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Formation de l’ADN Covalent adduits cancérogènes enzymatiquement activés et médicaments In Vitro et leur détermination par 32P-post-marquage

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DOI :

10.3791/57177

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20 mars 2018

1Department of Biochemistry, Charles University

Dans cet article

Résumé

Évaluation de l’activité des produits chimiques environnementaux et médicaments, pour être enzymatiquement bioactivated intermédiaires générant ADN covalent adduits, est un domaine important dans le développement du cancer et son traitement. Méthodes sont décrites pour l’activation composée pour former que des adduits d’ADN, ainsi que des techniques pour leur détection et la quantification.

Résumé

Adduits à l’ADN covalent formé par des produits chimiques ou le pouvoir cancérogène des médicaments sont jugés comme l’un des facteurs plus importants dans la phase d’initiation du processus cancérigènes. Cette liaison covalente, qui est considéré comme la cause de la tumorigenèse, est maintenant considérée comme un dogme central de la cancérogenèse chimique. Ici, les méthodes sont décrites en utilisant la réaction catalysée par le cytochrome P450 et enzymes de biotransformation supplémentaires pour enquêter sur l’activité des produits chimiques ou des médicaments pour leur activation en métabolites formant ces ADN adduits. Procédures sont présentées en décrivant l’isolement des fractions cellulaires possédant des enzymes de biotransformation (échantillons microsomiques et cytosoliques avec cytochromes P450 ou d’autres enzymes de biotransformation, c.-à-d., peroxydases, NADPH : cytochrome P450 oxydoréductase, oxydoréductase de NAD (P) h ou de xanthine oxydase). De plus, on décrit des méthodes qui peut être utilisé pour l’activation du métabolisme des substances chimiques analysés par ces enzymes ainsi que ceux pour l’isolement de l’ADN. En outre, les méthodes appropriées capables de détecter et de quantifier l’ADN produit chimique/pharmaceutique-dérivé des adduits, c'est-à-dire, différentes modifications de la technique de P-post-marquage 32et emploi des marqués radioactifs analysé des produits chimiques, sont montré en détail.

Introduction

Le métabolisme des xénobiotiques (substances chimiques environnementales ou drogues) se produit en deux phases1. Phases I et II visent à rendre les composés initialement hydrophobes (non soluble dans l’eau) plus hydrophile (soluble dans l’eau), ce qui les rend facilement conjuguent via l’urine, de selles ou de sueur. La phase I (fonctionnalisation) réactions incluent l’oxydation, réduction, et hydroxylation catalysée par les enzymes tel le cytochrome P450s (P450s, CYP), peroxydases (i.e., cyclo-oxygénase, COX), aldo-céto réductases (AKRs), microsomique flavine monooxygénases (OGP). Phase I comprend également des réactions de réduction, véhiculées par une variété de réductases c'est-à-dire microsomique NADPH : cytochrome P450 réductase (POR) et cytosolique NAD (P) h oxydoréductase (NQO1), xanthine oxydase (XO) et aldéhyde oxydase (AO)1 . Dans la deuxième phase (conjugaison), les groupes fonctionnels qui étaient attachés en phase I sont utilisées pour conjuguer les petites molécules polaires afin d’accroître encore la polarité. Exemples d’enzymes censées participer à la réaction de phase II incluent des sulfotransférases (résultats), N, O- acétyltransférases (NATs), méthyltransférases comme la catéchol -O- méthyltransférase (COMT), glutathion S- transférases (GST) et l’uridine diphosphate glucuronyltransférases (UGTs)1. La nomenclature des enzymes de phase I ou II est, toutefois, pas rigide, et certaines enzymes peuvent sans doute être regroupées en deux catégories.

Enzymes P450 (EC 1.14.14.1) sont l’hème contenant les protéines présentes dans les différents organismes qui participent à la biotransformation de nombreux produits chimiques, catalyser leur conversion3,4. Les enzymes P450 catalysent l’hydroxylation de nombreux substrats, avec une réaction où un atome de dioxygène est introduit dans la molécule de xénobiotiques, tandis que le second atome d’oxygène est réduit à l’eau forme de la réaction qui nécessite deux électrons [l’équation (1 de3,)]4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

Les enzymes P450 localisées dans la membrane du réticulum endoplasmique des cellules de mammifères (systèmes de P450 microsomiques) sont membres du système monooxygénase multienzymatiques, qui contient encore NADPH : cytochrome P450 réductase (POR) et du cytochrome b5 , le substrat de l’enzyme appelée NADH : cytochrome b5 réductase. Une théorie généralement acceptée émet l’hypothèse que le donneur des deux électrons nécessaires pour P450 est le système de NADPH/POR. Néanmoins, cytochrome b5 pourrait exercent également comme donneur d’électrons pour P450, à savoir en tant que donateur de l’électron réduisant P450 au cours de la deuxième réduction de son cycle de réaction, où elle agit avec NADH : cytochrome b5 réductase2,3,4.

Les mammifères utilisent diverses enzymes P450 (par exemple, les enzymes des familles 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 et 27) pour la synthèse de composés endogènes précieux, tels que les stéroïdes et utilisez-les pour le catabolisme des produits naturels2,3 . Les autres enzymes mammifères CYP, comme humaine CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 et 3 a 4, métabolisent exogènes substances chimiques qui sont utilisés comme médicaments. 5 , 6 les plus importantes enzymes catalysant le métabolisme des médicaments sont CYP de la sous-famille des 3 a, en particulier le CYP3A4. Les conversions des xénobiotiques, tels que les substances cancérogènes pro et pro-substances toxiques, sont véhiculées par les humains CYP1A1, 1 a 2, 1 b 1, 2 a 6, 2E1 et 3 a 42,5. La plupart de ces CYP est présente dans le foie (exception de CYP1A1 et 1 b 1). Néanmoins, le CYP est également exprimées dans plusieurs organes extrahépatiques. Ces P450s pourrait être d’une grande importance, surtout quand ils participent à la bioactivation du métabolisme des substances chimiques (médicaments) intermédiaires réactifs dans ces organes7. P450s divers sont induites par plusieurs composés qui sont leurs substrats, si ce n’est pas nécessairement le cas.

De nombreuses enzymes P450 jouent un rôle dans la toxicité chimique (médicament). Ils peuvent convertir les xénobiotiques non seulement dans leurs métabolites de désintoxication, mais aussi les activer pour les espèces réactives, qui modifient les macromolécules endogènes qui présentent en outre des propriétés biologiques différentes, causant habituellement leur toxicité. ADN, des lipides et des protéines peuvent être les cibles de leur modification par réactifs électrophiles et radicaux générés à partir de produits chimiques activées. Dans le cas de l’ADN, résoudre plusieurs réponses de gène important et leurs mécanismes sont déjà connus,2,3,4,5.

Les changements dans l’ADN peuvent entraîner une diminution de contrôle de la croissance cellulaire, et ce phénomène est considéré comme le facteur prédominant qui conduisent au développement de procédés cancérogènes. La génération de l’ADN covalent des adduits avec des produits chimiques ayant le pouvoir cancérogène est jugée comme une des étapes plus importantes dans la phase d’initiation des cancérogènes traite8,9,10,11. Il a été démontré que les relations entre la formation de l’ADN des adduits et tumorigenèse se produire, alors qu’une diminution de la quantité d’ADN adduits est responsable de la chimioprévention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. la formation d’agent cancérigène/drogue-dérivé des adduits d’ADN repose sur des bases de l’ADN et est affectée par les séquences de ces bases dans l’ADN. Les réparations de l’ADN des adduits sont tributaires de leur emplacement (sur le brin d’ADN transcrit ou non transcrites) et les types de nucléotides modifiés séquences8,11,12,15, 16.

Dans cet article, nous décrivons des procédures utilisant la conversion par catalyse enzymatique des produits chimiques (médicaments) pour enquêter sur leur puissance doit être activée en métabolites qui a modifié l’ADN (ADN de générer des adduits). Pour le couplage covalent ADN, la substance d’essai doit généralement être activé soit par réaction oxydante ou réductrice, selon médicaments individuels. Oxydante ou réductrice activation de produits chimiques testés est médiée par un système enzymatique P450-dépendants présent dans la fraction subcellulaire microsomique ou par réduction avec réductases présente aussi bien dans les microsomes (POR, NADH : cytochrome b5 réductase, enzymes P450) et dans les fractions subcellulaires cytosoliques cellulaires (NQO1, XO, AO, peroxydase). Métabolites réactifs par la suite se lient à l’ADN formant les ADN des adduits. Parce que les réactions fois oxydants et réductrices sont importantes pour activer plusieurs médicaments pour ces espèces réactives, les procédures expérimentales qui emploient le système enzymatique de l’oxydo-réduction sont décrites. En outre, les méthodes appropriées capables de détecter et de quantifier ces ADN adduits sont décrites en détail.

Deux procédures indépendantes afin de déterminer si le produit chimique à tester, activés par les systèmes enzymatiques, est lié à l’ADN sont recommandés : la technique P-post-marquage de 32et utilisant composé radioactif marqué (e.g., 3H ou 14 C). Pour le premier projet pilote, 32P-post-marquage test de dépistage est recommandé. La détermination de la teneur en ADN dans les solutions, précisément évalué, doit précéder les deux méthodes.

Les 32P-post-marquage technique utilise l’hydrolyse enzymatique de l’ADN modifié par des produits chimiques non radioactif (cancérogène/drogues) à 3´-phosphodeoxynucleosides, phosphorylation supplémentaire avec le phosphore radioactif (32P) à la 5´- OH position et la séparation des produits chimiques-désoxyribonucléosides adduits de désoxynucléotides (non modifiées) normal par chromatographie17 (Figure 1). ADN modifié par le composé chimique est hydrolysé par un mélange d’endonucléase nucléase micrococcique et exonucléase, appelée phosphodiestérase de rate. Le mélange de l’ADN hydrolysée contenant les deux normal (non modifié) et modifié les désoxyribonucléosides monophosphates-3´ réagit avec [γ -32P] ATP en présence du transporteur (non radioactif) ATP et T4-polynucléotide kinase à pH 9,5 à forme 5´- 323´ marquée P, 5´-bisphosphates (procédure « standard » dans la Figure 1). Le pH alcalin utilisé est capable de réduire au minimum l’activité enzymatique du T4-polynucléotide kinase à déphosphorylent désoxyribonucléosides 3´-monophosphates en position 3´. Séparation et résolution de 32P-étiqueté adduits de désoxynucléotides marqués qui ne sont pas modifiés par des produits chimiques est réalisée par échange d’anions multidirectionnel chromatographie sur couche mince (TLC) POLYÉTHYLÈNEIMINE (PEI), cellulose (Figure 2 ). Dans les étapes de la première et la deuxième d’élution (en direction de D1 et D2), étiqueté normal désoxynucléotides (non modifié), mais aussi [32P] phosphate est élué dès le début de la plaque de TLC-PEI-cellulose à l’aide de solutions de l’eau de l’électrolyte sur un petit morceau de par chromatographie papier appliqué sur le dessus de la plaque de TLC, tandis que les désoxynucléotides contenant des produits chimiques liés présentant des propriétés hydrophobes (cancérogène/drogue-adduits) sont maintenues au début de plaque PEI-cellulose à être plus résolu avec plusieurs systèmes de solvants différents dans des directions D3 et D4 (Figure 2). Localisation des adduits est effectuée par autoradiographie d’écran amélioré ; adduits le séparés sont détectés comme des taches foncées reconnaissables sur les films radiographiques. Les zones de taches sont excisés de la plaque et permettant de quantifier la radioactivité par scintillation en milieu liquide ou Cerenkov comptage. Un méthode qui a été adapté à la carte et de quantifier l’ADN-images au phosphore stockage adduits sur chromatogrammes détectés par les 32analyse post-marquage-P est maintenant également utilisé. 18 machine l’imageur instantanée est fréquemment utilisé pour une détection et quantification de l’ADN des adduits. Cette méthode fournit une sensibilité 10 - fois plus élevée pour la détection de 32P que la technique de l’écran amélioré autoradiographie19.

Quantités d’ADN adduits sont déterminés comme valeurs de parent adduit étiquetage (RAL), calculé à l’aide de l’équation (2) comme suit :

CPM. adduit de désoxynucléotides
RAL =---(2)
activité spécifique de 32P-ATP (au cpm. / pmol) x pmol désoxynucléotides

Les valeurs des RAL sont le ratio du taux de comptage des adduits désoxynucléotides sur les taux de comptage du total [adduits et normal (non modifiées) désoxynucléotides] désoxynucléotides20,21. Toutefois, ce calcul est fondé sur l’égalité étiquetage efficacités des adduits et désoxynucléotides normal22. La procédure classique (« standard ») des 32P-post-marquage technique est appropriée pour des adduits d’ADN différents (volumineux et/ou non volumineuses adduits), cependant, sa sensibilité n’est pas satisfaisante pour détecter les adduits trouvés en faibles quantités dans l’ADN. En utilisant cette procédure, le montant d’un adduit dans 10 désoxynucléotides7 non modifiés dans l’ADN (0,3 fmol adduit/µg ADN) est détectable.

Une variété de modifications de ce classique 32P-post-marquage de procédure ont été utilisés pour élever la sensibilité de la technique. Jusqu'à de 10 à 100 fois plus grande sensibilité du dosage des adduits de 32P-étiquetage a été réalisé en utilisant des niveaux limites de [γ -32P] ATP (la procédure intensification). 23 , 24 une procédure supplémentaire qui prévoie qu'une augmentation de la sensibilité de la méthode de P-post-marquage 32utilise une incubation de contenant de l’ADN digéré adduits avec la nucléase P1 (à partir de Penicillium citrinum)21 (Figure 1). Cette enzyme préfère déphosphorylent désoxyribonucléosides non modifié 3´-monophosphates, tandis que les désoxynucléotides liés produits chimiques (de nucléotides) sont essentiellement pas les substrats de cette enzyme. Par conséquent, désoxyribonucléosides déphosphorylées 3´-monophosphates (c.-à-d., désoxyribonucléosides) ne sont pas phosphorylés par T4-polynucléotide kinase de phosphate [32P] de γ -32P] ATP. Toutefois, certains des nucléotides où les produits chimiques sont liés (de désoxynucléotides), tels que les adduits arylamine substitués en C8 de désoxyguanosine, can bedephosphorylated par cette enzyme. En revanche, la plupart des autres adduits (p. ex., adduits substituée au N2 de désoxyguanosine) ne sont pas déphosphorylé par nucléase P1. Cette modification de 32P-post-marquage rend cette méthode beaucoup plus sensibles, augmentant sa sensibilité de plus de trois ordres de grandeur. En outre, cette version de 32P-post-marquage fournit une méthode où plus des quantités d’ADN (5-10 µg) et un excès de sans porteur ATP [γ - 32P] peut être utilisé.

Une autre méthode pour enrichir les adduits, décrite par Gupta25, utilise physico-chimiques adduits de propriétés des désoxyribonucléosides volumineux, qui peuvent être extraites en n-butanol en présence d’une phase transfert agent tétrabutylammonium chlorure (TBA) (Figure 1) avant [32P] phosphate étiquetage, tandis que désoxynucléotides non modifiées sont mal extraites de ce solvant organique. Cependant, moins hydrophobe adduits, composé d’exemple de désoxynucléotides modifié avec non-aromatique moitiés encombrants ou alkyle petit résidus, ne sont pas effectivement extraites avec n-butanol. Par conséquent, ils sont essentiellement indétectable lorsque sont analysés par cette modification des 32P-post-marquage méthode.

Les versions mentionnées précédemment de 32P-post-marquage augmentation de la sensibilité et la quantification de l’ADN des adduits énormément (jusqu'à trois ordres de grandeur), être capable de détecter un adduit par 109,10 normal les nucléotides (0.3 - 3 amol/µg d’ADN). Ces deux méthodes sont recommandées pour tester les produits chimiques pour leur efficacité à lier par liaison covalente à l’ADN et, par conséquent, elles sont décrites dans cet ouvrage en détails.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux règlements pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (311/1997, ministère de l’Agriculture, République tchèque), qui est en conformité avec la déclaration d’Helsinki.

1. isolement des Fractions de microsomes et cytosoliques hépatiques

  1. Préparer les fractions subcellulaires hépatiques (microsomes riches en enzymes P450 ou cytosol riche en réductases ou solubles peroxydases) des rats par simple centrifugation différentielle (105 000 x g).
    Remarque : Le pellet et le surnageant sont considérées comme des microsomes et cytosols, respectivement.
    1. Laver les échantillons de foie (1 à 10 g) deux fois avec un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 contenant 150 mM KCl mémoire tampon (buffer 1) (des volumes plus importants que le poids du tissu, c.-à-d. 10 fois 10-100 mL) et couper les tissus en petits morceaux (d’autour de la taille 2 x 2 mm).
    2. Homogénéiser les tissus en présence de cette mémoire tampon (> 3 mL/g de poids/volume) en homogénéisateur à 4 ° C pendant 5 min et jeter les morceaux non homogénéisé résiduelles du tissu de filtration à l’aide de papier filtrent. Centrifuger l’homogénat à 600 x g pendant 10 min à 4 ° C et transvaser le surnageant dans un autre tube de centrifugation.
    3. Re-homogénéiser le culot dans la mémoire tampon 1 (1 mL / 1 g de tissu), répétez l’étape 1.1.3. et jeter le culot. Centrifuger les surnageants regroupées à 15 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un autre tube de centrifugation.
    4. Centrifuger le surnageant à 105 000 x g pendant 60 min à 4 ° C. Récupérer le surnageant (cytosol) et rangez-la en aliquotes (1 à 10 mL) à-80 ° C. Caractériser le cytosol pour la quantité de protéine à l’aide de la méthode décrite par Bradford26.
    5. Resuspendre le culot dans un tampon phosphate de sodium 100 mM, pH 7,4 (> 2 mL/g de poids/volume), centrifuger à 105 000 x g pendant 60 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Re-homogénéiser le culot (microsomes) dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 contenant 150 mM de KCl et 20 % de glycérol (< 5 mL/g de poids/volume) en homogénéisateur à 4 ° C. Enregistrez les microsomes dans 0,5 - 1 mL parties aliquotes à-80 ° C. Caractériser les microsomes pour la teneur en protéines à l’aide de la méthode décrite par Bradford26.
    6. Déterminer la concentration du cytochrome P450 dans les microsomes.
      Remarque : La concentration des enzymes P450 dans les microsomes est mesurée comme décrit par Omura et Sato27, détermination de l’absorption du complexe de P450 réduite avec le monoxyde de carbone (CO). Monoxyde de carbone est un composé toxique et doit être manipulé avec précaution et sous une hotte.

2. les incubations de Test produits chimiques (substances cancérigènes/drogues) avec de l’ADN en présence de systèmes enzymatiques

  1. Incubation de test produits chimiques (substances cancérigènes/drogues) avec de l’ADN en présence des systèmes enzymatiques oxydatifs contenant des cytochromes P450
    1. Préparer des mélanges d’incubation contenant, dans un volume de 0,75 mL à 4 ° C, les composés suivants et systèmes enzymatiques.
      1. Mélanger un tampon phosphate 100 mM, pH 7,4, (0,375 mL) avec 10 mM NADPH ou système générateur de NADPH (10 mM MgCl2, 10 mM de D-glucose 6-phosphate, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-glucose 6-phosphate déshydrogénase) (75 µL).
      2. Ajouter dans les microsomes de ce mélange ou pure P450 recombinante dans bactosomes, qui sont les microsomes isolés des cellules d’insectes transfectées avec une construction de baculovirus contenant des ADNc des enzymes P450 recombinantes, 50 pmol P450 enzymes dans 50 µL microsomique ou supersomal préparations - fractions microsomiques hépatiques isolées en laboratoire ou d’une source commerciale.
      3. Ajouter l’ADN de thymus de veau 1 mg (0,3 mL de la solution - 3,3 mg/mL dans l’eau distillée) et agiter dans un agitateur vortex pour 5 s.
      4. Enfin, ajoutez 7,5 µL 0,1 mM ellipticine médicament dissous dans du DMSO et 42,5 µL d’eau pour atteindre un volume de milieu d’incubation de 0,75 mL distillée. Utilisation produits chimiques marquées avec 3H ou 14C ou produits chimiques non étiquetés, selon la procédure de détection de l’ADN des adduits.
      5. Agiter dans un agitateur vortex pendant 5 s. Incuber dans des tubes ouverts à 37 ° C pendant 30-60 min.
      6. Aussi préparer deux incubations de contrôle de la même façon, mais (i) sans système d’activation (échantillons microsomales) ou (ii) avec elle, mais sans la substance d’essai.
  2. Incubations de test produits chimiques (substances cancérigènes/drogues) avec de l’ADN en présence de systèmes enzymatiques réductrices
    1. Préparer des mélanges d’incubation contenant, dans un volume de 0,75 mL à 4 ° C, les composés suivants et systèmes enzymatiques.
      1. À 4 ° C, mélanger 100 mM Tris-HCl tampon, pH 7,4, contenant 0,2 % Tween 20, (0,375 mL), solution de cofacteur de l’enzyme réductrice NQO1 (NADPH) 10 mM (75 µL), la fraction cytosolique (fractions cytosoliques hépatiques - isolées en laboratoire ou dans le cas à l’aide de la cytosolique fractions isolées de donneurs humains individuels, qu'ils ont été extraites de la source commerciale contenant 1 mg de protéine (50 µL)).
      2. Ajouter l’ADN de thymus de veau 1 mg (0,2 mL de la solution - 3,3 mg/mL d’eau distillée) et agiter dans un agitateur pendant 5 s.
      3. Enfin, ajoutez 7,5 µL 0,1 mM produit chimique à tester (dissous dans l’eau distillée, méthanol, éthanol ou le DMSO, selon la solubilité du composé) et 42,5 µL distillé l’eau pour atteindre un volume de 0,75 mL pour le milieu d’incubation. Utilisation produits chimiques marquées avec 3H ou 14C ou produits chimiques non étiquetés, selon la procédure de détection de l’ADN des adduits (voir ci-dessous).
      4. Purger le mélange réactionnel à l’argon pour 1 min. agiter dans un agitateur pendant 5 s. Incuber dans des tubes fermés à 37 ° C pendant 30-60 min.
      5. Aussi préparer deux incubations de contrôle de la même façon, mais (i) sans système d’activation (fractions cytosoliques) ou (ii) avec elle, mais sans les substances chimiques d’essai.
  3. Extraction des mélanges d’incubation avec des solvants organiques pour enlever l’excès de substances chimiques d’essai
    1. Mélanger le mélange d’incubation dans un tube à essai avec un chapeau avec le même volume d’acétate d’éthyle (éther diéthylique ou hexane) en ajoutant ces solvants. Agiter le contenu du tube dans un shaker jusqu'à une émulsion.
    2. Spin (3 min) à 1 600 g dans une centrifugeuse à température ambiante. Si les phases organiques et aqueuses ne sont pas correctement séparés, tourner une fois de plus pour une plus longue période ou à une plus grande vitesse de centrifugation.
    3. Supprimer la phase organique supérieure collecte avec une pipette. Si de petits volumes (< 400 µL) sont utilisés, utiliser une pipette automatique munie d’un embout adapté. Mettre de côté cette phase organique.
    4. Répétez les étapes 2.3.1., 2.3.2. et 2.3.3. Supprimer des solvants organiques résiduelles par un courant d’azote gazeux (au moins 5-10 min d’enlèvement sont nécessaires).
  4. Isolement de l’ADN d’incubations
    1. Extraction d’ADN à partir des solutions avec du phénol/chloroforme et sa précipitation à l’éthanol
      1. Éliminer les protéines pour isoler l’ADN de mélanges d’incubation en extrayant des protéines de solutions d’ADN avec le phénol, phénol/chloroforme (1:1) et de chloroforme par la procédure indiquée ci-dessous.
      2. Combiner le mélange de l’incubation avec la même quantité de phénol ou phénol/chloroforme (1:1) dans un faucon ou tube Eppendorf avec une casquette. Agiter le mélange jusqu'à ce qu’une forme d’émulsion.
      3. Spin (3 min) à 1 600 g dans une centrifugeuse à température ambiante. Si les phases organiques et aqueuses ne sont pas correctement séparés, tourner une fois de plus pour une plus longue période ou à une plus grande vitesse de centrifugation.
      4. Transférer la phase supérieure de l’eau avec une pipette dans un nouveau tube en polypropylène. Si de petits volumes (< 400 µL) sont utilisés, utiliser une pipette automatique muni d’un embout adapté. Supprimer l’interface de protéines ainsi que la phase organique.
      5. Combiner la phase aqueuse supérieure avec la même quantité d’un mélange de phénol et de chloroforme (1:1). Reproduire les étapes 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. Combiner la phase aqueuse supérieure avec la même quantité de chloroforme et répétez les opérations 2.4.1.2. -2.4.1.4. Récupérer l’ADN par précipitation et 2 volumes d’éthanol froid (-20 ° C). Déterminer le volume de la solution d’ADN.
      7. Adapter la concentration de cations monovalents par addition de chlorure de sodium 5 M pour la finale des concentrations de 0,1 M. remuez vigoureusement. Combinez et 2 volumes d’éthanol froid (-20 ° C) et mélangez bien. Laisser refroidir à-20° C.
      8. Conserver à-20 ° C jusqu'à ce que l’ADN est précipité. Lorsque l’ADN est fragmenté au cours de l’incubation (e.g., par la formation de radicaux d’oxygène au cours de la réaction d’activation enzymatique) ou pendant la procédure d’isolement à la taille de l’ADN qui est petit (< 1 Ko) ou lorsque l’ADN est présent en petites quantités (< 0,1 mg / mL), le temps de refroidissement doit être augmenté et la température a baissé à-70 ° C.
      9. Spin (10 min) à 1 600 g à 0 ° C dans une centrifugeuse. Si l’ADN est présent à des concentrations faibles ou sous forme de petits fragments, tournez une fois de plus pendant une période plus longue (30 min). Jeter le surnageant.
      10. Pour enlever les solutés (ou les traces résiduelles du test chimique) qui peuvent être présentes dans l’ADN précipité, lavez ADN avec 70 % d’éthanol et l’éther diéthylique. Lavage a précipité l’ADN avec le froid (-20 ° C) l’éthanol à 70 %. Spin (10 min) à 1 600 g à 0 ° C dans une centrifugeuse. Jeter le surnageant.
      11. Répétez l’étape 2.4.1.10. Lavage a précipité l’ADN avec le froid (-20 ° C) l’éthanol à 70 %. Spin (10 min) à 1 600 g à 0 ° C dans une centrifugeuse. Jeter le surnageant.
      12. Répétez l’étape 2.4.1.10. Placer le tube dans un État vertical sur du papier absorbant pour éliminer le surnageant résiduel. Laver le culot d’ADN en ajoutant 1 mL d’éther diéthylique pour éliminer les résidus éventuels du test chimique de l’ADN isolé. Spin (10 min) à 1 600 g à 0 ° C dans une centrifugeuse. Jeter le surnageant.
      13. Dissoudre le culot d’ADN dans le volume approprié (habituellement dans le 100-400 µL d’atteindre une concentration d’ADN de 0,5 - 1 µg/µL) d’eau distillée (ou 0,15 mM 1,5 mM et citrate de sodium chlorure de sodium). La solution d’ADN peut reposer toute la nuit à 4 ° C, ou peut être chauffée à 37 ° C pendant 10 à 30 min augmenter la dissolution de l’ADN.
      14. Avant de la ranger, séparer l’ADN en petites parties aliquotes (10-20 µL), car répétés de gel et de dégel des solutions d’ADN pourrait entraîner une diminution d’adduit concentrations. Stocker à-80 ° C ou plus froid.
        Remarque : La détermination spectrophotométrique de l’ADN : la méthode simple et précise, qui est largement utilisée pour mesurer la quantité d’ADN dans une préparation si l’échantillon est pur (c'est-à-diresans d’importantes quantités de contaminants tels que des protéines, de phénol ou autre acides nucléiques), est une mesure spectrophotométrique de la quantité d’ADN de UV irradiation absorbée par ces bases (reportez-vous aux procédures décrites précédemment)28.
  5. Procédures pour la détection de l’ADN de la formation d’adduits
    1. 32 Analyse post-marquage-P
      NOTE : L’hydrolyse de l’ADN utilise l’hydrolysat préparé à ce stade de l’analyse des adduits (2.5.1.) ainsi que de désoxynucléotides (non modifiées) normal (2.5.7.).
      1. Dissoudre une nucléase micrococcique (MN) dans l’eau à une concentration de ~ 450 unités (U) / mL. Dialyser contre l’eau distillée et ajuster à 300 U/mL. Dialyser solution phosphodiestérase (SPD) rate et ajuster à 4 U/mL.
      2. Mélanger MN et SPD à concentrations finales 150 mU/µL MN et 2,5 mU/µL SPD (solution MN/SPD). Prenez la solution d’ADN contenant 12,5 µg et évaporer à sec dans un évaporateur. Dissoudre dans 6,5 µL d’eau distillée.
      3. Ajouter 5,0 µL de solution de MN/SPD (concentration finale de MN est 60 mU/µL, concentration finale du SPD est de 1 mU/µL) et 1,0 µL de tampon de digestion (concentration finale de succinate sodique est de 20 mM, concentration finale de CaCl2 est de 8 mM). Le volume final du mélange est 12,5 µL. Mix et permettre des réactions pendant 3 h à 37 ° C.
      4. Enlevez 2,5 µL (transfert sur un autre tube) pour davantage de dilution et l’analyse de désoxynucléotides non modifié (2.5.7.)
    2. Procédure d’enrichissement nucléase P1
      1. Ajouter à la restants 10,0 µL d’hydrolysat, tampon d’acétate µL sodium 0,65 (concentration finale, 40 mM), 0,65 µL de solution de2 ZnCl (concentration finale de 0,1 mM), 1,25 µL de solution de NP1 (concentration finale, 0,385 µg/µL) et 0,45 µL d’eau distillée. Le volume final du mélange est 13 µL.
      2. Laissez le mélange agir pendant 30 min à 37 ° C et terminez la réaction avec l’ajout de 3 µL de solution de Tris.
    3. n-procédure d’enrichissement de Butanol
      1. Ajouter le restant 10,0 µL d’hydrolysat de l’ADN, 215 µL de solution de formiate d’ammonium 11,6 mM, pH 3,5 et 25 µL 10 mM TBA chlorure solution. Extrait avec 250 µL n-butanol (saturé d’eau) en mélangeant vigoureusement. Spin (3 min) à 1 600 g pour séparer les couches et décoller le haut n-couche de butanol. Extraire une fois de plus avec 250 µL n-butanol (saturé d’eau), spin, enlever la partie supérieure n-butanol couche et se combinent avec l’ancien extrait.
      2. Ajouter 400 µL d’eau (imprégnée de n-butanol) à cet extrait et mélanger vigoureusement. Tourner à couches distinctes et de supprimer la couche aqueuse inférieure. Répétez cette procédure de lavage à l’aide de 400 µL d’eau (imprégnée de n-butanol). Ajouter 3 µL de 250 mM solution Tris-HCl pH 9.5, dans le n-couche de butanol. Évaporer n-butanol à sec dans un évaporateur à température ambiante.
      3. Dissoudre le résidu dans 100 µL n-butanol, évaporer à sec à nouveau et dissoudre le résidu dans 16,0 µL d’eau.
    4. Étiquetage des adduits
      1. Ajouter 1 µL de solution tampon de bicine (tampon de marquage) et 4,5 µL du mélange contenant 100 µCi [γ -32P] ATP, 45 pmol d’ATP froid et 10,0 U de T4-PNK (T4-phosphonucleotide kinase) à 16,0 µL de solution de mélange d’enrichissement NP1 ou butanol. Les concentrations finales des réactifs sont les suivantes : bicine de 20 mM, 10 mM MgCl2, dithiotreitol 10 mM, la spermidine 0,5 mM et 0,5 U/µL T4-PNK, ATP de 3 µM. Le volume total du mélange est 20 µL.
      2. Laissez le mélange agir pendant 30 min à température ambiante. S’appliquent à l’ensemble de l’échantillon (i.e. 20 µL) sur la plaque de PEI-cellulose TLC (2.5.6.).
    5. Évaluation de l’efficacité de NP1 ou n -butanol, amélioration des procédures
      1. Laver le fond du tube avec de l’eau 50 µL. Mélanger vigoureusement pendant 30 s et l’essorage (1 min) à 1 600 g dans une centrifugeuse pour y établir n’est aucune contamination sur le couvercle. Spot 5 µL sur une plaque de PEI-cellulose TLC (20 x 20 cm). Chromatographier en utilisant une solution de 280 mM (NH4)2SO4 et 50 mM NaH2PO4, pH 6,8.
    6. Séparation de TLC de désoxynucléotides adduits
      1. Prélaver les plaques TLC avec de l’eau distillée. Il est conseillé surtout des plats faits maison.
        NOTE : Ce lavage doit être effectué pour enlever la couleur jaune de plaques, une couleur qui peut élever le fond, en particulier sur le front du solvant.
      2. Repérer l’ensemble de l’échantillon sur la plaque de PEI-cellulose TLC et commencez à chromatographie (2.5.4.) ; nettoyage des adduits est réalisée en mettant au point la plaque dans le sens de D1 et D2 (Figure 2).
      3. Mettre la plaque dans une direction de D1 (Figure 2). Tampon de phosphate de sodium utilisation 1,7 M, pH 6,8, pour s’assurer que les adduits de l’ADN sont encore au début de la plaque de TLC. Par analogie, développer la plaque, en direction de la D2 à l’aide de ce tampon. Pour plus d’informations sur les tampons possibles pour les procédures, voir les solutions décrites pour la résolution de plusieurs types d’adduits20,28.
        Remarque : Le développement de la plaque, en direction de D2 peut être omis.
      4. Laver la plaque dans l’eau désionisée après chromatographie pendant environ 5 minutes dans deux bains consécutifs. Ensuite, sécher les plaques.
      5. Développer les plaques en D3 et D4 direction à l’aide de 3,5 M au lithium formiate tampon pH 3.5, contenant 0,5 et 8,5 M urée pour D3 direction M Tris-HCl buffer, pH 8,0, contenant de l’urée LiCl et 8,5 M de 0,8 M pour D4 direction (Figure 2). Les solvants doivent être ajustés pour développer l’adduit de taches sur la plaque de TLC. Pour plus d’informations sur les tampons possibles pour les procédures de développement D3 et D4, voir les solutions décrites pour la résolution de plusieurs types d’adduits23,24,25,28.
      6. Pour éviter tout problème en D4, après mise au point dans une direction de D4 et un lavage à l’eau, mettre les plaques (le long de D4) à 1,7 M de phosphate de sodium, pH 6.0 (habituellement assignés comme développement Direction D5), au sommet d’une mèche de papier (12 x 11,5 cm).
        Remarque : La D5 direction peut aussi être omise. Dans ce cas, il est nécessaire d’ouvrir le réservoir de TLC lorsque le solvant a atteint le sommet de la TLC et permettre une course jusqu'à 60 min. Cette méthode est encore mieux que l’ajout d’une mèche (la méthode couramment utilisée dans de nombreux laboratoires pour supprimer tous les problèmes en D4).
    7. Quantification de désoxynucléotides (non modifiées) normale après hydrolyse
      1. Diluer une aliquote de l’hydrolysat (de 2.5.1. décrivant l’hydrolyse de l’ADN) avec de l’eau distillée, (i.e., 2,5 µL du mélange de digestion 2.5.1. réglé à 250 µL et 10 µL de cette solution réglé à 150 µL).
      2. Prenez un 5 µL (10 pmol normal désoxynucléotides) aliquote du présent recueil, ajoutez 2,5 µL de tampon de 10 mM Tris-HCl, pH 9,0 et étiquette comme dans 2.5.4. (le volume final du mélange est 10 µL). Laisser pour réagir pendant 30 min à température ambiante.
      3. Prélever un 4 µL aliquote du mélange et diluer jusqu'à 750 µL avec 10 mM Tris-HCl, pH 9,0. Mix et essorage à mettre en place qu'il n’y a pas de contamination du couvercle. Appliquer 5 µL sur une plaque de PEI-cellulose TLC. Développer la plaque TLC dans une solution de 280 mM (NH4)2SO4 et 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. Laisser pour sécher après TLC.
      4. Utilisez l’autoradiographie exécutée pendant environ 45 min à température ambiante pour localiser les quatre désoxyribonucléosides non modifiées bis-phosphates. Couper le spot pour la quantification par scintillation en milieu liquide ou Cerenkov comptage.
    8. Calcul du parent adduit étiquetage (RAL)
      1. Déterminer les valeurs des comptages dans les taches de l’adduit et comtes dans la partie aliquote d’étiquetés non modifiées désoxynucléotides (normal).
        Remarque : Ces derniers doivent être déterminés à 180 000 chefs d’accusation moins de matières que le premier, un chiffre qui est le facteur de conversion à appliquer au comte de non modifiées désoxynucléotides (normal) pour évaluer les valeurs RAL des niveaux d’adduit. RAL de l’ADN des adduits est calculée selon l’équation (2) ci-dessus.
    9. Détection de liaison de l’essai cancérogènes ou de drogues à l’ADN à l’aide de médicaments radioactifs marqués
      1. Évaluer les 3H ou 14C radioactivité d’ADN modifié avec des produits chimiques par scintillation liquide.
      2. Ajouter 10 à 50 µL de solution d’ADN à 3 mL d’une solution de scintillation dans le flacon à scintillation. Bien mélanger. Mesurer la radioactivité à l’aide du compteur à scintillation.

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Résultats

À l’aide de protocoles décrits ici pour l’utilisation de l’activation par catalyse enzymatique (c.-à-d., P450, peroxydase, réductase) pour enquêter sur la puissance des produits chimiques (substances cancérigènes/drogues) pour être métabolisé en intermédiaires, ce qui entraîne leur covalente liaison à l’ADN (génération de l’ADN des adduits), nous avons pu résoudre (i) un nouveau mécanisme de l’action pharmacologique de l’agent anticancéreux ellipticine (pour une revue, voir

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Discussion

Dans cet article, il est démontré une méthodologie largement accessible pour étudier l’activité des produits chimiques pour être bioactivated à des intermédiaires métaboliques, aboutissant à la génération de l’ADN covalent des adduits. Il s’agit d’une question cruciale, parce que l’évaluation de la puissance des produits chimiques environnementaux ou de drogues de leur activation enzymatique en métabolites générant ADN covalent adduits est un domaine important dans le développement du cancer et son traitement. La modific...

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Déclarations de divulgation

L’auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par la Fondation tchèque pour la Science (GACR, subvention 17-12816S).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
TrisSigma-Aldrich252859
Chlorure de potassiumSigma-AldrichP9541
Acétate de sodiumSigma-AldrichS2889
PhénolRoth0032.8
Phénol/Chloroforme/IsoamylalcoholRothA156.1
ÉthanolPenta70390-11000
ADN du thymus du veauSigma-AldrichD4522
NADHSigma-AldrichN7004
NADP+Sigma-AldrichN5755
NADPHSigma-AldrichN7505
D-glucose 6-phosphateSigma-Aldrich7647001
D-glucose 6-phosphate déshydrogénaseSigma-AldrichG6378
SupersomesCorning Gentest456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207 456202
Microsomes hépatiques humainsCorning Gentest452172
Tween 20Sigma-AldrichP1379
HypoxanthineSigma-Aldrich77662
2-HydroxypyrimidineSigma-AldrichH56800
Acétate d’éthyleSigma-Aldrich437549
Éther diéthyliqueSigma-Aldrich179272
Nucléase micrococcique de Staphylococcus aureusSigma-AldrichN3755
Phosphodiestérase de la rate du veau, type IICalbiochem524711
Nucléase P1 de Penicillium citrinumSigma-AldrichN8630
BicineSigma-Aldrich163791
DL-DithiotreitolSigma-AldrichD0632
SpermidineSigma-AldrichS2626
Chlorure de tétrabutylammoniumSigma-Aldrich86870
n-ButanolSigma-Aldrich437603
T4-polynucléotide kinaseUSB Corp70031Y
[&gamma ;-32P]ATPHartman Analytic GmbHFP-201
Plaques TLC en cellulose imprégnée de PEIMacherey-Nagel801053
Packard Instant Imager A202400PackardG120337
EllipticineSigma-Aldrich285730
3-Nitrobenzanthronepréparé (synthétisé) comme indiqué dans la réf. 40

Références

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