Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7

Résumé

L’identification précise des cellules satellites est essentielle pour l’étude de leurs fonctions dans des conditions physiologiques et pathologiques différents. Cet article présente un protocole pour identifier les cellules satellites sur des coupes de muscle squelettique adulte par axée sur l’immunofluorescence souillant.

Résumé

Immunofluorescence est une méthode efficace qui aide à identifier les différents types de cellules sur des sections de tissu. Afin d’étudier la population de la cellule souhaitée, anticorps pour les marqueurs de cellules spécifiques sont appliqués sur des sections de tissu. Dans le muscle squelettique adulte, les cellules satellites (SCs) sont des cellules souches qui contribuent à la régénération et la réparation musculaire. Par conséquent, il est important de visualiser et de tracer la population de cellules satellites dans différentes conditions physiologiques. Dans le muscle squelettique au repos, SCs se trouvent entre la lame basale et la membrane plasmique de fibre musculaire. Un marqueur couramment utilisé pour identifier les SCs sur les myofibres ou en culture cellulaire est la protéine jumelé boîte Pax7. Dans cet article, un protocole d’immunofluorescence Pax7 optimisé sur des coupes de muscle squelettique est présenté qui minimise la coloration non spécifiques et fond. Un autre anticorps qui reconnaît une protéine (laminine) de la lame basale a également été ajouté pour aider à identifier les protocoles SCs. Similar permet également d’effectuer le double ou triple marquage avec des anticorps pour des protéines d’intérêt et de Pax7.

Introduction

Le muscle squelettique est composé de cellules musculaires multinucléées, appelé myotubes, organisé dans les fibres musculaires, qui génèrent des forces et mouvements par contraction. Plus les muscles squelettiques, à l’exception de certains muscles cranio-faciales, proviennent d’une structure embryonnaire temporaire appelée un somite¹. Cellules précurseurs myogénique se délamineront depuis le somite épithélial pour devenir des myoblastes. Outre les myoblastes se différencient en myocytes qui se fusionnent pour devenir des myotubes pour former les myofibres multi nucléées. Le processus décrit ci-dessus est appelé myogenèse et se caractérise par....

Protocole

Dans le présent protocole, les muscles de la patte antérieure de souris adultes (2 à 6 mois), tibialis anterior (TA) et extensor digitorum longus (EDL), travaillaient à titre d’exemple, pour effectuer l’immunofluorescence souillant sur leurs SCs. Toutes les étapes de manipulation souris et muscle les dissections de tissu ont été approuvées par l’utilisation Comité (ACUC) du NIAMS/NIH et animalier.

1. disséquer le Muscle TA/PCP de la patte de souris

1. Euthanasier la souris dans une chambre d’euthanasie rempli₂ CO conformément aux lignes directrices de l’ACUC des NIH. Effectuer la dislocation cervicale si nécessaire.
....

Résultats

Suivant les étapes ci-dessus, SCs peuvent être visualisées avec succès dans les sections de muscle au repos adultes sous un microscope à fluorescence (Figure 1). Bien que les tissus musculaires adultes a auto-fluorescence forte dans certain type de fibres, les colorants de série Alexa lumineux peuvent surmonter le bruit de fond et le signal se distingue (Figure 1 a, B; têtes de flèche). La microscopie confocale b.......

Discussion

Le protocole ci-dessus était fondé sur une méthode de coloration de Pax7/MF20 le poisson-zèbre muscle squelettique¹². Les solutions utilisées et en bloquant les étapes sont identiques ou similaires. Les anticorps utilisés sont identiques. Les mesures rajustés reposaient sur les caractéristiques des tissus musculaires de souris et de SCs. Tout d’abord, laminine anticorps a été ajouté dans le mélange afin de visualiser et de confirmer la position de la SCs. Il a été particulièrement utile compter le.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
méthylbutane	Sigma-Aldrich	M32631
Température de coupe optimale (O.C.T.) composé	Microscopie électronique Sciences	62550-01
10x PBS	Gibco, Themo Fisher	70011-044
16 % PFA	TED PELLA	50-00-0
Triton-100	Sigma-Aldrich	T8787
Sérum de chèvre normal	Thermo Fisher	0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Chèvre Anti-Souris IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-007-003
20x Tampon de citrate	Thermo Fisher	00 500
Anticorps monoclonal de souris Pax7 (IgG1) (surnageant)	Étude développementale Hybridoma Bank	N/A
Laminin Anticorps polyclonal de lapin	Sigma-Aldrich	L9393
MF20 Anticorps monoclonal de souris (IgG2b) (surnageant)	Étude développementale Hybridome Banque	N/A
Anticorps secondaire à absorption croisée IgG1 anti-souris Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-21121
secondaire à absorption croisée IgG2b Anticorps secondaire à absorption croisée Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21242
Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée IgG (H+L) anti-Souris Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher	A32732
			Leica CM1860
			fluorescent à grand champ Leica DM6000
			fluorescent à grand champ Leica DMR
Microscope confocal Zeiss LSM510 Microscope
			confocal Zeiss LSM780
Autocuiseur		électronique Cuisinart

Anticorps Cryostat Microscope Microscope