L’interaction et la sédimentation de l’argile et les cellules bactériennes dans le domaine maritime, observé en milieu naturel, peuvent être mieux étudiées dans un environnement de laboratoire contrôlées. Nous décrivons ici un protocole détaillé qui décrit une nouvelle méthode pour mesurer le taux de sédimentation d’argile et de cyanobactéries venait.
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Article de méthode
Détermination du taux d’argile/cyanobactéries venait s’installer
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les mécanismes qui sous-tendent la déposition de grain fin, sédiments riches en matière organique sont encore largement débattues. Plus précisément, l’impact de l’interaction des particules d’argile avec réactifs cellules cyanobactéries planctoniques à l’enregistrement sédimentaire est moins étudié. Cette interaction est un contributeur majeur potentiellement à des modèles de schiste sédimentaire. Dans un cadre de laboratoire, les taux de floculation et de la sédimentation de ces matériaux peuvent être examinés et mesurés dans un environnement contrôlé. Ici, nous détaillons un protocole permettant de mesurer la vitesse de sédimentation des mélanges d’argile cyanobacterial. Cette méthodologie est démontrée par le biais de la description des expériences deux modèles : le premier utilise le kaolin (une forme déshydratée de la kaolinite) et Synechococcus SP PCC 7002 (une cyanobactéries coccoïdes marines), et le second kaolin et Synechocystis SP PCC 6803 (une d’eau douce cyanobactéries coccoïdes). Cultures de cyanobactéries sont mélangés avec des quantités variables d’argile dans un appareil réservoir spécialement optimisé pour permettre la vidéo continu et en temps réel et enregistrement photographique. Les procédures d’échantillonnage sont détaillées ainsi qu’un protocole après le prélèvement pour la mesure précise de la chlorophylle a qui peut déterminer la concentration de cellules de cyanobactéries restant en suspension. Grâce à la réplication expérimentale, un profil est construit qui affiche la vitesse de sédimentation.
Introduction
À l’aide de conditions environnementales actuelles et les processus de déduire au-delà des mécanismes de sédimentation est depuis longtemps un fondement de la sédimentologie. Tandis que les analogues de sédimentation modernes, tels que la mer Noire, ont été utilisés pour comprendre la déposition de dépôts riches en matière organique, à grain fins, des expériences en laboratoire ont le potentiel pour faire la lumière supplémentaire sur l’origine des gisements de schiste. Une zone d’enquête dans la genèse des argiles noires est le taux de dépôt et le mécanisme de formation initiale. Traditionnellement, on a émis l’hypothèse que les argiles noires forment dans les environnements où la vitesse de sédimentation, la productivité primaire et taux de matière organique respiration favorisent la préservation de la matière organique dans les sédiments1,2 ,3. Cependant, le rôle des cyanobactéries et floculation de l’argile est resté en grande partie sans se faire remarquer. Ce mécanisme de floculation permettrait de dépôt rapide des sédiments riches en matière organique, à grain fins de se produire et ne nécessite pas de pauvre en oxygène. Compte tenu de ce principe, ce protocole a deux buts : 1) mesurer la vitesse de sédimentation de venait de cyanobactéries/argile et 2) visualiser le processus de sédimentation en temps réel. Cette méthodologie, en plus de l’analyse géochimique, a servi à démontrer que cette floculation de cyanobactéries/argile peut en fait être un important mécanisme de schiste formation1. Alors qu’initialement prévu pour la modélisation des dépôts de schiste, cette méthode est applicable à d’autres disciplines telles que la biologie et l’assainissement de l’environnement où l’influence de l’entrée de l’argile sur le métabolisme bactérien et de la population doivent être mesurés.
De nombreuses études ont été menées afin d’observer la floculation de cyanobactéries et d’argile, pour atténuer les efflorescences algales nuisibles2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. Toutefois, tout en mesurant la concentration cellulaire au fil du temps, ces études n’ont pas appliquées floculation de cyanobactéries/argile à la modélisation de la déposition de l’enregistrement de la roche. Par conséquent, ces études n’ont pas un composant visuel, qui peut être critique quand passé sédimentologiques des processus de modélisation. En outre, la plupart des études utilise comptage cellulaire (p. ex., Pan et al. 11), qui peut être laborieux. Notre méthode, avec les progrès récents dans la mesure de floculation cyanobactérie, détermine les changements dans la concentration cellulaire de cyanobactéries en mesurant la chlorophylle a (Chl a) à intervalles de temps discrets. Appariement de Chl une mesure avec données visuelles est une nouvelle approche, qui peut être utilisée pour déduire des conditions. Les images générées permet également de calculer la vitesse de sédimentation après les travaux Du et coll.. 13. la combinaison des données visuelles et numériques renforce la fiabilité des résultats. En outre, nous exposons les protocoles additionnels permettant de la sédimentation de biomasse morte et d’argile à observer également. C’est important, lors de l’examen passé environnements sédimentologiques, où vivent et biomasse morte peut avoir cohabitent. Différences dans le comportement de biomasse morte durant la floculation (par exemple, diminution des taux de floculation) aurait potentiellement des implications sédimentologiques.
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Protocole
1. préparation des Cultures cyanobactériennes
-
Préparation des cultures de l’inoculation en utilisant des milieux solides
- Obtenir des cellules de cyanobactéries axéniques de l’American Type Culture Collection ou la Collection de cultures de Pasteur. Par exemple, les unicellulaires, marine Synechococcus SP. PCC 7002 provenait de la Collection de Culture de Pasteur, il sera désigné ci-après comme Synechococcus.
- Maintenir les cellules Synechococcus sur des plaques contenant des milieux solides (un + milieux liquides14 et 1,5 % agar15). Ces désignera ci-après comme des cultures de l’inoculation.
- Incuber les plaques à 32 ± 2 ° C avec la lumière continue à 30 – 50 µmol photons m-2 s-1,15,18.
- Répétez les étapes 1.1-1.3 et remplacer un + support avec BG-11,16 , à l’étape 1.1.2 pour espèces de cyanobactéries d’eau douce, comme Synechocystis SP. PCC 680316,17, dénommé Synechocystis. Se référer aux tableaux 1 à 4 pour la composition des médias A + et BG-11.
-
Préparation des cultures en milieu liquide : chaque expérience de réservoir nécessite une culture de cyanobactéries de 400 mL.
- Recueillir une 250 mL et deux erlenmeyer résistant à la chaleur de 1 L.
- Rincer chaque ballon avec une solution d’acide chlorhydrique (HCl) de 4 M (30 mL de solution d’HCl pour chaque fiole), suivie de l’eau distillée.
ATTENTION : l’acide chlorhydrique est corrosif et toxique. Veiller à ce qu’une blouse de laboratoire, des lunettes et des gants résistant à l’acide sont portés pendant l’utilisation de la solution de HCl de 4 M. Effectuez cette étape dans un évier de laboratoire et de suivre les réglementations locales concernant l’élimination de la solution de HCl 4 M - Remplissez le flacon de 250 mL avec 50 mL de milieu liquide (A + ou BG-11). Remplissez un flacon de 1 L de 400 mL de milieu liquide (A + ou BG-11) et l’autre fiole de 1 litre avec 600 mL de médias (A + ou BG-11).
- Sceller chaque ballon avec un bouchon de mousse perméable de gaz et couvrir le cou de la bonde et la fiole de mousse d’aluminium.
- Étiquette et stériliser les fioles à 121 ° C et 100 kPa pendant 25 min. permettent les fioles à refroidir à température ambiante.
- Préparer une hotte à flux laminaire en stérilisant la surface avec de l’alcool 70 %.
- Recueillir une boucle de l’inoculation de fil, un bec Bunsen, le flacon de milieu liquide refroidi 50 mL (de l’étape 1.2.5) et la culture de l’inoculation (à l’étape 1.1). Placer ces éléments dans la hotte à flux stérilisé.
- Stériliser la boucle inoculation brièvement à l’aide de la flamme d’un bec Bunsen et laissez-le refroidir.
- Faites glisser la boucle cool le long de la surface de la culture de l’inoculation pour prélever des cellules de cyanobactéries.
- Enlever le bouchon de mousse et d’aluminium du flacon de 250 mL (sans toucher le bouchon de mousse) et stériliser le rebord de l’erlenmeyer en le faisant passer brièvement par le biais de la flamme.
- Incliner le ballon donc les médias sont près de l’encolure du flacon et insérer la boucle de l’inoculation recouverte de cellules dans le ballon. Une fois que la boucle est immergée dans les médias, remuer la boucle de l’inoculation pour supprimer les cellules.
- Supprimer la boucle de l’inoculation et re-stériliser le rebord du flacon à l’aide de la flamme du bec Bunsen.
- Remplacer le bouchon de mousse et d’aluminium dans l’erlenmeyer (sans toucher le bouchon de mousse).
- Stériliser l’Anse à inoculation brièvement dans la flamme du bec Bunsen.
- Préparez une pièce de croissance (appelée la chambre de croissance) où la température est maintenue à 30 ° C15,18 et intensité lumineuse est de 30 à 50 µmol photons m-2 s-1,15,18 . Humidité n’est pas activement contrôlée.
- Permettre la culture inoculés 50 mL à incuber en secouant à 150 tr/min dans la chambre de croissance, avec une température maintenue de 30 ° C. Garder la bouche du ballon couvert pendant l’agitation pour contrôler les pertes par évaporation et éviter la contamination.
- Permettent la culture de cyanobactéries à cultiver pendant 96 h. Une culture réussie devrait apparaître vert vif et ont une densité optique (do) à 750 nm de 0,4 à 0,6.
- Une fois que la culture s’est développée suffisamment, placer la culture de 50 mL et la fiole de 1 litre contenant 400 mL de milieu liquide (de l’étape 1.2.5) dans la hotte à flux laminaire. S’assurer que la hotte est stérilisé suivant étape 1.2.6.
- Répétez l’étape 1.2.10 pour les deux ballons dans une hotte à flux laminaire.
- Versez la culture de 50 mL dans les 400 mL de médias dans le flacon de 1 L et re-stériliser la lèvre de la fiole de 1 L à l’aide de la flamme du bec Bunsen.
- À la place le bouchon de la bonde et la feuille de mousse, attacher un appareil bouillonnement stérile consistant en un bouchon de mousse, tube en plastique, pipette, filtre en ligne et déjouer la couverture jusqu'à l’embouchure du ballon.
- Agiter le flacon de 1 L à 150 tr/min à 30 ° C avec l’appareil de barboteur attaché à une pompe à air, qui fait circuler un mélange de l’air humidifié par le biais de la solution15,18 à 300 mL/min.
- Permettent la culture de se développer au sein de la chambre de croissance à 30 ° C pendant 120 – 168 h. Une culture réussie devrait apparaître vert vif et ont une OD750 nm de 0,4 à 0,6.
- Répétez l’étape 1.2 pour produire une culture de contrôle, ce qui ne va pas être mélangée avec l’argile.
- Expériences utilisant la biomasse morte nécessitent une étape supplémentaire. Stériliser le flacon de 1 L la culture pendant 60 min à 121 ° C et laisser refroidir à température ambiante.
2. expérimental mis en place
- Placez un récipient acrylique rectangulaire (longueur 20 cm), largeur 5,1 cm et hauteur de 30 cm devant une banque des lampes fluorescentes (neuf ampoules T8, au moins 2 600 lumens ; La figure 1) 19.
- Placez une feuille de plastique translucide, blanche entre la Banque de lumières et le réservoir de diffuser la lumière, qui brille à travers le réservoir. Cette configuration est une adaptation de Sutherland et al. 19
- Mark le réservoir acrylique à une hauteur de 10 cm, mesurée verticalement à partir de la base. Toutes les mesures doivent être effectuées à cette hauteur dans la colonne d’eau pour assurer la cohérence de tout prélèvement.
- Placez une caméra sur un trépied, 1 mètre en avant du réservoir pour enregistrer chaque expérience. Une caméra vidéo est recommandée car les images peuvent être extraites des fichiers vidéo, et en utilisant le logiciel de modélisation mathématique, les fichiers vidéo peuvent être utilisés pour modéliser la décantation dynamique19.
- Placez un tissu noir sur la Banque léger, réservoir et caméra pour protéger l’expérience de sources de lumière à l’extérieur (Figure 1).
3. floculation protocole expérimental
- Percevoir la culture de 400 mL (étape 1.2), une grande éprouvette graduée et 600 mL de milieux de croissance supplémentaire dans un ballon jaugé de 1 L (étape 1.2.5).
- Diluer la culture de 400 mL (concentration de cellules initiales de 4 à 6 mg/mL) avec les milieux de croissance supplémentaires (A + ou BG-11) pour un volume final de 1 L à l’aide de l’éprouvette graduée. Ajouter cette solution dans le réservoir acrylique.
- Préparer 2 mL microtubes en étiquetage et en les plaçant dans un emplacement idéal près du réservoir acrylique. Mesure 50 g d’argile pour l’expérience.
- Lancer l’enregistrement vidéo. Dans le cas d’expériences multiples, un écriteau portant l’identificateur de l’expérience peut être temporairement tenu devant la caméra.
- À l’aide d’une pipette, prélever un échantillon de 1 mL et le placer dans un tube à centrifuger étiquetées. Utilisez cet exemple pour déterminer le nombre de cellule initiale de cyanobactéries en mesurant l’OD750 nm valeurs. Prendre tous les échantillons en trois exemplaires pour garantir des résultats précis.
- Rapidement, verser l’argile (50 g) dans le réservoir avec une agitation vigoureuse à l’aide d’un bâton agitateur pendant 10 à 15 s.
- Démarrer le compte à rebours et prendre l’échantillon initial de 1 mL pour Chl une détermination à l’aide d’une pipette P1000 (échantillon temps0).
- Prélever des échantillons supplémentaires à des intervalles de temps appropriés (par exemple1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, min 180 et 240 min).
- Une fois l’expérience est terminée, enregistrez le fichier vidéo, éteignez le caméscope et traiter tous les échantillons de Chl détermination (étape 4) .
- Le reste de la solution argileux/cyanobactéries d’autoclave. Selon les espèces de cyanobactéries, les règlements locaux et laboratoire politique, jeter la solution à l’aide de méthodes appropriées. Nettoyer le réservoir avec du savon et l’eau, rincer à l’eau distillée, et sécher à l’air il.
- Préparer une expérience de contrôle avec aucune argile ajouté. Prélever des échantillons sur les mêmes points de temps. Ces données peuvent être comparées aux autres données expérimentales afin de confirmer que les taux de sédimentation sont renforcés en raison de la floculation avec de l’argile, pas un résultat de décantation naturelle.
- Si la biomasse morte est utilisée pendant l’expérience, utiliser la même procédure expérimentale. Toutefois, la procédure d’élimination de la solution ne nécessite pas de passage à l’autoclave.
4. traitement et évaluation de l’échantillon
- Déterminer une concentration de Chl dans chaque échantillon de cellules à l’aide d’une procédure de modification du Owttrim16. Une fois collectés, les cellules de chaque échantillon pendant 3 min à 13 000 x g , en utilisant une micro-centrifugeuse à température ambiante a granulé.
- Retirez les supports excès à l’aide d’une pipette P1000 et ajouter 1 mL de méthanol à 100 % (20 ° C). Vortex de l’échantillon à pleine vitesse pendant 1 minute remettre en suspension le culot cellulaire.
ATTENTION : Le méthanol est toxique et inflammable. Porter des gants et des lunettes de sécurité et éloigner les sources d’inflammation de méthanol. - Incuber les échantillons à-20 ° C pendant 24 heures afin de faciliter l’extraction de la Chl a.
- Après incubation, les débris cellulaires de granule, tel que décrit dans la 4.1, transférer le surnageant vert dans une cuvette à l’aide d’une pipette et placez la cuve dans le spectrophotomètre. Laisser l’échantillon pour se reposer dans le spectrophotomètre pendant 1 min pour que n’importe quel argile restant au sein de l’échantillon s’installe et n’interfère pas avec la mesure.
- Déterminer une concentration de Chl par spectrophotométrie en mesurant l’absorbance à 665 nm et 652 nm et OD à 750 nm. La LCH une concentration est déterminée à l’aide de la formule Chl a = 16.29 x (un665 - OD750) - 8,54 x (un652 - OD750) 20. Une concentration de CHL est utilisée comme un proxy pour la concentration cellulaire. En outre, un facteur de conversion de 7,4 x 1010 cellules/L = 10 g/L21 peut être utilisé pour calculer la concentration cellulaire en grammes de certaines espèces de cyanobactéries.
- Terrain de Chl a les valeurs calculées par rapport au temps.
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Résultats
Lorsqu’il est exposé à l’argile, cellules de cyanobactéries sont présentées sur suspension22. Cela est illustré dans les résultats représentatifs donnés ici. Pour déterminer l’effet de l’argile sur les populations de cyanobactéries et d’observer la sédimentation taux, deux expériences ont été menées au cours de laquelle les Synechococcus et Synechocystis ont été exposés à l’argile de kaolin de 50 g/L (tableau 5-6,
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Discussion
Floculation catalysée par l’interaction cellule-argile cyanobacterial a attiré beaucoup d’intérêt dans les domaines de l’écologie et l’ingénierie2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient financement par les Sciences naturelles et en génie conseil de recherches (05448, 165831 et 213411).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| cyanobactéries (dans cette étude : Synechococcus sp. PCC 7002 et Synechocystis sp. PCC 6803) | Collection de cultures Pasteur | PCC 7002 ou PCC 6803 | utilisée pour inoculer les plaques |
| de gélose Thermo Scientific | CM0003 | utilisée pour remplir deux boîtes | |
| Pétri Plaques de Petri (bactériologie standard, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 requis |
| Erlenmeyer de 1 L résistant à la chaleur | Pyrex | 4980-125 | 1 |
| erlenmeyer de 250 mL requis | Pyrex | 4980-250 | 1 |
| boucle d’inoculation au nichrome avec poignée | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 |
| papier d’aluminium | Reynolds Wrap requis | 89079-067 | 50 cm requis ; utilisé pour couvrir le bouchon en mousse et le col des erlenmeyer |
| milieu de croissance (p. ex. A+) | 1050 mL requis ; produit à l’aide de la composition décrite dans les tableaux 1-4 | ||
| Bec Bunsen | Fisher | Scientific S95941 | 1 tube en |
| plastique | Fisher Scientific | S504591 | 1 m requis ; utilisé pour créer l’appareil de bouillonnement bouchon d’éponge |
| Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 obligatoire ; trou fait au centre pour pipette ; utilisé pour la construction de la feuille acrylique de l’appareil à bulles | |
| ; | Home Depot | Optix feuille acrylique transparente modèle # MC-102S | 1 requis ; utilisé pour construire un réservoir en acrylique (20 x 30 x 5,1 cm) |
| adhésif en silicone transparent imperméable | Home Depot | Loctite modèle # 908570 | 1 requis ; utilisé pour construire un réservoir en acrylique (20 x 30 x 5,1 cm) |
| appareil photo ou enregistreur vidéo | Caméscope HD Panasonic HC-V770 | 1 | |
| trépied | Magnus | VT-300 | 1 |
| Primomart | en tissu noir | ; EAN 0726670162199 ; Référence 680254blacknappedfr | 1 requis ; tissu de blocage léger duvetyne ; environ 152 x 213 cm pour couvrir l’expérience du réservoir |
| pipette sérologique résistante | à la chaleur corning incorporé C708510 | 13-671-101G | 1 requis ; utilisé pour créer les flacons d’échantillon de l’appareil de bullage |
| ; | Dynalon | S30467 | au moins 12 (variera avec l’intervalle de temps choisi) |
| pipette en verre résistant à la chaleur | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 requise ; utilisée pour créer l’appareil de bullage ; Une pipette sérologique en polystyrène fonctionnerait également, mais devrait être connectée au tube et au bouchon après que le reste de l’appareil ait été autoclave. |
| microcentrifugeuse | Eppendorf | 22 62 120-3 | ; 1 obligatoire ; Des produits comparables peuvent être utilisés s’ils sont capables de centrifuger des tubes de microfuge de 1,5 à 2 mL à une machine vortex de 13 000 x g |
| (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 |
| requis 100 % méthanol | Fisher Scientific | A412-500 FDS | au moins 12 mL (1 mL par échantillon) requis ; Attention : Inflammable, toxique. Portez des gants et des lunettes de sécurité. N’utilisez pas ou ne stockez pas à proximité d’une source d’inflammation. D’autres sources peuvent être utilisées. |
| cuvettes (1,6 mL, polystyrène) | Sarstedt | 67.742 | au moins 12 |
| spectrophotomètre | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 requis ; Pharmacia Biotech Novaspec ll pourrait également être utilisé. |
| ampoules | Home Depot | modèle # 451807 ; internet #205477895 ; store SKU #1001061538 | 6-8 ampoules nécessaires pour éclairer la pipette d’expériences en réservoir |
| (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | utilisée pour collecter des échantillons d’acide |
| chlorhydrique à 37 % | Sigma-Aldrich | 258148 | Attention : Corrosif et toxique. Portez une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants résistants aux acides lors de l’utilisation. Préparé à 4 N avant utilisation par dilution dans de l’eau désionisée dans une hotte chimique. |
| Bouchon en mousse (petit) | Canlab | T 1385 | |
| Bouchon en mousse (grand) | Canlab | T 1387 | Nécessite des bouchons intacts et certains avec un seul trou au centre |
| 30 ° ; C incubateur/salle de culture avec éclairage | 1 requis | ||
| 70 % d’éthanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL requis ; Attention : Toxique et inflammable. Porter une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité |
| Filtre à air hydrophobe (Midisart 2000, 0.2 & micro ; m) | Sartorius | 17805 | 1 argile requise |
| (par exemple kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | au moins 50 g requis |
| Tubes microfuge (2 mL, polypropylène) | Sarstedt | 72.695.500 | Des produits comparables peuvent être utilisés. Au moins 12 (variera avec l’intervalle de temps choisi) |
| 1000 & micro ; L pointes de pipette | Sarstedt | 70.762 | 1 nécessaire |
Références
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