Quantification des protéines spécifiques au site Lysine acétylation et stoechiométrie Succinylation spectrométrie de masse indépendante des données Acquisition

Résumé

Nous présentons ici la quantification objective des protéines spécifiques au site acétylation et/ou succinylation occupation (stoechiométrie) un proteome ensemble grâce à une analyse logométrique de modifications endogènes aux modifications introduites après quantitative acylation chimique utilisant des anhydrides stables isotopes marqués. En combinaison avec la spectrométrie de masse sensibles acquisition indépendante des données, mesures d’occupation de site précis sont obtenus.

Résumé

Modification post-traductionnelle (PTM) des résidus lysine protéiques par N_Ɛ- acylation induit des changements structurels qui peuvent réguler dynamiquement les fonctions des protéines, par exemple, en modifiant l’activité enzymatique ou de médiation des interactions. Une quantification précise d’occupation d’acylation des protéines spécifiques au site, ou la stoechiométrie, est essentielle pour comprendre les conséquences fonctionnelles de stoechiométrie de bas niveau global et acylation de haut niveau individuel stoechiométrie de lysine spécifique résidus. Autres groupes ont signalé la mesure de la stoechiométrie de l’acétylation de lysine en comparant le ratio des isotopes de précurseur du peptide d’acylation abondance endogène, naturel et exogène, lourde acylation isotopique marqué introduit après quantitative acétylation chimique des protéines à l’aide de l’anhydride acétique stable isotopes marqués. Ce protocole décrit une approche optimisée mettant en vedette plusieurs améliorations, dont : (1) efficacité acylation chimique, (2) a augmenté la capacité de mesurer succinylation des protéines en plus de l’acétylation et (3) amélioration de la précision quantitative due à réduit les interférences à l’aide de quantification ion fragment d’acquisitions de données indépendantes (DIA) au lieu de signal ion précurseur d’acquisition de données-dépendante (DDA). L’utilisation de surfaces de pics extraites d’ions fragments pour la quantification permet aussi la différenciation au niveau du site acylation stoechiométrie de peptides protéolytiques contenant plus d’un résidu lysine, qui n’est pas possible en utilisant l’ion précurseur signaux pour la quantification. Visualisation de données en ligne d’horizon, un environnement de protéomique quantitative open source, permet l’examen et inspection des données pratique. Ensemble, ce flux de travail vous propose une quantification exacte, précise et impartiale d’occupation acétylation et succinylation de lysine in situ d’un proteome entière, qui peut révéler et prioriser les sites acylation biologiquement pertinente.

Introduction

N_Ɛ- acylation des résidus de lysine de protéine est un important régulateur de la fonction de protéine. Acétylation de la lysine et autres acylations, comme succinylation, malonylation et glutarylation, sont pensées pour réguler le métabolisme, la signalisation cellulaire et autres processus cellulaires^1,2,3,4 , et avoir des incidences sur les troubles métaboliques⁵. De nombreuses études ont constaté que les modifications de lysine acyle subissent grands pli-changements dans des conditions différentes dans les tissus des mammifères et cell lines^5,6,7,8 ainsi que bactéries^9,10,11, cependant, ces changements de pli relatif ne fournissent pas aperçus de la proportion de la protéine totale modifiée. Changent d’études faisant état des mesures d’occupation du site acylation sont^13,rare^12,14, malgré la pertinence et besoin pour de telles études car elles fournissent plus de détails que le pli relatif. Par exemple, un changement 10 fois pourrait représenter une augmentation d’occupation du site de 0,01 à 0,1 %, 1 à 10 % ou même 10 à 100 %. Stœchiométrie précise mesures sont exigées pour interpréter la signification biologique de l’acylation et de prédire l’impact concernant l’ampleur des protéines structurales et éventuellement, des changements fonctionnels.

Une des méthodes précédentes pour quantifier l’occupation des sites utilise étiquetage chimique lourde isotopes stables des résidus lysine non modifiées suivies par spectrométrie de masse pour mesurer le rapport entre endogène acétylation « léger » par rapport à l’exogène, chimiquement-étiqueté « lourd » acétyl-lysine un précurseur ion intensités¹². Une autre étude récente par Zhou et al. ¹³ décrit une approche semblable pour évaluer la stoechiométrie de l’acétylation de lysine qui a également employé une acétylation chimique complète de tous les résidus de lysine non modifié en protéines avec des isotopes stables d’étiquetage, mais utilisé fragment ion intensité mesurée par DDA. Ndiaye et al. ¹⁴ a utilisé une approche similaire de la DDA, mais plutôt utilisé le ratio des ions immonium acétyl-lysine légers et lourds pour la quantification. Quantification issue des ions fragments, immonium ou séquence d’ions (MS2), dans la plupart des résultats des cas en moins interférences de signal par rapport au traitement des ions précurseurs de peptide intact (MS1). Cependant, quantification des ions fragments de spectres générés par DDA MS/MS peut souffrir de carences d’échantillonnage stochastique, où les ions précurseurs haute-abondance sont plus susceptibles d’être sélectionnés pour MS/MS et ainsi, conduire à un échantillonnage biaisé et incomplet de ions précurseurs.

Ce nouveau flux de travail⁴ (Figure 1) utilise conceptuellement un isotope stable chimique étiquetage approche développée initialement par Baeza et al. ¹², cependant le flux de travail est associé par la suite DIA pour recueillir les deux précurseurs et multiples abondances d’ion de fragment dans la masse détectable rang^15,16 fournissant des calculs exacts stoechiométrie.

Des pics de fragmentent les ions qui contiennent le site acylation d’intérêt, ou « différencier les ions fragments », sont utilisés pour quantifier l’occupation des sites acylation (Figure 2). Les ions fragments qui ne contiennent pas la modification ont des valeurs identiques légers et lourds m/z et sont utilisées pour l’identification de peptide, mais pas pour la quantification. Skyline software¹⁷ est utilisé pour extraire des pics précurseur et fragment. La présence de plusieurs ions fragments contenant un site donné acylation fournit souplesse si les interférences sont détectés dans certains des ions fragments. Visualisation de données en ligne d’horizon permettant d’inspection critique des rapports ioniques fragment de lumière à forte. En plus de l’analyse manuelle des données, un paquet de R open source écrit en interne, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), a été développé, qui utilise les précurseurs ion et fragment ion données recueillies par le biais de DIA et quantifie acylation spécifique au site stoechiométrie de peptides contenant plusieurs résidus de lysine, une fonctionnalité qui n’est pas possible avec le précurseur intensité ion seule mesure⁴.

Ce protocole montre également l’utilisation d’endoprotéinase Glu-C, ce qui est spécifique pour le clivage aux résidus glutamique et l’acide aspartique, au lieu d’utiliser la trypsine ou protéase Arg-C, que ces derniers génèrent souvent très grands et potentiellement multiplient C-terminal acylés protéolytique peptides résultant de clivage de la trypsine bloqués aux résidus lysine acylés. Le produit chimique procédure d’étiquetage a été étendu aussi utilisation de l’anhydride succinique (Figure 1), ce qui permet la quantification des succinylation stoechiométrie succinylation. En plus des améliorations à la préparation de l’échantillon, la mise en œuvre de fractionnement de peptide par pH offline, base, séparation de phase inversée (bRP) de peptides davantage diminué des perturbations de quantification, ce qui permet de mieux la convolution de acylation stoechiométrie dans des échantillons de proteome ensemble. Ensemble, cette méthode dispose et met en évidence plusieurs avantages : (1) efficacité accrue de l’acylation chimique ; (2) mesure de la stoechiométrie de succinylation de protéines en plus de l’acétylation ; et (3) précision de quantification améliorés. La quantification améliorée est fait d’une diminution interférences de signaux ion fragment de DIA par rapport au signal précurseur DDA, ainsi que la mise en œuvre de fractionnement pre peptide off-line par bRP.

Protocole

1. quantitativement Acetylate et/ou protéines Succinylate en utilisant les isotopes marqués acétique ou Anhydride succinique

1. Préparer 3 répétitions de 100 µg d’échantillon de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) en parallèle, à une concentration de 1 µg/µL (au total 100 µL), à l’aide d’une solution de bicarbonate (TEAB) urée et de triéthylammonium (8 M urée, 200 mM TEAB, pH 8).
   Remarque : Il est important d’utiliser le tampon sans amine. Les échantillons de protéine utilisés ici dans la section résultats représentatifs sont BSA, quantitativement succinylé BSA, et son rendement BSA échantillons avec des mélanges définis succinylation occupation à 0 %, 1 %, 10 %, 50 % et 100 %, respectivement (chaque échantillon sera préparé en 3 exemplaires). Ce protocole a également été effectué à l’aide de lysats de protéines d’Escherichia coli et la souris du foie⁴. Le protocole peut également être appliqué aux autres lysats cellulaires ou tissulaires.
2. Réduire les 100 µL de l’échantillon de BSA (100 µg) avec 8 µL de 250 mM le dithiothréitol (DTT) pour atteindre une concentration finale de 20 mM DTT et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 30 min avec agitation à 1 400 tr/min.
3. Alkylation de l’échantillon réduit de BSA avec 21,6 µL d’iodoacétamide 200 mM pour atteindre une concentration finale de 40 mM iodoacétamide et incuber l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min.
   Remarque : Il est important d’avoir la concentration iodoacétamide légèrement plus de 2 x de la concentration de TNT pour s’assurer que tous réduits thiols protéiques sont alkylés.
4. Procéder à la préparation de l’anhydride acétique -d₆ (étape 1.4.1) ou succinique anhydride -d₄ (étape 1.4.2) nécessaires pour l’acétylation (quantitative) chimique ou succinylation des échantillons.
   1. Déterminer la molarité (M) de l’aliquote de 1 g d’anhydride acétique aqueuse - solutiond₆ de la masse moléculaire (108.13 g/mol) et la densité (1,143 g/mL à 25 ° C).
      Remarque : Le paquet de 1 g contient 9 248 µmol de l’anhydride acétique -d₆ 875 volume µL, ce qui donne une solution de 10,57 M utilisée pour par-acétylation des échantillons.
   2. Préparer une solution de 5 M de succinique anhydride -d₄ en dissolvant la poudre dans le DMSO anhydre immédiatement avant la réaction d’hydrolyse du réactif. Dissoudre 0,24 g de succinique anhydride -d₄ 461 µL de DMSO anhydre pour obtenir une solution de 5 M.
5. Effectuer une acétylation chimique quantitative ou succinylation en ajoutant 60 µmol de l’anhydride acétique -d₆ (6 µL de la solution de 10,57 M) ou succinique anhydride -d₄ (12 µL de la solution de 5 M) respectivement et incuber le échantillon à 4 ° C pendant 20 min sur un vortex.
   Remarque : En raison de l’acidité des anhydrides, protéines peuvent précipiter. Prendre note et régler comme indiqué au point 1.6.
6. Ajouter 10 µL de 7,25 M NaOH après l’incubation pour augmenter le pH à environ 8 pour éliminer n’importe quel côté de O-acylation-produits. Vortex brièvement et vérifier le pH de l’échantillon de détachage 1 µL sur papier pH.
   Remarque : Il peut être nécessaire d’ajouter plus de 10 µL de 7,25 M NaOH pour arriver à pH 8. En outre, les protéines potentiellement précipités devraient dissoudre à nouveau.
7. Répétez les étapes de réglage par acétylation et pH 1,5 et 1,6 pour un total de trois fois. Vérifiez les valeurs de pH et noter le volume de solution de base ajoutée par répétition. Travaux rapidement au cours de ce qui précède acylation chimique les étapes car les anhydrides vont hydrolyser et perdre la réactivité.
8. Après l’ajustement pH et réaction étiquetage final, ajouter 10 µL de solution de 50 % d’hydroxylamine revenir O-acylation des réactions secondaires.

2. Digest a réagi échantillons de protéines à l’aide de Glu-C endoprotéinase

1. Diluer la concentration d’urée à 0,8 M à l’aide de 50 mM TEAB, pH 8 et normaliser le volume des échantillons.
2. Digérer les échantillons de protéines en ajoutant endoprotéinase Glu-C à un 01:50 protéase ratio de protéine substrat (p/p) et incuber les échantillons pendant une nuit à 37 ° C sous agitation à 1 400 tr/min.
3. Acidifier et étancher les échantillons de digestion des protéines en ajoutant de l’acide formique à 1 % en volume.
4. Dessalement des échantillons à l’aide de cartouches d’extraction en phase solide balance hydrophile-lipophile. Utilisez une cartouche de sorbant de 30 mg par le matériau de l’échantillon, maximum 5 mg par cartouche^4,18.
   Remarque : Il est important de garder le sorbant à l’intérieur de la cartouche humide tout au long de ce processus de dessalement. Lorsque cela est nécessaire, éteignez la pompe à vide pour ralentir le passage de solvant ou d’échantillon dans la cartouche.
   1. Insérer la cartouche dans l’ou les ports sur la tubulure de verre 24-port bloc vide et mettre en marche la pompe à vide. Laissez les ports inutilisés plafonnés. Laisser un ou deux ports non plafonnés pour maintenir la pression inférieure sur la jauge à vide si nécessaire.
   2. Mouillez chaque cartouche deux fois avec 800 µL de 80 % d’acétonitrile (ACN)/0.2% formique acid/19.8% eau. Veiller à ce niveau de solvant reste 2 à 3 mm au-dessus du niveau de sorbant. S’assurer que la jauge à vide sur le collecteur lit 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 en Hg).
   3. Equilibrer chaque cartouche trois fois avec 800 µL d’acide formique à 0,2 % dans l’eau. S’assurer que la jauge à vide sur le collecteur lit 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 en Hg).
   4. Charger les échantillons de peptide à la cartouche. S’assurer que la jauge à vide sur le collecteur lit 6.77 – 8.47 kPa (2 – 2,5 pouces Hg), et de débit ne dépasse pas 1 mL/min.
   5. Lavez chaque cartouche trois fois à 800 µL 0,2 % l’acide formique dans l’eau. S’assurer que la jauge à vide sur le collecteur lit 16,9 – 67,7 kPa (5 – 20 en Hg).
   6. Retirez la cartouche de la tubulure de vide et de s’installer dans un microtube 1,5 mL.
   7. Éluer les peptides une fois avec 800 µL d’eau de 80 % ACN/0.2% acid/19.8% formique et laisser incuber avec le solvant sorbant pendant 2 à 3 min.
   8. Utiliser une pipette au solvant de pousser à travers la couche absorbant à l’intérieur de la cartouche. Répétez pour l’élution seconde de 400 µL 80 % ACN/0.2% acid/19.8% formique l’eau dans le même microtubes de 1,5 mL.
5. Sécher l’éluat par centrifugation de vide (centrifugation taux fixé à 268 x g), généralement pendant 3 h.
   Remarque : Si nécessaire, séchées éluat échantillons peuvent être conservés congelés à-20 ° C jusqu’au moment de procéder avec le fractionnement.

3. fractionner des Peptides utilisant hors ligne Basic-pH HPLC en Phase inversée

1. Remettre en suspension les par-acylés et échantillons de Glu-C digéré (préparés comme décrit dans les Sections 1 et 2) dans 200 µL de tampons A (formiate d’ammonium de 10 mM dans l’eau, pH 10), mélanger l’échantillon pendant 10 min sur un Vortex à 4 ° C et centrifuger à 17 500 g pendant 10 min à la salle te température.
   Remarque : L’échantillon de peptide qui en résulte est prêt à être hors ligne fractionnée par un pH élevé séparation^19,20.
2. Le programme de la méthode de fractionnement par HPLC en mode hors connexion selon l’appareil et le logiciel utilisé. La méthode suivante est spécifique pour un système binaire de pompe HPLC comprenant un détecteur à double longueur d’onde UV, un échantillonneur automatique, un collecteur de fraction et une colonne C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm taille des particules) qui tolère des pH 10.
3. Collecter 40 fractions de chaque pour 2,1 min par fraction et combiner chaque quatrième fraction, résultant en quatre fractions commun final⁴. Un plus grand nombre de fractions commun peut servir à réduire davantage la complexité d’échantillon au détriment du temps de collecte de données spectrométrie de masse.
4. Sécher les fractions regroupées dans un lyophilisateur, remettre en suspension les échantillons séchés peptide dans 1 mL d’acide formique ACN et 1 % 50 % dans l’eau et transférer dans un récipient plus petit. Sécher l’échantillon transféré par centrifugation de vide (centrifugation taux fixé à 268 x g), généralement pendant 1 h.
   Remarque : La faible pression de vapeur du formiate d’ammonium risquent de compliquer un séchage complet. Si des quantités importantes de sel de formiate d’ammonium restent comme sel précipité après le séchage, répéter l’extraction en phase solide.
5. Remettre en suspension les échantillons dans 20 µL d’acide formique à 0,2 % dans l’eau avec mélange d’étalons peptide rétention indexée temps (iRT).
   NOTE : Les échantillons sont maintenant prêts pour l’analyse par spectrométrie de masse.

4. diamètre analyse des échantillons fractionnés Peptide

1. Analyse des échantillons à l’aide d’une méthode DIA LC-MS/MS, ce qui peut être ajustée selon les instruments par spectrométrie de masse disponibles. L’analyse a été réalisée en utilisant un système de nano-LC HPLC 2D en ligne relié à un spectromètre de masse quadripolaire orthogonal temps de vol (QqTOF).
   1. Le logiciel de l’instrument de programme afin que les mélanges de peptide sont transférées sur une puce de la précolonne C18 (200µm x 6 mm C18-CL puce, 3 µm, 300 Å) et lavage à 2 µL/min pendant 10 min avec le solvant de chargement (l’acide formique H₂O/0.1%) pour le dessalage.
   2. Séparer les peptides par chromatographie sur une puce de 75 µm x 15 cm C18-CL (3 µm, 300 Å) à un débit de 300 nL/min avec un gradient moyen de 2 h typique (et LC-système particulier) aqueuse et solvant ACN met en mémoire tampon⁴.
   3. Générer une méthode DIA fenêtre variable, où les fenêtres de la gamme de masses de largeur variable (de 5 à 90 m/z) sont passés de la Q1 quadrupolaire dans la cellule de collision à des mesures progressives sur la gamme pleine masse (m/z 400-1 250).
      NOTE : Le temps de cycle du 3.2 s inclut un balayage d’ion précurseur de 250 ms suivi de 45 ms temps d’accumulation pour chacune des 64 FAUCHÉE segments^21,22.
2. Identifier les peptides utilisant une analyse parallèle d’échantillons par DDA MS et de la construction de bibliothèques spectrales, ou alternativement, les peptides peuvent être identifiés directement à partir de données de diamètre à l’aide de PIQED logiciel²³, qui gère toutes les étapes techniques du traitement des données, identification et importation dans Skyline pour quantification ultérieure.

5. didacticiel sur analyse de données exemple

1. Télécharger le logiciel de Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) et créer un compte PanoramaWeb (https://panoramaweb.org).
   Remarque : Pour des tutoriels détaillés décrivant l’utilisation de la ligne d’horizon avec les données, s’il vous plaît voir (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Autres algorithmes logiciels peuvent servir au lieu d’extraire des pics de fragments légers et lourds ion des acquisitions DIA, tels que le couloir ouvert²⁴, FAUCHÉE 2.0 plugin dans PeakView²⁵et²⁶de la Spectronaut.
   1. Télécharger le fichier de données de ligne d’horizon pour les résultats représentatifs succinylé BSA (Figure 3) du Public Panorama : https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Sur la page Web de Panorama, aller à la table « Ciblées MS fonctionne » et téléchargez le fichier sky.zip choisir le lien de téléchargement sur le côté droit. Extraire le dossier .zip téléchargé et double-cliquez sur le fichier skyline.sky pour l’ouvrir dans la ligne d’horizon. Vérifiez l’arborescence cible peptide fragment ion (panneau de gauche) et les quatre chromatogrammes de pourcentages définis de lumière succinylation (panneaux de droite).
   2. Sélectionnez le menu « Affichage », naviguez jusqu'à « des pics | Répliquer la comparaison ». Le panneau « Peak zones – répliquer Comparison » contenant des graphiques de barre apparaît sur le côté droit de la fenêtre. Dans le panneau des pics, faites un clic droit et sélectionnez « Transitions | Single », qui montre la surface du pic ion fragment pour l’ion fragment sélectionnés. Enfin, le panneau « Pits » faites un clic droit et sélectionnez « ordre | Document ».
   3. Dans le volet d’arborescence cible sur le côté gauche de la fenêtre, faites un clic droit sur le peptide « E.LCKVASLRE. T | Ratios | Oneheavy », qui permet de calculer le rapport des ions légers signal sur signal d’ions lourds, légers et lourds.
      NOTE : Ce n’est pas le même que le ratio de stoechiométrie d’occupation de site de Light/(Heavy+Light).
   4. Notez que l’arborescence cible rapporte désormais les rapports L/H à droite des ions fragments légers.
2. Déterminer les « ions fragments différenciation » qui contiennent le site acylation d’intérêt.
   Remarque : Comme illustré à la Figure 3, mettant en vedette cet exemple précis, les ions de différenciation ont déterminé y₇ (rang), y₈, b₃et b₄. Remarquez que les ions fragments non différenciation apparaissent un ratio de 1 dans l’arborescence de la cible.
   1. Dans l’arborescence de cible de panneau de gauche, sous le 588.30 ++ sous-nœud du peptide E.LCKVASLRE. T, cliquez sur l’y7 différenciant ion fragment
      K [y₇ ] – 902,49 + (rank1) [5]
      Remarquez la hauteur du pic croissante et la zone.
   2. Dans l’arborescence de cible de panneau de gauche, sous le 588.30 ++ sous-nœud du peptide E.LCKVASLRE. T, cliquez sur l’ion de fragment non-différencier y₅ un [y₅ ] – 575.31 + (rang 6) [1]. Observer que les chromatogrammes d’ion y₅ fragment et la surface des pics restent dans la même gamme pour tous les échantillons.
   3. Dans l’arborescence cible, parcourir autre différenciation (ratio différent de 1) et non-différencier (ratio de 1) fragmenter les ions et remarquez les changements et les tendances dans le domaine de la pointe bar graph et chromatogrammes.
   4. Déterminer la surface exacte des pics pour les paires légères et lourdes des différenciation des ions afin de calculer la stoechiométrie (pour plus de détails, voir aussi Meyer et al. ⁴). cliquez sur le « View | Grille du document » et la grille du document seront affiche. Dans le coin supérieur gauche de la grille du document, cliquez sur « vues | Résultats de transition » pour voir une table multi-colonnes avec fragment ion informations telles que la séquence peptidique, mz précurseur, nom de répliquer, etc.
   5. Modifier le format de rapport « pivoter » de nouveau en cliquant sur « Affichages » dans la grille de document et en sélectionnant « Edit View » pour ouvrir la fenêtre de personnalisation de l’affichage. En bas à gauche de la fenêtre « Personnalisation de l’affichage », cochez le « nom de répliquer de tableau croisé dynamique » et sélectionnez « Ok » pour fermer la fenêtre de personnalisation de l’affichage. Observer que maintenant la fenêtre de la table « Document grille : Transition des résultats » a ré-arrangé regrouper le nom de répliquer, zone, temps de rétention, arrière-plan, colonnes de Peak rang par répliquent (1 %, 10 %, 50 %, 100 % succinylation).
   6. Pour le peptide « E.LCKVASLRE. T » dans le tableau « Document grille : résultat de Transition », trouver la colonne « Précurseur Mz », la colonne « Fragment Ion » et la région de 1pct_light_sw1 (1 % succinylation) colonne. Observer qu’il existe deux précurseurs ions pour ce peptide, léger (Mz précurseur de 588.30 dans les 8 premières lignes) et lourds (Mz précurseur de 590.32 dans les 8 derniers rangs).
   7. Dans la colonne « Ion Fragment », rechercher les deux lignes pour l’ion de fragment y8 correspondant à la lumière et les ions lourds de précurseur. Depuis les mêmes lignes dans la colonne de zone de 1pct_light_sw1, enregistrer les domaines y8 pour la lumière (15 820) et le lourd (1 426 461).
3. À l’aide de ces valeurs de zone de crête, calculer la stoechiométrie de succinylation, ou la proportion modifié, selon la formule ci-dessous et obtenir un ratio de stoechiométrie de 0,01, ou 1 % succinylation, qui correspond à la proportion de lumière succinylation dans ce sens mélange :
   
4. Calculer le ratio de stoechiométrie pour succinylation de 10 % en utilisant les y8 différenciation fragment ion pic zone valeurs de la colonne de zone de 10pct_light_sw1, 144 953 (lumière) et 1 188 041 (lourd), afin d’obtenir un ratio de 0,10 ou succinylation de 10 %.
5. Calculer le ratio de stoechiométrie pour succinylation 100 % en utilisant les y8 différenciation fragment ion pic zone valeurs de la colonne de zone de 100pct_light_sw1, 954 513 (lumière) et 16 407 (lourd), afin d’obtenir un ratio de 0,98, ou 98 % succinylation.
6. De même, calculer le ratio de stoechiométrie pour 1 % succinylation utilisant les b3 différenciation fragment ion pic zone valeurs de la colonne de zone de 1pct_light_sw1, 55 697 (lumière) et 3 149 119 (lourd), afin d’obtenir un taux de 0,01, ou 1 % succinylation.
7. Continuez les calculs de ratio de stoechiométrie en utilisant la formule pour tous les ions fragments différenciateur, ions les y et b, pour obtenir la lysine succinylation valeurs de stoechiométrie de mélanges de succinylation 1, 10, 50 et 100 %.

Résultats

Après l’acquisition de données, différenciation ions fragments de MS2 ont été déterminées par les peptides acylés protéolytique, chromatogrammes ion par la suite extraite (XIC) ont été traitées dans le Skyline et voyant correspondant et des pics lourd qui ont été exportés Enfin utilisé pour calculer l’occupation des sites. Figure 2 a montre une illustration conceptuelle de comment le XIC précurseur-ion peut apparaître mettant en vedette les deux signaux de peptide légers et lourds, et Figure 2 b présente un exemple du fragment correspondant XICs ion avec codage de couleur (rouge = lumière ; bleu = lourd ) pour différencier les ions fragments contenant les modifications de l’acylation de lysine.

La figure 3 montre les données issues d’une expérience de l’occupation, telle que décrite ci-dessus en analysant les rapports prédéfinis de légers/lourds succinylé BSA généré en interne à 1, 10, 50, ou 100 % et la détermination d’occupation succinylation son. Importation de données d’occupation DIA dans Skyline permet de faciliter la visualisation de l’arborescence cible, affichage des séquences peptidiques et ions fragments pour les ions précurseurs légers et lourds (Figure 3 a). Données de DIA-MS de chaque rapport défini succinylé BSA a révélé immanent les différences relatives au ratio de lumière à forte y₇ ion, l’ion de fragment différenciant mieux classés de la correspondance de peptide identifiés-spectra (indiqué en rouge, Figure 3 b). La figure 4 montre un aperçu des résultats du calcul d’occupation MS2 qui a confirmé l’occupation de pourcentages de succinylation de protéine d’entrée, transformés ici consistant en la BSA pré-succinylé. Occupation succinylation lysine mesurée pour 20 succinylé protéolytiques peptides obtenus à partir de BSA commerciaux pré-succinylé, succinylé à des pourcentages définis (par exemple, à 0, 1, 10, 50 et 100 %) sont indiquées dans le tableau 2. Pour chacun des 20 peptides protéolytiques BSA, le rang le plus élevé, différenciant MS2 ion fragment a servi à calculer une occupation lysine succinylation (Ksucc), comme L/(L+H) en %. Dans l’ensemble, la quantification basée sur MS2 a montré de très bonne précision dans la détermination de l’acylation occupation même à faibles stoechiométries.

Figure 1 : flux de travail de stoechiométrie. (A) protéines sont incubés trois fois avec l’anhydride acétique -d₆ à acetylate résidus lysine non modifié. Ensuite, acétylés les protéines sont digérées avec endoprotéinase Glu-C, suivi par le fractionnement du HPLC des peptides protéolytiques chromatographie en phase inverse basic-pH. Enfin, les peptides sont analysés par LC-MS à l’aide de DIA avec des largeurs de fenêtre variable précurseur. (B) le même flux de travail est utilisée pour déterminer la stoechiométrie de succinylation comme indiqué (A), mais le réactif d’acylation lourd passe à succinique anhydride -d₄. Figure adaptée de Meyer et al. ⁴ (J. mod. SOC. Mass Spectrom., libre choix). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : exemple de possibles données obtenues et les calculs de la stoechiométrie. (A) de la lumière (L) et les ions lourds du précurseur des MS1 (H) contenant une lysine acétylée diffèrent par 3 unités de masse. Toxics sont générés pour les enveloppes isotopes légers et lourds, indiqués en rouge et bleu, respectivement. (B) la Quantification de la MS2 ion fragment XICs attribuable aux acquisitions de DIA peut être effectuée à l’aide de « différenciation » ions fragments légers et lourds qui contiennent le site acétylation a indiqué en rouge et bleu. Commune ions fragments sont affichées en pointillé noir et ne contiennent pas le site de modification. Figure adaptée de Meyer et al. ⁴ (J. mod. SOC. Mass Spectrom., libre choix). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : visualisation de la Skyline de peptide de BSA protéolytique succinylé au taux d’occupation différents. Arborescence de cible de Skyline (A) montrant le peptide protéolytique LCKsuccVASLRE et sa suite fragmentent les ions. Skyline (B) extrait des chromatogrammes ion fragment à divers niveaux d’occupation succinylation. L’ion différenciation rang plus élevée, y₇, augmente dans l’aire du pic 1, 10, 50 et 100 % de corrélation entre le pourcentage d’entrée de pré-succinylé BSA (généré en interne). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : évaluation de stoechiométrie acylation BSA de BSA pré-succinylé. Cinq échantillons différents de BSA à des pourcentages définis de modification lourde (e.g., 0, 1, 10, 50, et 100 %) ont été soumis à la détermination d’occupation MS2. Occupation des sites pour 20 succinylé peptides de BSA ont été déterminées par les ions fragments différenciation rang plus élevées pour cinq différents échantillons de BSA à des pourcentages définis de légère modification (par exemple, à 0, 1, 10, 50 et 100 %). Les moustaches de boîte affiche la distribution des peptides succinyl 20, de 50 % des peptides, les valeurs sont dans la « boîte » (25 % percentile au percentile 75 %), la moustache supérieure indique les valeurs de percentile 75 % au maximum (100 %) et la moustache inférieure indique les valeurs de centile 25 % au minimum (0 % percentile). (J. mod. SOC. Mass Spectrom., libre choix). Quantification des mesures se trouvent dans le tableau 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Temps (minutes)	% A	% B
0.00	100	0
7.27	92	8
45.27	73	27
49,27	69	31
65,27	61	39
72,27	40	60
80,00	10	90
85,00	10	90
86.00	100	0
120,00	100	0
Débit : 0,7 mL/min
Tampon A: 10 mM d’ammonium formate dans l’eau, pH 10
Mémoire tampon B: 10 mM d’ammonium formate dans 90 % ACN et 10 % d’eau, pH 10
Nota : Le pH de ces deux phases mobiles ajusté à 10 avec de l’ammoniaque pur

Tableau 1 : dégradé pour hors ligne fractionnement de HPLC en phase inversée basic-pH. Gradient Durée : 120 min. tampon A: 10 mM d’ammonium formate dans l’eau, pH 10. Mémoire tampon B: 10 mM formiate d’ammonium dans l’eau ACN et 10 % à 90 %, pH 10.

L / L + H en %	L / L + H en %	L / L + H en %	L / L + H en %	L / L + H en %
Ksucc 0 %	Ksucc 1 %	Ksucc 10 %	Ksucc 50 %	Ksucc 100 %
0,2	1.7	11.1	50,9	99,2
1.2	2.3	12.3	49,4	97,6
2.9	3.8	14	48,6	99,5
0,5	1.8	11,7	50,8	99,5
0,2	1.7	11.1	48,3	98,2
0,2	1.2	11	47,5	96.1
0,3	1.6	12,8	51	99,2
3.7	5.2	14,7	51,9	89,5
1.5	1.8	12,5	47,2	91.1
0,8	1.5	11.3	48.4	96,8
0,2	1.6	13,9	49,7	98,9
0,1	1.1	10.7	48.2	98,6
0,2	0,9	10.3	49,4	99,4
0,5	2.5	17.2	52,3	97,5
0,1	3.5	20,8	51	99
0,3	1,9	10.7	49,6	98,2
2	1.7	10,9	47,7	96.3
0,3	1.2	10	53	98
1.1	1.8	12,9	57,9	94.1
0,2	1.4	11.6	48,6	98,8

Tableau 2 : Quantification des mesurée BSA lysine succinylation occupation 20 peptides protéolytiques succinylé. Succinylé peptides obtenus de BSA commerciaux pré-succinylé, succinylé à des pourcentages définis (par exemple, à 0, 1, 10, 50 et 100 %). Pour chacun des 20 peptides protéolytiques BSA, le rang le plus élevé, différenciant MS2 ion fragment a servi à calculer une occupation lysine succinylation (Ksucc), comme L/(L+H) en %.

Discussion

Ce protocole prévoit un roman et une méthode précise pour quantifier l’acétylation de la lysine in situ et l’occupation de succinylation qui peut s’appliquer à un ensemble proteome. Cette méthode s’appuie sur la mesure des peptides endogènes de lumière et des peptides exogènes lourds, laquelle est générés in vitro à l’aide de l’acylation chimique quantitative des protéines avec l’anhydride acétique deutéré -d₆ ou succinique anhydride -d₄ (Figure 1). Des méthodes semblables ont utilisé marquage isotopique stable des résidus lysine non modifiées native et effectué quantification d’occupation de site basée sur soit précurseur ion uniquement¹² ou fragment des ions du DDA acquisitions^13,14. Ce protocole s’applique à plusieurs étapes au cours de la préparation de l’échantillon pour améliorer l’efficacité de l’acylation et étend le marquage chimique de succinylation. Collecte de données à l’aide d’acquisitions DIA obtienne les ions précurseurs et MS2 fragment intensités ion à l’étendue massive détectable, ce qui réduit les interférences d’ion fragment. Analyse et quantification par Skyline et des scripts personnalisés développés en interne permettent le calcul d’occupation de site pour les peptides contenant plus d’un résidu lysine et plus d’une acylation au même endroit.

Il y a plusieurs étapes cruciales au cours de la phase de préparation d’échantillon du présent protocole qui devrait être suivie de près. Étant donné que l’ensemble du protocole repose sur une modification chimique efficace de tous les résidus de lysine, cette étape est d’une importance capitale. Anhydrides réagissent avec les amines libres, donc il faut éviter les molécules de tampon ou contaminant contenant des amines dans le lysat protéique. Aussi, durant l’étape chimique par acétylation, s’assurer que le pH du mélange réactionnel est ajusté à pH 8 après chacune des trois incubations avec le réactif de l’anhydride car cette réaction acidifie le mélange, et O-acylation-réactions secondaires peuvent se former. En outre, dilution de 8 M contenant de l’urée mélange réactionnel à autour de 0,8 M urée avant la digestion et en vérifiant que le pH se situe entre optimale est importante pour l’activité optimale de l’endoprotéinase Glu-C. Un autre élément clé de notre protocole est l’étape de collecte de données et la mise en place d’un workflow DIA, qui surmonte toute incohérence de prélèvement de données DDA et qui permet une quantification à la concentration d’ions fragments MS2. Un des principaux avantages de la méthode DIA sont la diminution des interférences qui sont généralement beaucoup plus enclin et problématiques lors de la quantification du signal d’ion précurseur MS1 (comme certaines des publications précédentes l’ont suggéré).

Plusieurs modifications au flux de travail peuvent être effectuées lors de la préparation des échantillons très complexes. Le nombre de fractions mis en commun après que le fractionnement de HPLC en phase inversée basic-pH en mode hors connexion peut être diminué pour réduire la complexité des échantillons mis en commun qui seront acquis par LC/MS. plus, plus chromatographique dégradés peuvent également être utilisés au cours acquisition pour permettre meilleure séparation de peptide. Par ailleurs, plusieurs protéases peuvent servir pour digérer les échantillons pour produire une grande variété de peptides clivées et accroître la couverture de résidus de lysine de protéine. Essais préliminaires et l’optimisation peuvent être effectuées à l’aide de BSA commerciale contenant des pourcentages précis d’acétylation ou succinylation.

Une des limites de ce protocole sont surestimation occupation site potentiellement légère due à portées disparues d’autres modifications de lysine, par exemple de méthylation ou ubiquitination, etc., au même site⁴. Calculée à partir de la surface des pics des modifications légères et lourdes acyl, L/(L+H), l’occupation du site est basée sur l’hypothèse que le niveau total de modification sur un site de lysine se compose de seulement endogène acylation « light » (L) et chimiquement étiquetée « lourde » acylation (H). Toutefois, le taux d’occupation réel acylation totale à un site en vivo peut-être inclure des autres modifications allant au-delà de l’acétylation et/ou succinylation. En outre, la pureté isotopique rapportée des réactifs achetés l’anhydride acétique -d₆ (99 %) et succinique anhydride -d₄ (> 98 %) peuvent contribuer à une surestimation petite de jusqu'à 2 % (succinyl) ou de 1 % (acétyl) de la acylation endogène de niveau⁴. Ensemble, ces légères surestimations ajoutent à la difficulté à quantifier les sites avec moins de 1 % occupation. Différences de grande abondance entre la complète chimiquement acylés peptides et les peptides acylés native contribuent également aux erreurs de quantification du occupation site potentiel, surtout pour les faibles acylés endogène peptides²⁷. Une étude récente menée par Weinert et al. ²⁷ a révélé qu’une diminution de l’abondance des différences entre complets acétylée par peptides peuvent réduire l' erreur de quantification²⁷.

Quantifications de stoechiométrie recueillies en utilisant ce protocole peuvent repérer acylation important hotspots dans un hypothèses particulières de protéine et de forme pour des expériences de suivi biologiques, comme la mutagénèse dirigée de certains sites d’intérêt. Ce protocole pourrait également révéler des effets combinés des sites de stoechiométrie acylation faibles qui pourraient exercer une influence indirecte ou subtile sur stabilité structurale des protéines et par des environnements cellulaires. En outre, la mise en œuvre du présent protocole pour mesurer l’acétylation et succinylation et autres modifications de l’acylation de lysine possible au-delà de l’acétylation offrirait unique mieux comprendre les effets de la dynamique de l’acylation sur protéines sous différents conditions biologiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
anhydride acétique aqueux-d6	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	175641-1G 1 %	pureté isotopique
anhydride succinique-d4	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	293741	isotopique
de qualité endoprotéinase Glu-C	Roche, Indianapolis, IN, États-Unis (via Sigma)	10791156001	Rapport protéase/protéine de substrat (poids :poids)
Cartouches d’extraction en phase solide (SPE) Oasis HLB	Waters Corp., Milford, MA, États-Unis WAT	094225
Acétonitrile HPLC	Burdick et Jackson, Muskegon, MI, États-Unis	BJAH015-4
Eau de qualité HPLC	Burdick et Jackson, Muskegon, MI, États-Unis	BJAH365-4
iodoacétamide	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	I1149-25G
dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO,	États-Unis D9779-5G
FLUKA acide formique (FA) pour spécification de masse	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, États-Unis	C988C27	~98 %
urée	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	PI29700
albumine sérique bovine (BSA)	Pierce, Rockford, IL, États-Unis	88341
bicarbonate de triéthylammonium (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO,	États-Unis T7408-100ML
sulfoxyde de diméthyle anhydre (DMSO)	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, États-Unis	43998
hydroxyde de sodium (NaOH)	EMDMillipore, Burlington, MA, États-Unis	SX0590
Solution d’hydroxylamine à 50 % dans l’eau	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	438227-50ML
Eau de qualité LC-MS	Burdick et Jackson, Muskegon, MI,	États-Unis BJLC365-4
LC-MS acétonitrile	Burdick et Jackson, Muskegon, MI,	États-Unis BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact	Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne	T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Concentrateur SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,	États-Unis SPD131DDA-115
Système de pompe HPLC binaire Waters 1525	Waters Corp., Milford, MA, États-Unis	WAT022939
Waters 2487 Détecteur UV à double longueur d’onde	Waters Corp., Milford, MA, États-Unis	WAT081110
Waters 717plus Autosampler	Waters Corp., Milford, MA, États-Unis	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Milford, MA, États-Unis	186001878
Agilent Zorbax 300Extend C18 colonne	Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer	Labconco, Kansas City MO, USA	7751000
Norme de peptide de normalisation du temps de rétention indexé (iRT)	Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Suisse	Ki-3002-2
Système HPLC 2D nano-LC Ultra Plus	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, États-Unis	modèle# 845
quadrupolaire orthogonal à temps de vol (QqTOF) Spectromètre de masse TripleTOF 5600	Sciex LLC, Framingham, MA, États-Unis	par devis
Spectromètre de masse quadripolaire orthogonal à temps de vol (QqTOF) Spectromètre de masse TripleTOF 6600	Sciex LLC, Framingham, MA, États-Unis	par devis
Puce pré-colonne C18 (200 &mu ; m & fois ; Puce ChromXP C18-CL de 6 mm, 3 & m, 300 Å ;)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
SWATH 2.0 plugin dans PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	téléchargement du logiciel Sciex
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Suisse	Sw-3001
C18-CL chip (75 µ ; m x 15 cm ChromXP, 3 & micro ; m, 300 Å ;)	Sciex LLC, Framingham, MA, États-Unis	804-00001