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Two-photon Imaging intravitale des leucocytes au cours de la réponse immunitaire dans le foie de souris traitées Lipopolysaccharide

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DOI :

10.3791/57191

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6 février 2018

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1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous avons mis en place un nouveau protocole chirurgical pour l’imagerie de deux photons de foie de souris vivantes à invasion minimale. Avec cette technique, nous avons identifié la structure détaillée du foie au cours de l’endotoxémie induite par le lipopolysaccharide. Nous prévoyons que cette méthode peut être utilisée pour déterminer l’efficacité de divers traitements de réactifs pour la migration des leucocytes hépatique.

Résumé

Septicémie est une infection grave qui peut entraîner la défaillance d’organes et tissus des dommages. Bien que le taux de mortalité et de morbidité associée à une septicémie sont extrêmement élevé, non direct traitement ou mécanisme axés sur l’orgue a été examinée en détail en temps réel. Le foie est l’organe clé qui gère les toxines et les infections dans le corps humain. Dans les présentes, visait à effectuer intravitale imagerie du foie de souris après induction de l’endotoxémie afin de suivre la motilité des cellules immunitaires, tels que les neutrophiles et les macrophages capsulaires du foie (LCMs). En conséquence, nous avons conçu une nouvelle méthode chirurgicale pour l’exposition du foie avec la chirurgie mini-invasive. Souris ont été injectées par voie intrapéritonéale avec lipopolysaccharide (LPS), une endotoxine commun. À l’aide de notre nouvelle approche chirurgicale pour l’exposition et l’imagerie intravitale du recrutement du foie, que nous avons constaté que les neutrophiles des souris en protéine fluorescente LPS-traités LysM-verte (GFP) foie de souris a été augmenté par rapport à celle en tampon phosphate imprégnées d’une solution saline foie. Après traitement de LPS, le nombre de neutrophiles augmente sensiblement avec le temps. En outre, à l’aide de souris CX3Cr1-GFP, nous avons visualisé avec succès macrophages résidents du foie appelées LCMs. Donc, pour étudier l’efficacité de nouveaux réactifs pour contrôler la mobilité immunitaire in vivo, déterminer la motilité et la morphologie des neutrophiles et LCMs dans le foie peut nous permettent d’identifier un effet thérapeutique orgue échec et tissus des dommages causés par activation des leucocytes en septicémie.

Introduction

Le foie est l’organe métabolique majeur chez les mammifères ; Il agit comme une tour de contrôle de l’énergie, hormones et désintoxication1. En raison de son importance, les chercheurs ont mené plusieurs expériences in vitro et in vivo afin d’élucider les changements dans le foie lors d’une inflammation. La microscopie intravitale a été utilisée pour capturer des images en direct de la foie2 . En effet, foie de différentes méthodes d’imagerie ont été introduit2,3,4,5,6. Toutefois, afin de développer une approche chirurgicale plus simplifiée et parvenir à la stabilisation de l’organe cible et les cellules immunitaires, nous avons conçu un protocole simple qui peut guider les chercheurs afin de minimiser leur effort pour l’imagerie intravitale.

Dans cette étude, nous avons introduit un stable et roman chambre d’imagerie et la technique chirurgicale qui pourrait servir à réduire les saignements et de possibles infections. Nous avons confirmé que le foie est demeurée intact pendant plus de 2 h. Avec cette méthode, nous avons identifié avec succès morphologies de LCMs7 et neutrophiles en vertu de l’État septique. Car cette méthode réduit au minimum les facteurs confondants physiques et biologiques telles que l’inflammation tremblotante et inattendue au cours de l’intervention chirurgicale, nous prévoyons que cette méthode pourrait être utilisée pour observer les réactions aiguës des cellules immunitaires dans le foie en réponse à réactifs comme LPS.

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Protocole

Toutes les procédures ont été menées conformément aux directives de l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Yonsei University College of Medicine, Corée. LysM-vert fluorescent protein (GFP ; gfp / +) souris8 et CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 souris à 8-12 semaines d’âge ont été utilisés pour l’imagerie intravitale. Tous les instruments chirurgicaux ont été stérilisés à l’autoclave et désinfecté avec de l’alcool 70 %.

1. conçu souris chambre avec outils à l’appui de l’imagerie hépatique

  1. Foie de souris design chambre d’imagerie
    1. Faire une chambre aux dimensions suivantes pour le foie de souris, d’imagerie (Figure 1) : chambre intérieure (120 mm longueur × largeur 160 mm × 30 mm hauteur), chambre extérieure (100 mm longueur × largeur 100 mm × 24 mm hauteur), boulons (Ф 3 mm × 30 mm de hauteur), noix (Ф 4 mm) et noix en forme d’aile (Ф 4 mm).
    2. Mesurer l’agent de durcissement et élastomère en rapport de 1:9 pour un total de 120 g de silicone.
    3. Mettre le mélange de silicone liquide dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL et mélanger bien. Puis mettre le ballon dans un dessicateur et éliminez les bulles d’air pendant environ 1 h sous vide par l’intermédiaire de la pompe.
    4. Verser le mélange de silicone liquide dans une chambre de souris personnalisés jusqu'à hauteur de 10 mm et le laisser guérir pendant quelques jours (Figure 1 a).
  2. Préparation des lames de la couverture et le foie fixation lit
    1. Sur la structure métallique, fixez le couvercle en verre avec de la colle silicone. Laisser sécher pendant 1 jour (Figure 1 b).
    2. Pour effectivement tenir l’eau distillée pour l’objectif d’immersion de l’eau, une structure semi-permanente bloquant l’eau est indispensable. Faire 1 mm arrondi colle silicone et durcir pendant la nuit.
    3. Mélanger la polymérisation agent et élastomère de base et puis versez-la dans une assiette de 6 puits à une hauteur d’environ 8-10 mm. effectuer le processus de durcissement comme décrit dans 1.1.2-1.1.4.

2. préparation du LPS

  1. Préparer stérile 1 × tampon phosphate salin (PBS), afin de diluer la poudre de LPS de Salmonella enterica sérotype enteritidis. (1 × PBS : 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4).
  2. Préchauffer le PBS au bain-marie à 37 ° C, puis ouvrez le flacon de poudre de LPS (25 mg) avec soin.
  3. À l’aide d’une aide de la pipette, versez du PBS stérile (5 mL) dans le flacon de poudre de LPS et remuer doucement ou suspendre la solution pour préparer la solution.
    Remarque : Après que poudre LPS est liquéfié, agitation sévère peut provoquer des bulles. Éviter de faire des bulles pour minimiser la perte lors de parties aliquotes dans des tubes de 1,5 mL.
  4. Stocker la solution mère de LPS à −20 ° C et le diluer dans une solution de LPS 1 mg/mL pour injection.
  5. Injecter la solution de LPS 1 mg/mL (20 mg/kg) dans le péritoine d’une souris non anesthésiés à l’aide d’une seringue de 1 mL. Pour les animaux témoins, injecter le même volume de PBS.
  6. Attendez pendant 2 h pour une réponse inflammatoire suffisante.

3. préparation de Dextran Texas-rouge pour colorer les vaisseaux sanguins

  1. Préparer deux tubes coniques 15 mL et 10 mL de PBS stérile.
  2. Diluer la poudre rouge-Texas Dextran (25 mg) dans 3 mL de PBS et mélanger bien. Transvaser le mélange dans un tube conique 15 mL.
  3. Transférer le PBS restant (7 mL) au tube conique 15 mL contenant le mélange de dextran (3 mL).
  4. Connecter une seringue-filtre de 0,45 µm à la pointe d’une seringue de 10 mL. Le filtre de seringue devrait remplacer l’aiguille.
  5. Filtrer le mélange de dextran (10 mL). Presser uniformément la seringue afin d’éviter tout déversement.
  6. Pipeter 500 µL de solution de dextran de 2,5 mg/mL dans le tube de 1,5 mL de lumière-bloqué et stockez-le à −20 ° C. Une fois décongelé, conserver à 4° C.

4. processus chirurgical

  1. Désinfecter la table de chirurgie et de tous les instruments à l’aide d’alcool à 70 % avant la chirurgie. Ensuite, définir les outils pour la chirurgie du foie et ajuster la plaque chauffante à 37 ° C (Figure 2 a, B).
  2. Pour l’anesthésie, par voie intrapéritonéale injecter les souris à 30 mg/kg de tiletamine/zolazepam et 10 mg/kg de xylazine. Ces solutions peuvent être mélangées et diluées dans du PBS pour injection simultanée. Confirmer anesthetization en appuyant doucement sur la pointe de la souris.  Procéder étape suivante lorsqu’il n’y a aucun réflexe.
  3. Appliquez la petite quantité de pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement de la rétine de souris.
  4. Enlever les poils autour de la zone de l’abdomen à l’aide de la crème dépilatoire (Figure 2).
  5. Injecter 200 µL de solution de Texas-Red Dextran (concentration de 2,5 mg/mL) via la veine caudale ou rétro-orbitaire injection à l’aide d’une seringue à insuline (Figure 2D).
  6. Délimiter la zone sous-costal droit avec un marqueur. La ligne devrait provenir de la processus xiphoïde jusqu’au bout de la côte. Couper l’épiderme avec pinces et ciseaux (Figure 2E, F).
  7. Ouvrir la cavité abdominale à l’aide de micro-ciseaux et pinces et exposer le foie avec soin. Le lobe latéral gauche devrait être déployé à l’aide de coton-tiges (Figure 2, H).
  8. Versez 500 µL de PBS stérile sur la cavité abdominale pour prévenir le dessèchement du foie.
  9. Placez votre souris dans la position droite anti-escarres dans une chambre spécialement conçus et appliquez une petite quantité de colle tissu jusqu’au lit de silicium. Puis, soigneusement attacher le foie à l’aide de coton-tiges (Figure 2I).
    Remarque : Le tissu hépatique étant extrêmement friable, ne pas mécaniquement tirer sur le foie. Doucement il étaler avec des cotons-tiges.
  10. Quelques secondes plus tard, mouiller le foie avec 500 µL de PBS stérile pour éviter le dessèchement du foie. Placer le cadre métallique sur le foie et fixez-le fermement avec les écrous (Figure 2J).

5. intravitale imagerie du foie avec la microscopie biphotonique

  1. Exécuter le logiciel ZEN (Carl Zeiss) pour allumer l’appareil, définissez la longueur d’onde 880 nm, et vert et rouge canaux. Ajuster la puissance du laser selon l’intensité de fluorescence (Figure 3 a). Informations relatives au filtre d’émission est la suivante : vert/Alexa488, 500 à 550 nm et rouge/Alexa 555, 575-610 nm.
  2. Placer la chambre sur la scène d’imagerie et le 20 X objectif immersion dans l’eau à proximité de la lamelle couvre-objet.
  3. Fixer le radiateur de caoutchouc de silicone sous le corps de la souris pour maintenir sa température corporelle (Figure 3 b).
  4. Déposer 500 µL d’eau distillée sur le cadre métallique et puis tirez le porte-objectif proche du foie (Figure 3).
  5. Ajuster la mise au point et déterminer la profondeur et l’heure de la zone d’imagerie.
  6. Imagerie de la conduite.
  7. Pour l’imagerie à long terme, injecter une demi-dose de mélange tiletamine/zolazepam et xylazine chaque heure pendant la formation image. Maintenir la température du corps des souris à 37 ° C est indispensable pendant cette étape. Gardez toujours sur le œil à la souris, puisque anesthetization heure diffère de chaque souris.
    Remarque : Cette méthode n’est pas adaptée pour la récupération après la chirurgie et d’imagerie. Sur le plan éthique, nous sacrifions la souris immédiatement après la chirurgie.
  8. Vérifier les réflexes pédales pour chaque 30 min pour anesthetization stable.

6. analyse de données

  1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données Volocity, puis importez les données brutes dans la bibliothèque dans le logiciel.
  2. Éliminer le bruit de l’image en fonction de la situation et prendre un instantané.
    Remarque : Pour obtenir des images lisse, utilisez le filtre « Fine » ou « Médian ». En outre, utiliser la fonctionnalité « Amélioration du contraste » pour faire des images sombres ou floues plus claires.
  3. Assembler les articles édités à 100 % et l’exportation des fichiers JPEG ou TIFF pour les clichés et les fichiers AVI pour les films.

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Résultats

Une chambre d’imagerie simple et très stable a été conçue. Le fond de chambre était recouvert de silicone, empêchant le glissement du corps de la souris et des organes. En outre, parce que le silicium a une quantité suffisante de l’élasticité, il ne pouvait empêcher attendue des dommages induits par la pression de la lame de la couverture (Figure 1 a, C). Deuxièmement, tissu résistant colle (liaison Vet) a été appliquée afin de corriger le fo...

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Discussion

Le foie a été activement étudié par de nombreux groupes3,10, en raison de l’importance de sa fonction. Par exemple, Heymann et coll. a proposé une méthode délicate à l’aide de gel d’agarose. Bien que cette méthode s’est avérée pour être très précis, le réglage de l’agarose prend du temps. Toutefois, avec notre méthodologie, toutes les procédures pourraient être effectuées dans les 30 minutes, réduisant au minimum les autres facteurs de confusion. Deuxièmement, le...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Cette étude a été financée par une subvention de la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le gouvernement de la Corée (MSIP ; subvention no 2016R1A2B4008199 à Y-M. H.) et le ministère de la santé et du bien-être social, République de Corée (numéro de licence : HI14C1324).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chambre conçue sur mesureLive Cell InstrumentsTaille sur mesure
Lame de couvercle en métalCell InstrumentsTaille sur mesure
Verre de couvertureMicroscopie électronique Sciences#72204-03
Sylgard 184 Kit d’élastomère de siliconeDow Corning
Erlenmeyer flaskDURAN21 216 36
Plaque de culture cellulaire (type plat)HYUNDAI Micro Co.H31006
DessiccateurADARSH55204
High Q BOND SE 5 mLBJM LABPour réaliser barrage semi-permanent
Flexible Caoutchouc de silicone ChauffantsOmegaSRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
Alimentation DCToyotechDP30-03A
Salineau phosphate Fait maison
Lipopolysaccharides (LPS) de Salmonella enteria sérotype enteritidisSigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 mL Polypropylène
haute clarté Tube conique		FALCON14-959-49B
0.45 &mu ; Filtre m (Filtre à seringue Minisart)Sartorius16555K
Micro tube de 1,5 ml, ambréAxygenMCT-150-XPour seringue bloquant la lumière
1 mLVaccin coréenKV-S01
Seringue de 3 mLVaccin coréenKV-S03
Seringue de 10 mlVaccin coréenKV-S10
Seringue à insuline de 0,3 mlBecton Dickinson324900
Crème dépilatoire 100 mLBody natur
Coton-tigeABDI
Zoletil 50 5 mLVirbac
Rompun 10 mLBayer
Plaque chauffanteLive Cell InstrumentsPH-S-10Contrôleur DC sur mesure
Live Cell InstrumentsCU-301
Microdéssection CiseauxHarvard Apparatus72-5418
CiseauxRobozRS-5882
PinceRobozRS-5137
Vet bond3M1469SB
ZEN software (Black Edition)Carl ZeissProgramme pour LSM 7 MP
LSM 7 MPCarl Zeiss
VolocitéPerkinProgramme d’analyse d’Elmer
Live tamponnée de

Références

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Mots-clés

Motilit des leucocytesr ponse immunitaire h patiquerecrutement des neutrophilesmacrophages capsulaires h patiquesfoie de souris trait au LPSanalyse par imagerie intravitalemicroscopie fluorescenceexposition chirurgicale du foiemod le de choc septique

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