Spécifique et une détection précise de Using PCR classique sur des échantillons de tissus foliaires agrumes Citrus Greening pathogène Candidatus liberibacter spp.

Résumé

Citrus Greening est une maladie particulièrement destructeur qui affectent les cultures agrumes dans le monde. Présenté ici est une méthode simple à l’aide de PCR et l’extraction d’ADN génomique du tissu foliaire agrumes pour l’identification exacte et précise de l’agent pathogène citrus greening, Candidatus liberibacter spp.

Résumé

Citrus greening, également connu sous le nom de huanglongbing, est une maladie agrume destructeur ravage fermes agrumes dans le monde. Cette maladie provoque la feuille jaune asymétrique marbrures, jaunissement de la veine, défoliation, pourriture de la racine et en fin de compte, la mort de la plante agrume. Lorsque infecté, les agrumes ont un retard de croissance et produisent des fleurs hors saison. Ces fleurs donnent rarement des fruits, et ceux qui donneront agrumes petit, amer, de forme irrégulière qui ne sont pas souhaitables. Cette maladie se propage par le psylle agrume asiatique, Diaphorina citri et par la greffe de tissus agrumes infectés. L’agent pathogène a une incubation longue et variable au sein de l’usine agrume — parfois années, avant l’apparaissent des symptômes. Tentatives de culture ce pathogène in vitro n’ont pas réussis, peut-être en raison de la faible et inégale concentration de l’agent pathogène dans les infectés tissu agrume, ou parce qu’il est difficile de reproduire l’environnement conditions propice à la croissance de l’agent pathogène. Il est très difficile d’identifier la maladie avant elle s’est répandue, en raison de sa longue période d’incubation et l’incapacité des chercheurs à la culture de l’agent pathogène. En conséquence, la maladie ne devient apparente après avoir détruit soudainement rendement entier d’agrumes de l’agriculteur. Présenté ici est une méthode pour la détection précise et spécifique de l’agent pathogène citrus greening, Candidatus liberibacter spp., à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique et de la PCR. Cette méthode est simple, efficace, rentable et adaptable pour l’analyse quantitative. Cette méthode peut être adaptée pour une utilisation sur n’importe quel tissu agrume ; Toutefois, il est potentiellement limitée par la quantité d’agents pathogènes présents dans les tissus. Néanmoins, cette méthode permettra d’agrumes aux agriculteurs d’identifier plus tôt les agrumes infectés et freiner la propagation de cette maladie destructrice avant elle peut se propager plus loin.

Introduction

Citrus greening, également connu sous le nom de huanglongbing, a causé une perte importante de citronniers. Un cas représentatif est en Floride, où la maladie est prévue pour causer une réduction de 70 % dans la production de boîtes de Florida orange de 244 millions de boîtes dans la saison 1997-1998 à 70 millions de boîtes à partir de la saison 2016-2017¹. Plus de 90 % des agrumes en Floride sont infectés², et on estime que l’industrie des agrume Floride perd environ 1 milliard de dollars chaque année en raison de maladies agrumes, dans lequel les citrus greening joue un rôle de premier plan³. Citrus greening se propage principalement par l’envahissant psylle agrume asiatique Diaphorina citri, mais peut également se propager par la greffe de tissus infectés. La maladie provoque le jaunissement des nervures, feuille jaune asymétrique marbrures, défoliation prématurée, brindille dépérissement, pourriture de la racine et mort de la plante. Ce qui est important, la maladie provoque la plante agrume à produire des fleurs hors saison, qui produisent rarement des fruits. Le fruit qui est produit par les plantes agrumes infectés est immatures, vert et amer dégustation⁴.

Le but de cette méthode est à avec précision et identifier précisément la bactérie motile Candidatus liberibacter spp., l’agent causal de citrus greening, vivant dans le phloème d’arbres agrumes infectés⁵. L’ADN génomique est extraite des tissus des feuilles entières, qui contient des bactéries vivantes. Cet extrait d’ADN génomique est utilisé comme modèle pour la PCR classique, où des oligonucléotides complémentaires à la séquence de l’ADNr 16 s de la bactérie sont utilisées pour amplifier cette séquence. Des oligonucléotides complémentaires à un gène FBOX agrume sont utilisés comme un témoin d’amplification interne. Nous avons choisi d’utiliser cette méthode, car il a été prouvé pour réussir dans la recherche précédente⁶.

Cette méthode a l’avantage d’être simple, relativement peu coûteux et apte à être jouée dans n’importe quel laboratoire de biochimie normalement équipée. En outre, la PCR reste la méthode plus précise et exacte pour la détection de ce pathogène, en raison de la difficulté de cultiver ce pathogène⁷et la capacité de l’agent pathogène pour survivre et se reproduire pendant des années au sein d’un hôte asymptomatiques⁸. Nombreux essais PCR de spécialité différents ont été utilisés pour détecter avec succès ce pathogène ; Cependant, PCR classique reste le plus simple test pour la détection précise et spécifique, en particulier dans les hôtes asymptomatiques⁸.

Protocole

1. isoler l’ADN génomique du tissu végétal à l’aide d’un Kit d’Extraction génomique

1. Obtenir des tissus foliaires agrumes en coupant une toute nouvelle feuille d’un arbre d’agrume à l’aide de ciseaux propres et placer la feuille dans un sac à sandwich en plastique.
   Remarque : Le sac contenant les tissus foliaires doit être placé dans un réfrigérateur à 4 ° C ou sur la glace dans un contenant isotherme dès que possible après le prélèvement pour éviter la détérioration.
2. Ajouter une petite quantité d’azote liquide pour refroidir un mortier et un pilon. Alors qu’ils sont froid, utiliser des ciseaux pour découper un petit morceau de tissus foliaires, environ 1 pouce carré en taille. Placez le tissu coupé dans le mortier de le figer instantanément. Ajouter plus d’azote liquide, si nécessaire.
   Remarque : Des gants doivent toujours être portées lors de la manipulation de l’azote liquide.
3. Rectifier rapidement les tissus végétaux en une fine poudre à l’aide de mortier. Continuer de meulage jusqu'à ce que l’azote liquide s’évapore complètement, et reste une fine poudre verte.
4. Brièvement refroidir une spatule métallique dans l’azote liquide pour 10-15 s, puis verser le tissu fondamental dans le mortier dans un tube de microtubes de 1,5 mL, à l’aide de la spatule.
5. Ajouter 600 µL de Solution de lyse des noyaux (voir Table des matières) en utilisant un 1000 µL pipette et vortex l’échantillon pour 1-3 s, puis incuber dans un bain-marie à 65 ° C pendant 15 min.
6. Ajouter 3 µL de Solution de RNase au lysat en utilisant une pipette de 10µL, inverser le tube 2 - 5 fois pour mélanger et laisser incuber à 37 ° C dans une étuve armoire pendant 15 min.
   Remarque : Laissez le mélange refroidir à température ambiante avant de procéder.
7. Ajouter 200 µL de Solution de précipitation de protéine, vortex à haute vitesse pendant 20 s, puis centrifuger pendant 3 min à 13 000 x g pour former une boulette de la ferme. Alors que l’échantillon est être centrifugé, ajouter 600 µL d’isopropanol de température ambiante à un tube de microcentrifuge frais de 1,5 mL.
8. À l’aide d’une pipette de 1000 µL, retirer délicatement le surnageant de l’échantillon centrifugé, transférant dans le tube de microcentrifuge de frais 1,5 mL contenant l’isopropanol. Le plomb peut maintenant être jeté.
   NOTE : Éviter la contamination du surnageant avec protéines en laissant une quantité minuscule de surnageant au-dessus du culot.
9. Inverser le tube jusqu'à ce que l’ADN devient visible comme une masse de brins filiformes, puis centrifuger à 13 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
10. Décanter le liquide surnageant, ajouter 600 µL d’éthanol à 70 % au culot, inverser le tube plusieurs fois pour laver l’ADN et centrifuger à 13 000 x g pendant 1 min.
11. Aspirer l’éthanol, laissant le granule d’ADN lâche, puis ouvrir et inverser le tube, reposant sur du papier absorbant. Sécher à l’air à température ambiante pendant 15 min.
12. Ajouter 100 µL de Solution de réhydratation d’ADN au culot ADN séché, puis incuber l’ADN dans un bain d’eau de 65 ° C pendant 1 h, tout en mélangeant régulièrement, en tapant sur le tube.
13. Déposer sur une cuvette 1 µL d’eau purifiée et l’insérer dans un spectrophotomètre à utiliser comme un blanc. Calculer la concentration d’ADN présent en plaçant 1 µL de l’échantillon sur la cuvette et en insérant dans le spectrophotomètre. Concentration d’ADN (ng/µL) peut être calculé comme (un₂₆₀- un₃₂₀) × facteur de dilution × 50 ng/µL.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. L’échantillon peut être conservée à 4 ° C.

2. effectuer la PCR sur des échantillons d’ADN génomique

1. Combiner les 10 µL 2 x PCR Master Mix (voir Table des matières), 1 µL avant l’apprêt (10 pM/µL), 1 µL reverse primer (10 pM/µL) (voir le tableau 2 pour les séquences d’amorces), 100 ng d’ADN génomique extrait de l’échantillon et purifié l’eau (volume final de jusqu'à 20 µL) dans un 50 µL PCR tube, flick pour mélanger et brièvement centrifugeuse.
2. Insérez le tube de la PCR dans le thermocycleur et dirigent en conséquence (voir tableau 1).
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Si nécessaire, stocker l’échantillon à 4 ° C après que la réaction est terminée.

3. electrophorese de l’amplification de l’ADN dans un Gel d’Agarose

1. Peser la poudre de 0,4 g d’agarose et ajoutez-le ainsi que 1 x TAE tampon dans un 200 mL fiole d’Erlenmeyer, remplissage à 50 mL.
2. Micro-ondes à température élevée pendant 1,5 min, secouant toutes les 30 s, jusqu'à ce que le gel d’agarose est entièrement dissous.
   NOTE : Des gants doivent être portés pendant la manutention des liquides d’agarose pour éviter les brûlures.
3. Ajouter 2,5 µL de bromure d’éthidium 10 mg/mL pour les liquides d’agarose et secouez pour mélanger, puis verser le gel d’agarose liquide dans un moule de gel de niveau. Insérer rapidement des peignes standard 12 dents gel après coulée.
4. Laisser le refroidir pendant 20 min à température ambiante, puis enlever le gel de peignes et placer le gel dans une boîte de gel niveau remplie avec 1 tampon x TAE.
5. À l’aide d’une micropipette, charger les échantillons d’ADN amplifiés totales dans le puits. Ajouter 5 µL de l’ADN d’échelle (voir Table des matières) dans un endroit bien distinct de vos échantillons.
6. ELECTROPHORESE des échantillons pour 35 min à une température constante de 90 V, puis retirer le gel et les placer dans un Transilluminateur UV.
7. Photographier et d’analyser le gel des bandes modèle tout en utilisant la transillumination UV à 302 nm.

Résultats

Un résultat positif donne une bande distincte correspondant à 500 bp pour Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, et/ou une bande distincte correspondant à 700 bp pour Laa2/Laj5, un encart dans le β ribosomique 16 s opéron⁹. La bande de contrôle de l’amplification interne doit également apparaître à 400 bp. Cette bande correspond à l’amplification du gène FBOX agrumes¹⁰

Discussion

Il est essentiel que toutes les étapes sont suivies exactement pour obtenir les meilleures conditions expérimentales. Feuilles entières a été utilisé au cours de cette manifestation ; Toutefois, le protocole peut être modifié pour inclure théoriquement n’importe quel type de tissus végétaux. Auparavant, les chercheurs ont extrait l’ADN génomique de veine les tissus foliaires, plutôt que des tissus de feuilles entières et obtenu des résultats similaires¹¹. Si la bande correspondant au gène FBOX...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Wizard Kit de purification d’ADN génomique	Promega	A1120	Source de lyse des noyaux, RNase, précipitation des protéines et solutions de réhydratation de l’ADN
Azote liquide	Air Products	N/A
Mastercycler pro avec panneau de commande	Eppendorf	6321000019
1250 W Micro-ondes	Panasonic	N/A
5424 centrifugeuse de table	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 bain-marie numérique	Fisher scientific	15-462-15Q
Spatule en métal	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortier et pilon	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Stérile 10 &mu ; Embouts L	TipOne	1161-3730
Stérile 200 &mu ; Embouts L	TipOne	1163-1730
Stérile 1250 &mu ; Embouts L	TipOne	1161-1750
Kit de pipette à volume variable	VWR	75788-460
Bromure d’éthidium	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Acide acétique	Fisher Chemical	A38-212
Base Tris	Sigma-Aldrich	10708976001
&mu ; cuvette	Eppendorf	6138000018
Plateau de coulée empilable et peignes	Carolina	213655
PowerPac Alimentation de base	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Biospectromètre de base	Eppendorf	6135000009
0,2 mL Tubes PCR	Fisher scientific	AB-0620
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Forward Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Reverse Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Water, PCR grade	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ Échelle d’ADN	Thermo Fisher Scientific	10787018