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Article de méthode

Sonder les rôles des Forces physiques dans la morphogenèse embryonnaire précoce de poussin

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DOI :

10.3791/57150

⸱

5 juin 2018

 ,  ,  ,  , 
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole introduisant un ensemble de nouvelles expériences de l’ex-ovo et approches de modélisation physique pour étudier les mécanismes de la morphogenèse lors de torsion de cerveau embryonnaire précoce poussin.

Résumé

Le développement embryonnaire est traditionnellement étudié du point de vue de la génétique biomoléculaire, mais l’importance fondamentale de la mécanique dans la morphogenèse est devenant de plus en plus reconnue. En particulier, le tube de coeur et le cerveau embryon de poulet, qui subissent des changements morphologiques qu’ils développent, sont parmi les candidats de choix pour étudier le rôle des forces physiques dans la morphogénèse. Progressive de flexion ventrale et de torsion vers la droite du cerveau de l’embryon de poulet tubulaire arrivent au stade plus précoce d’asymétrie gauche-droite au niveau de l’organe dans le développement embryonnaire de poussin. La membrane vitelline (VM) contraint la face dorsale de l’embryon et a été impliquée dans la fourniture de la force nécessaire pour induire la torsion du cerveau en développement. Nous présentons ici une combinaison de nouvelles expériences de l’ex-ovo et physique modélisation afin d’identifier les mécanismes de la torsion du cerveau. Au stade 11 de Hamburger-Hamilton, les embryons sont récoltés et mis en culture ex ovo (dans les médias). La machine virtuelle est ensuite supprimée à l’aide d’un tube capillaire extraite. En contrôlant le niveau d’huile et en soumettant l’embryon à une interface liquide-air, la tension de surface fluide des médias peut servir à remplacer le rôle mécanique de la machine virtuelle. Expériences de microchirurgie ont également été effectuées pour modifier la position du coeur de trouver les changements qui en résultent dans la chiralité de torsion de cerveau. Les résultats de ce protocole illustrent les rôles fondamentaux de la mécanique dans la conduite de la morphogenèse.

Introduction

La recherche en biologie du développement moderne en grande partie met l’accent sur le développement de la compréhension du point de vue de la génétique moléculaire1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. on sait que les phénomènes physiques jouent un rôle central dans la morphogenèse, ou la génération de biologique forme14,15,16,17; Cependant, les mécanismes mécaniques spécifiques de développement restent globalement peu étudiés. Ventrale flexion et torsion vers la droite du tube cerveau primitif après Hamburger-Hamilton étape 11 (HH 11)18 sont les deux principaux processus qui contribuent à la forme embryonnaire changent19,20. En particulier, le mécanisme physique qui sous-tendent le développement de torsion dans le cerveau embryonnaire reste incomplètement compris.

La torsion embryonnaire dans l’embryon de poulet est parmi les premiers événements morphogénétiques d’asymétrie (L-R) gauche-droite dans le développement. Lorsque le processus de l’asymétrie de la L-R est perturbé, malformations congénitales comme situs inversus, isomérieou heterotaxia aura lieu le21.
Nous présentons ici un protocole qui allie ex-ovo expériences22,23 à modélisation physique pour caractériser les forces mécaniques pendant le développement précoce du cerveau embryonnaire. La méthode présentée vise à identifier les forces mécaniques responsables de torsion du cerveau ainsi que les facteurs qui influent sur le degré de torsion pendant début développement12. Basée sur l’observation expérimentale que la membrane vitelline (VM) contraint la face dorsale de l’embryon, nous avons émis l’hypothèse que la machine virtuelle fournit la force nécessaire pour induire la torsion du cerveau en développement. Par conséquent, dans cette méthode, nous avons supprimé la partie de la machine virtuelle qui couvre la zone du cerveau pour savoir les effets sur la torsion du cerveau. En outre, la méthode d’application liquide de tension superficielle a été utilisée pour confirmer le rôle mécanique de la machine virtuelle et de fournir une estimation de la force nécessaire pour la torsion de cerveau, qui n’avait pas été faite auparavant. Mesurer les forces au cours de la morphogenèse embryonnaire est une tâche difficile. Notamment, dans une étude pionnière, Campàs et ses collaborateurs24 a développé une nouvelle méthode pour quantifier le stress cellulaire à l’aide de gouttelettes injectée. Néanmoins, cette méthode se limite à mesurer des forces au niveau cellulaire, donc non applicable pour sonder les forces au niveau des tissus ou organisme. Le protocole présenté dans le présent document a été développé pour combler partiellement cette lacune.

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Protocole

1. préparation des milieux de Culture de tissus

  1. Utiliser une bouteille de 0,5 L du moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose, bicarbonate de sodium, L-glutamine et comme base pour les milieux de culture.
  2. Sous une hotte à flux laminaire stérile, ajouter 10 mL d’antibiotiques à la 0,5 L de DMEM.
  3. À l’aide d’une pipette stérile, transférer 50 mL de la solution d’antibiotiques DMEM dans un tube conique stérile de 50 mL.
  4. Ajouter 50 mL de sérum de poussin à la solution d’antibiotiques DMEM restante dans la bouteille de 0,5 L dans la hotte stérile.
  5. Stocker la solution finale (dénommée ci-après poussin milieux de culture [CCM]) en aliquotes de tube à fond conique de 50 mL à-20 ° C.

2. Incubation des oeufs

  1. Utilisation délicate essuie avec de l’éthanol 70 % pour le nettoyage spécifique exempts de micro-organismes pathogènes Leghorn blanche poulet fécondés. Organiser les oeufs dans une orientation longitudinale sur les titulaires.
  2. Allumez un incubateur de œufs pour régler une température cible de 37,5 ° C et maintenir le taux d’humidité de 48 à 55 %. L’humidité est contrôlée en ajoutant une quantité appropriée d’eau dans l’incubateur.
  3. Incuber les œufs à HH11-13, 40-44 h environ.
  4. Laissez que les oeufs refroidissent à température ambiante pendant environ 15-30 min avant la pulvérisation/nettoyage avec l’éthanol à 70 %.

3. Tirez les capillaires en verre

  1. Monter un 10 tubes capillaires de verre cm de long avec un diamètre extérieur de 1,0 mm et 0,5 mm de diamètre intérieur sur un terrain de micropipettes.
  2. La valeur de la chaleur et tirez les paramètres à 750 et 400, respectivement. Appuyez sur le bouton tirer tirer le tube capillaire en fines aiguilles.

4. papier filtre Carrier méthode

  1. Couper des cercles d’environ 3 cm de diamètre de papier filtre.
  2. Couper un rectangle à peu près 1 cm par 2 cm du cercle à l’aide d’une perforatrice. Assurez-vous d’enlever toute saillie ou les coins pointus.

5. embryon récolte et préparation

  1. Casser les oeufs par le bas, écartez la coquille doucement et soigneusement déposer contenu dans une boîte de Pétri 150 x 15 mm. Pour assurer que le côté de l’embryon est en place, conserver les oeufs dans le même sens, qu'ils ont été incubés pendant leur fissuration.
  2. Supprimer l’albumine mince à l’aide d’une pipette Pasteur jetable.
  3. Séparer l’albumine épais le jaune d’oeuf avec une pincette terminé émoussé. Assurez-vous que l’albumine épais a été supprimée en grattant légèrement le dessus du jaune avec le forceps terminé émoussé.
  4. Pinces à pointe fine permet de centrer et placez un anneau de papier filtre sur l’embryon, correspondant à l’axe longitudinal de l’anneau avec l’axe longitudinal de l’embryon.
  5. Couper le jaune qui entoure l’anneau de filtre en papier avec des ciseaux.
  6. Tirez sur l’anneau et l’embryon hors le jaune dans une direction oblique vers le site où le jaune a été tout d’abord coupé.
  7. Rincer les embryons dans les deux plats de 100 mm séquentiels avec la température de la pièce 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  8. Placez un anneau de papier filtre dans une boîte de Petri 35 mm tout d’abord. Puis placer la face dorsale de l’embryon vers le haut sur le papier filtre déjà dans 35 mm boîte de Pétri.
  9. Placez un anneau en acier inoxydable sur le dessus le papier filtre "sandwich". Veillez à ne pas endommager l’embryon.
  10. Ajouter 3 mL de la CCM préalablement préparée pour chaque boîte de Pétri.
  11. Supprimer la machine virtuelle de chaque embryon par écrémage légèrement l’aiguille capillaire extraite dans la partie supérieure de l’embryon et épluchage de la machine virtuelle de suite, à partir de l’extrémité antérieure (juste au-dessus du prosencéphale) et procéder à la notochorde (Figure 1 a).
  12. Placez les huit plats de Pétri de 35 mm dans un plat de 150 mm qui était bordé de lingettes tâche délicate eau saturée (pour maintenir l’humidité).
  13. Place le plat de Pétri de 150 mm dans un sac en plastique refermable puis remplir le sac avec un mélange de gaz composé de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2.
  14. Sceller le sac et placez-le dans un incubateur à 37,5 ° C.
  15. Incuber les embryons pendant 27 h supplémentaires jusqu’en HH15-CM16 (Figure 1 b).

6. induisant la Tension superficielle

  1. Sortir les embryons de l’incubateur et utiliser un système de tomographie par cohérence optique pour leur image. Utilisation OCT pour déterminer l’angle de torsion du tube neural (NT) (Figure 2).
  2. Transférer les embryons à un microscope optique et visualiser à un grossissement de 10 X. Utiliser une pipette de 200 microlitres de progressivement supprimer 0,2 mL de médias de la boîte de Pétri.
  3. Prendre des images de fond clair à chaque intervalle d’observer les effets de l’interface média-air sur l’embryon.
  4. Retirez le support jusqu'à ce que la tension de surface à travers l’embryon induit la torsion (Figure 1).
  5. Image de l’embryon en utilisant le système de OCT une fois de plus à mettre en place un angle de torsion final aux fins de comparaison contrôler des embryons.  Remarque : Les images de Bright-champ ont été acquis à l’aide d’un microscope à dissection. Un système de tomographie par cohérence optique avec un microscope ci-joint a été utilisé pour acquérir des piles d’image transversale des embryons vivants. Des images ont été obtenus dans un domaine de balayage3 3 x 10 x 3 mm, puis traitées dans un logiciel d’imagerie. Enfin, les images du modèle physique ont été prises avec un appareil de photo numérique reflex mono-objectif.

7. physique modélisation des Forces de Tension superficielle/VM

  1. Développer une géométrie 3D simplifiée qui ressemble à un embryon entre CM14-17 dans le logiciel de modélisation commerciale (Figure 3 a).
  2. La conception du moule négatif de la géométrie 3D dans les logiciels d’infographie 3D commercial.
  3. Utilisation d’une imprimante 3D dotée de 1,75 mm acrylonitrile butadiène styrène à incandescence à la 3D imprimer le moule conçu, au format stéreolithographie (.stl).
  4. Pour effectuer un cast du moule, mélanger silicone caoutchouc élastomère composants A et B en parties égales et versez le mélange dans le moule sans tarder ; mettre le moule de coulée pour guérir à température ambiante pendant 12 h (Figure 3 b).
  5. Marquer le modèle physique de l’embryon le long de la NT sur la face dorsale de visualiser la torsion.
  6. Utiliser un lamelle couvre-objet pour répliquer la force exercée sur le modèle physique 3D qui imite celle de la machine virtuelle ou de la tension de surface (Figure 3D).
  7. Insérer une série de fils rigides de longueur égale au côté du modèle physique. Après que la lamelle exerce une force extérieure sur le modèle du cerveau, les fils deviennent inclinés à un angle qui dépend de l’emplacement. Déterminer l’angle de rotation d’arctan de la durée prévue sur toute la longueur initiale de chaque fil (Figure 3E).

8. modifier le sens de la boucle de coeur

  1. Suivez les étapes aux points 3.1 et 3.2 pour obtenir un tube capillaire extraite.
  2. Suivez les étapes de 5.1 et 5.10 à préparer l’embryon.
  3. Utilisez une paire de pinces pour faire basculer le filtre en papier pour que l’embryon devient ventrale-côté-vers le haut.
  4. Utiliser le tube capillaire extraite pour couper une fente dans la membrane de la splanchnopleure (SPL).
  5. Utiliser le tube capillaire pour exercer une force mécanique pour pousser le coeur du côté droit au côté gauche.
  6. Suivez les étapes de 5.12 par 5.15 pour observer le changement en torsion.

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Résultats

Dans cette étude, la machine virtuelle de l’embryon à HH11 a été retirée de l’extrémité antérieure de la flexion thoracique. Les embryons ont été photographiés par un système d’OCT. À ce stade, la torsion du tube de cerveau n’a pas démarré (Figure 1 a). Après être incubées à HH15-16, embryons avec leur VM enlevé expose réduite du cerveau, torsion du tube, environ 35 degrés (Figure 1 b) par rapport à contrôler des embryons, qui pr...

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Discussion

Alors que les phénomènes physiques jouent un rôle essentiel dans la morphogenèse26,27,28,29,30, les mécanismes mécaniques spécifiques, ainsi que la coordination de la mécanique et mécanismes moléculaires, restent largement inexplorées. Il est connu que la flexion ventrale et la torsion vers la droite du cerveau primitif sont deux processus centrales qui contri...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Remerciements

Z.C. reconnaît l’appui du Fonds de démarrage de Dartmouth et la Branco Weiss - Society for Science fellowship, administré par l’ETH Zurich. Les auteurs remercient Drs Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo et Yunfei Shi pour discussions utiles, ainsi que les réviseurs anonymes pour commentaires. Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation recherche bourse d’études supérieures sous le Grant No. DGE-1313911. Opinions, résultats et conclusions ou recommandations exprimées dans ce matériel sont celles de l’auteur (s) et ne reflètent pas nécessairement les vues de la National Science Foundation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fécondé Œufs de poule White Leghorn exempts d’agents pathogènes spécifiquesCharles River
Microscope à tomographie cohérenteoptique ThorlabsGAN220C1
Élastomère de siliconeSmooth-On, Inc.EcoFlex 00-50
Microscope de dissectionLeicaMZ8
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)Lonza12-604F
AntibiotiquesSigmaP4083
Sérum de poussinSigmaC5405
Extracteur de micropipetteSutter InstrumentModèle P-30
Papier filtreWhatman5202-110
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Corning21-040-CV
Comsol MultiPhysicsLogiciel
Rhino 5
Microscope attaché avec OCTNikon  ;FN1
Appareil photo reflex numérique mono-objectifEOS  ;Rebel T3i
d’infographie 3D Comsol

Références

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