque cupule des plaques 24 puits noirs avec milieu de culture contenant luciférine de 1 mM.
3. Analyser les cellules sur le lecteur de plaque pour l’analyse de luciferase et confirmer que les signaux de sortie ne sont pas trop élevés pour le système d’enregistrement.
   Remarque : Si des signaux de sortie sont supérieures à 1 x 10⁶ photon compte/s, ils peuvent être saturés. Dans ce cas, réduire la concentration de luciférine aux valeurs optimales pour que les signaux de sortie sont inférieures à 1 x 10⁶ photon compte/s.
4. Mettre la plaque sur le système d’enregistrement et commencer un programme d’enregistrement (Figure 1). Par exemple, commencer léger éclairage à 18 h après le réglage de l’enregistrement.
   Remarque : Un filtrage temporel, comme le redressement de signaux avec le déplacement en moyenne et Savitzky-Golay, filtrage, sont utile pour la visualisation des formes d’ondes et détections de pointe.

4. dynamique expéditeur-destinataire dosage au niveau unicellulaire : en temps réel d’imagerie des unicellulaires réponses sous le contrôle d’une Perturbation de la Optogenetic

1. Plaque de 0,5 x 10⁵ récepteur et 2,5 x 10⁵ cellules de l’expéditeur sur plats de diamètre 27 mm-diamètre-verre-base 35 mm. S’assurer que les rapports de ce mélange et un nombre total de cellules (une densité cellulaire) sont correctement ajustés.
2. Un jour après l’ensemencement, échanger le milieu avec 2 mL de support d’enregistrement (milieu DMEM sans phénol rouge, additionné de 5 % FBS, pénicilline-streptomycine et luciférine de 1 mM) et placer le plat de verre-base sur le microscope. Si nécessaire, laver les débris de cellules mortes avec du PBS (-).
   NOTE : Il est préférable de faire cette étape dans des conditions sombres.
3. Mettre en place un microscope inversé équipé d’une chambre à 37 ° C et 5 % de CO₂.
4. Mettre en place une caméra CCD refroidie. Veiller à ce que la température du capteur CCD est refroidie à la valeur de destination (en général,-90 ° C).
5. Définir les paramètres de la fenêtre « Multi-Dimensional Timelapse » dans le logiciel d’acquisition automatique pour capturer des images avec des intervalles de 5 min et plus de 288 heures (plus d’un enregistrement au jour le jour).
   1. Ouvrez « Multi-Dimensional Timelapse » fenêtre, sélectionnez un canal de luminescence et un mode de lecture de 50 kHz lent dans le menu déroulant et définissez 4x4 binning bénéficiant d’une orientation de 4 min. Veiller à ce que la lecture est réglée sur le mode de 50kHz lente, ce qui est essentiel pour réduire les bruits de la lecture pour détecter bioluminescente faiblement émettant de la lumière.
   2. Ouvrez « Multi-Dimensional Timelapse » fenêtre, sélectionnez canaux fluorescence et un mode de lecture rapide 1 MHz dans le menu déroulant et définissez binning de 2 x 2 avec exposition de 400 ms. Veiller à ce que la lecture est réglée sur le mode rapide de 1 MHz à réduire le temps nécessaire pour l’imagerie de fluorescence.
   3. Commencez en Time-lapse enregistrement en cliquant sur le bouton « Acquérir ».
6. Extraire des unicellulaires traces des canaux de la luminescence des films Time-lapse par logiciel analyse d’images, comme suit. Tout d’abord, faire des images de pile de luminescence et fluorescence en important les données de l’image au logiciel d’analyse image. Pour les images de la luminescence, supprimer les pixels chauds provenant des rayons cosmiques en comparant les intensités des pixels dans les images adjacentes dans le temps, remplaçant les valeurs de pixel à la moyenne temporelle des trames précédentes et suivante (implémenté comme « SpikeNoise filtre »), appliquer ces images traitées à un filtre de lissage dans l’espace et soustraire des valeurs de pixel de fond de répertorie vues de chaque image. Ensuite, déterminer une « région d’intérêt » (ROI) pour chaque cellule sur une image fluorescente à chaque instant, enduire le retour sur investissement des images lumineuses et mesurer l’intensité luminescente de chaque ROI.

Results

Nous avons adapté la LightOn système^11,12, qui permet l’expression des gènes photoinduit dans des cellules de mammifères, à l’étude des oscillateurs génétiques avec une périodicité de 2 à 3 h. Ce système se compose de deux parties : l’activateur de la transcription inductibles par photo hGAVPO et une cassette de SAMU-promoteur de transcription de lecteur des gènes arbitraires d’intérêt. Afin d’accélérer la cinétique pulsatile de l...

Discussion

Nous avons montré une méthode pour contrôler la dynamique d’expression de gène avec une périodicité de 2 à 3 h. Cette échelle de temps est plus courte que ceux dans d’autres systèmes conventionnels, y compris le système Tet et le système de LightOn original. Les paramètres clés pour atteindre les échelles de temps ultradiennes sont demi-vies de produits moléculaires photoinduit, ARNm et de protéines. Ces paramètres cinétiques peuvent dépendre des espèces et des types de cellules. Pour le réglage de la cinétique, remplaça...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACS	Becton, Dickinson and Company	FACSAriaII Caméra SORP
	Andor	iKon M-934
Microscope	Olympus	IX-81 ZDC
PMT appareil	Churitsu eletric corp.	CL24B-LIC/B
Illuminateur LED bleu	OptoCode	LEDB-SBOXH
DMEM	Nacalai	08459-35
Pénicilline-streptomycine	Nacalai	26253-84
Sérum fœtal bovin	Sigma	172012
KRYSTAL24 (plaque noire 24 puits )	Hi-tech	303012
D-Luciferin Potassium Sel	Nacalai	20028-24
Posemètre	LI-COR Biosciences	LI-250A
anticorps anti-HA-Peroxydase	Roche	clone 3F10
Anticorps anti-Actine-Peroxydase	Wako	clone 2F3