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Article de méthode

Un modèle de souris syngénique Cancer du pancréas pour étudier les effets de l’électroporation irréversible

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DOI :

10.3791/57265

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8 juin 2018

 ,  ,  , 
1Moores Cancer Center, University California San Diego, 2Duke University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Électroporation irréversible (IRE) est une technique d’ablation non thermique utilisée pour le traitement du cancer du pancréas localement avancé. Etant une technique relativement nouvelle, les effets de l’IRE sur la croissance de tumeur sont mal compris. Nous avons développé un modèle de souris syngénique qui facilite l’étude des effets des IRE sur le cancer du pancréas.

Résumé

Cancer du pancréas (PC), une maladie qui tue environ 40 000 patients chaque année aux Etats-Unis, a échappé avec succès plusieurs approches thérapeutiques, y compris les stratégies immunothérapeutiques prometteurs. Électroporation irréversible (IRE) est une technique d’ablation non thermique qui induit la mort des cellules tumorales sans destruction des structures adjacentes de collagènes, permettant ainsi la procédure à effectuer dans les tumeurs très proche des vaisseaux sanguins. Contrairement aux techniques d’ablation thermique, IRE se traduit par la mort cellulaire par apoptose progressive, ainsi que l’ablation immédiate induite par nécrose et est actuellement dans l’utilisation clinique des patients sélectionnés avec PC localement avancé. Un ablatif, procédure spécifique non ciblés comme IRE peut induire une myriade de réponses dans le microenvironnement tumoral. Quelques études ont abordé les effets de l’IRE sur la croissance tumorale dans d’autres types de tumeur, mais aucun n’ont porté sur PC. Nous avons développé un modèle de souris syngénique de PC dans lequel sous-cutanée (SQ) et l’orthotopic tumeurs peuvent être traités avec succès avec IRE dans un milieu hautement contrôlé, facilitant les diverses études longitudinales post procédure. Ce modèle animal constitue un système robuste pour étudier les effets de l’IRE et les moyens d’améliorer l’efficacité clinique de l’IRE.

Introduction

Adénocarcinome canalaire pancréatique (PC) devrait pour devenir la deuxième cause de décès par cancer aux Etats-Unis autour de 2020,1. La grande majorité des patients diagnostiqués avec PC finira par mourir de maladie métastatique lointain2. Le microenvironnement de la PC est notoirement immunosuppresseur et CHIMIOMORESISTANT. Son stroma desmoplastique contient une rareté des lymphocytes T effecteurs (anti-tumor) et une proéminence des leucocytes immunosuppresseurs, y compris les macrophages associées à la tumeur (EAPV), (MDSCs) des cellules myéloïde suppresseur dérivée et regulatory T cells (Tregs)3 . Elles sous-tendent la nécessité d’élaborer des stratégies multimodales qui contrebalancent ces effets du microenvironnement.

IRE a été conçu comme une méthode non thermiques de l’ablation de la tumeur. Contrairement aux techniques d’ablation thermique, IRE ne provoque pas de nécrose coagulantes rapide mais au contraire se traduit par apoptose progressive de mort cellulaire4. Ce qui est important pour les tumeurs du pancréas, IRE n’est pas vulnérable aux effets de « radiateur » et peut être effectuée juste à côté de vaisseaux sanguins5. Cette technologie a l’autorisation 510 (k) de la FDA6 et est actuellement utilisée sur le plan clinique, pour des patients sélectionnés localement avancé ou borderline résécables cancer du pancréas. Dans la plus grande série publiée d’IRE pour PC7, la survie médiane des patients subissant une IRE était environ double la survie des patients traités par chimiothérapie moderne seule sans résection8,9.

Plusieurs études ont démontré que l’ablation thermique induit une réponse immunitaire systémique dans d’autres types de tumeur (examinées par Chu et al. 10).11,12, y compris une augmentation dans les cellules activées tueuses naturelles (NK) de patients du cancer hépatocellulaire13, infiltre l’ablation par radiofréquence (RFA) dans la tumeur animaux modèles conduit à une augmentation des lymphocytes T 14et une diminution des Tregs immunosuppresseurs dans le poumon cancer patients15. Un nombre beaucoup plus restreint d’études ont examiné immunitaire, micro-environnementales et les réponses de la blessure à IRE16. IRE a été montré pour stimuler une réponse immunitaire systémique dans les modèles de souris immunocompétentes dans lequel la croissance des allogreffes de cellules rénales (controlatéral) secondaire a été réduite ou empêchée par IRE d’une tumeur primaire deux semaines plus tôt17. Ils ont également observé que les souris immunocompétentes exigeait moins de tension pour une régression complète que ne souris immunodéprimées. Il a émis l’hypothèse que IRE peut entraîner dans la présentation des antigènes améliorée par rapport à la nécrose coagulantes d’ablation thermique, mais cela n’a pas été spécifiquement étudiée.

Nous avons développé un modèle de souris syngénique du PC de la lignée cellulaire de KPC-Luc 4580 (cadeau de J.J. Yeh à l’Université de Caroline du Nord), qui a été dérivé d’une tumeur qui a mis au point dans un mâle LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + souris, pour étudier les effets les et systémiques de l’IRE18,19. Cette lignée de cellules exprimant luciférase est immunogène et aussi tumorigène chez les souris C57BL/6 immunocompétents lorsque injecté SQ ou orthotopically et fiable produit des métastases hépatiques lorsqu’elle est injectée dans la rate. Nous avons utilisé un générateur d’impulsions programmable onde carrée pour fournir 100 µs impulsions électriques dans un rapport de tension/distance de 1 500 V/cm à l’aide d’une sonde deux-aiguille (séparés par 5 mm) ou platine brucelles-trodes aux tumeurs SQ ou orthotopique, respectivement, en souris pour modéliser les effets de la IRE dans un petit animal.

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Protocole

Toutes les expériences animales effectuées suivant que ce protocole doit être approuvé par le Comité de l’emploi (IACUC) et un institutionnel animalier respectifs. Toutes les procédures décrites ici ont été approuvés par IACUC UCSD.

1. se procurer les animaux receveurs

Remarque : La lignée de 4580 KPC-Luc a été établie d’une tumeur provenant d’un LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + souris (KPC), qui est un modèle issu du génie génétique du PC sur un fond de C57BL/6. L’avantage de cette lignée cellulaire, c’est qu’il exprime constitutivement luciférase-permettant la surveillance des tumeurs dans les modèles orthotopiques. Toutefois, autres lignées cellulaires peuvent également servir tant qu’elles sont compatibles avec le bagage génétique des souris destinataires.

  1. Déterminer les groupes expérimentaux et le nombre d’animaux par groupe à l’avance.
  2. Choisissez l’âge (6 - 10 - semaine vieilles souris recommandés) et le sexe des animaux utilisés selon l’hypothèse et de la lignée cellulaire utilisée.

2. culture cellules

  1. Utilisation Dulbecco modifiée milieu eagle (DMEM) : mélange nutritif F12 (50/50) médias contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % antibiotique de pénicilline-streptomycine (milieux de culture complète) pour la croissance de cellules de KPC-Luc 4580.
  2. Si congelées, dégelez les cellules 4 jours avant l’implantation de la tumeur.
  3. Cultiver les cellules à 37 ° C, avec 5 % CO2 et 95 % d’humidité dans des conditions aseptiques.
  4. Trypsinize les cellules avec 0,25 % trypsine pendant 5 min à 37 ° C avant d’atteindre > 80 % confluence et neutraliser la trypsine en ajoutant deux fois le volume de milieux de culture complet.
    Remarque : Ces cellules n’établissent pas tumeurs efficacement chez les souris s’ils sont utilisés à la confluence de 100 % ou si elles sont repiquées pendant plus de 12 fois. Par conséquent, il est conseillé de geler les cellules à précédents passages sous confluence optimale.
  5. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et passez à l’induction tumorale si un nombre suffisant est présent (0,5 - 1 x 106 cellules/souris). Si ce n’est pas le cas, développez les cellules pour un passage plus jusqu'à ce qu’un nombre adéquat de cellules est obtenu.

3. l’induction de tumeurs SQ

  1. Préparer les documents d’accompagnement : P1000 et P100 pipettes et embouts, seringue de 1 mL, 25G aiguilles, matrice de la membrane basale (BMM), de milieu DMEM de base, 1,5 mL centrifuger les tubes. Gardez tous les matériaux stériles et froids (4 ° C) jusqu'à la fin de la procédure. Aussi garder les tondeuses et les tampons d’alcool prêt à l’utilisation des animaux.
  2. Trypsinize (selon l’étape 2.4) et compter les cellules et les remettre en suspension à une concentration de 2-4 x 107 cellules/mL de DMEM froid.
  3. Ajouter un volume égal de 100 % BMM pour préparer une suspension de la dernière cellule dans 50 % BMM. Le volume final devrait s’élever à 50 µL de la suspension cellulaire pour chaque souris requis. Préparer 10 % en excès pour accommoder l’espace mort dans la seringue et toute erreur de pipettage.
  4. Aliquote la suspension dans 550 µL de volume dans des tubes à centrifuger 1,5 mL placé dans la glace.
  5. Retenir les animaux (souris de C57BL/6 mâles 6 - semaine vieux) à l’aide d’une drisse ou manuellement.
    Remarque : Vous pouvez également souris peuvent être anesthésiés à l’isoflurane 2,5 % dans les gaz d’oxygène à un débit de 2 L/min à l’aide d’un vaporisateur de précision.
  6. Raser le site d’injection, qui est préférablement sur un flanc au-dessus d’une jambe, avec la pince. À l’aide d’un tampon imbibé d’alcool, nettoyez l’endroit de l’injection de deux fois.
  7. Dessiner des 250 µL de suspension de cellules à une concentration finale de 1-2 x 107 cellules/mL dans une seringue de 1 mL froide et éliminez les bulles d’air en déplaçant le piston monte et descend. Fixer une aiguille 25G à la seringue et n’oubliez pas de remplir l’espace au sein de l’aiguille.
  8. Insérer l’aiguille sous la peau à un angle de 30° à l’organisme près les flancs, en veillant à ce que l’aiguille ne pas percer la cavité péritonéale ou la musculature des membres.
  9. Aplatir l’aiguille parallèle au corps et aplanir les rides sur la peau. Injecter lentement 50 µL de la suspension cellulaire. Tenez l’aiguille au point d’injection pendant 10 s pour permettre le BMM se solidifier pour éviter toute fuite.
  10. Retirer doucement l’aiguille en parallèle sans aucun mouvement latéral. Nettoyer le site d’injection avec un tampon imbibé d’alcool en douceur et relâchez le bouton de la souris à son logement.
    Remarque : Si la souris a été anesthésiée au cours de la procédure, surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il retrouve ses réflexes de redressement.
  11. Surveiller la croissance de la tumeur en utilisant régulièrement les étriers jusqu'à ce qu’il atteigne 5 mm de diamètre.

4. l’induction de tumeurs orthotopique

  1. Préparer les documents d’accompagnement. Autoclave l’intervention chirurgicale des outils tels que ciseaux, scalpels, pilotes de l’aiguille et pointé et pince à embout plat. Garder la pratiques sutures stériles (6-0 résorbable et non résorbable 4-0), tampons alcool, tondeuses à cheveux, crème dépilatoire, Lubrifiant oculaire, gaze de coton, solution de 10 % polyvidone iodée, draps chirurgicaux, coussins chauffants, buprénorphine et agents anesthésiques.
  2. Euthanasier une souris donneur (de préférence de la même origine requise pour le modèle orthotopique) transportant une tumeur SQ KPC en utilisant une chambre de remplissage lent CO2 . La tumeur SQ soigneusement dans des conditions stériles sous une hotte de BSL-2 à l’aide de la pince stérile et microciseaux peu avant implantation orthotopique de l’accise. Au cours de l’excision de la tumeur prendre soin de ne pas perforer la cavité péritonéale et laver la tumeur immédiatement avec 2 échanges de PBS stérile.
  3. À l’aide de scalpels stériles, émincer la tumeur excisée en morceaux de3 mm 1, placez-les sur un plat de Pétri contenant froid milieu basal DMEM stérile et conserver sur la glace jusqu'à l’implantation.
  4. Administrer la souris destinataire 0.05 - 1 mg/kg buprénorphine analgésique SQ, 30 min avant la chirurgie.
  5. Anesthésier les souris bénéficiaires à l’isoflurane 2 à 3 % d’oxygène (2 L/min) à l’aide d’un vaporisateur de précision (ou autres agents anesthésiques). Garder la souris sur un 37 ° C chauffage pad pour l’intégralité de la procédure. Appliquer du lubrifiant sur les yeux pour éviter la dessiccation. Tester la profondeur de l’anesthésie par manque d’effaroucher réflexe au départ et confirmer l’anesthésie chirurgicale d’avion par le manque de réflexe pédale à une pincée de doux orteil. Maintenir l’anesthésie pendant toute la procédure chirurgicale.
  6. Placez la souris sur le dos et tourner doucement sur son côté droit pour que le côté gauche de l’abdomen est exposé. Enlever les poils abdominaux de la souris à l’aide de la crème dépilatoire et nettoyer avec de la gaze pour assurer sans cheveux libre pénètre dans l’incision de post abdomen. Préparer l’abdomen gauche d’une intervention chirurgicale à l’aide de 3 cycles de 10 % polyvidone iodée, suivie des lingettes d’alcool pour désinfecter la peau.
  7. À l’aide d’un scalpel stérile, faire une incision transversale ou oblique de 1,5 cm dans la peau, 1 cm à gauche de la ligne médiane, sous la cage thoracique, légèrement médiale de la rate. Puis, de prolonger l’incision à travers la musculature abdominale, mise en miroir de l’incision superficielle sus-jacente.
  8. Localiser la rate à l’aide de plat à bout pinces et doucement il externaliser de la cavité abdominale. Retirer la rate à l’aide d’un applicateur de coton stérile et trouver la queue du pancréas attachée au fond de la rate.
  9. À l’aide de pinces à bout plat, retirer la queue du pancréas latéralement.
  10. Ramasser un tumeur finement hachée de la souris de donneur avec la pointe d’une aiguille fine (6-0) de suture stérile et positionnez-le à l’aide d’une pince stérile.
  11. Alors qu’il se rétracter doucement la queue/corps du pancréas latéralement, insérer l’aiguille de la suture contenant le fragment de la tumeur dans la queue du pancréas. Passez la suture lentement à travers le tissu, tenant la tumeur au contact de la queue du pancréas. Appliquer une ou deux sutures supplémentaires selon l’orientation du fragment en ce qui concerne le tissu.
  12. Retirer complètement l’aiguille du tissu et de garder la pancréas/rate externalisée pour un 60 supplémentaires s lors de l’inspection pour déceler tout signe d’hémorragie ou de fuite. Ensuite, les internaliser doucement dans la cavité abdominale à l’aide de forceps émoussé.
  13. Fermer la musculature abdominale à l’aide d’une suture résorbable 6-0 soit avec une couture continue ou discontinue et fermer la peau sus-jacente à l’aide d’un 3-0 à 6-0 interrompu une suture non résorbable. Interrompre l’anesthésie à ce stade.
  14. Laissez la souris récupérer dans sa cage maison avec libre accès à la nourriture et l’eau. Placer la cage sur un coussin chauffant pour faciliter la récupération. Surveiller les signes vitaux comme la respiration, perfusion etc., pendant le processus de récupération.
  15. Confirmer les signes du réflexe de redressement, une fois que la souris récupère, et puis retour de la cage peut à un logement ordinaire.
  16. Administrer la buprénorphine 0,05 - 0,1 mg/kg toutes les 8-12 h après l’intervention si nécessaire pour des signes de douleur et 8-12 h après la chirurgie.
  17. Surveiller la croissance de la tumeur en utilisant une bioluminescence in vivo , système d’imagerie (voir la Table des matières).
    1. Suivez la croissance tumorale par imagerie commençant au jour 4 après implantation orthotopique et effectuer deux fois par semaine d’imagerie.
    2. Le jour de l’imagerie, administrer (injection intrapéritonéale) 30 mg/kg D-luciférine à une anesthésié souris destinataire (isoflurane 2 à 3 % d’oxygène (2 L/min)) 10 min avant l’imagerie.
    3. Image pour l’activité de la luciférase au réglage de luminescence sans aucun filtre d’émission pendant un minimum de 5 s d’exposition dans un imageur de luminescence avec platine chauffante libre auto-fluorescence et tout en conservant l’anesthésie chez la souris.

5. IRE des tumeurs SQ

  1. Préparer les documents d’accompagnement : carré vague électroporateur, pédale de sécurité, électrodes (tableau d’aiguille par rapport aux pinces-trode) et adaptateurs. Garder les sutures stériles (non résorbable 4-0), tampons alcool, tondeuses à cheveux, crème dépilatoire, Lubrifiant oculaire, gaze de coton, buprénorphine et anesthésiques également à proximité.
  2. Stériliser la pince à épiler ou aiguille électrodes de tableau à l’aide de stérilisation au gaz. Passage à l’autoclave n’est pas recommandé. Utiliser un stérilisateur de perle de verre pour stériliser les électrodes entre animaux.
  3. Administrer la buprénorphine 0,05 - 0,1 mg/Kg pour les souris de tumeur-roulement 30 min avant l’intervention.
  4. Suivez les étapes 4.4-4.5 pour provoquer l’anesthésie chez les souris avec succès une fois que l’implant SQ tumeur atteint 5 mm de diamètre.
  5. Placez la souris anesthésiée sur le côté pour accéder à la tumeur SQ sur le flanc. Enlever les poils à l’aide de tondeuses et peau propre à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool.
  6. Pour les tumeurs SQ, utiliser des électrodes de tableau 2-aiguille. Élever la peau directement sous le site de la tumeur avec une pincette et insérer les électrodes à travers la peau parallèle au corps en vous assurant qu’ils ne pénètrent pas dans la cavité péritonéale. Une fois à travers la peau, placer les électrodes de telle manière qu’ils étrier de la tumeur.
  7. Le programme de l’électroporateur de livrer 100 µs impulsions à une fréquence de 1 Hz à 1 500 V/cm pour un total de 150 pulsations. Livrer les impulsions à l’aide de la pédale. Séparer chaque série de 10 impulsions de 10 s, afin de permettre la dissipation de chaleur et de confirmer la position correcte des électrodes.
    Remarque : Sans l’utilisation d’agents paralytique, souris connaîtra des contractions musculaires avec IRE qui peuvent provoquer des déplacements des électrodes à moins sécurisés manuellement.
  8. Retirez les électrodes après l’administration complète, qui ne doivent pas dépasser 200 Record s. livrée de la tension réelle, qui est affiché sur l’électroporateur. Laissez les souris récupérer après IRE comme par les Etapes 4.14-4.16.

6. IRE des tumeurs orthotopique

NOTE : IRE des tumeurs orthotopique implique une deuxième chirurgie de survie sur la même souris, ce qui nécessite une approbation spéciale de IACUC local avant de commencer.

  1. Préparer le matériel requis : stériliser les instruments chirurgicaux tels que ciseaux, scalpels, pilotes de l’aiguille, fait des pinces et pinces à bout plat. Prendre ce qui suit est proche ainsi : sutures stériles (6-0 résorbable et non résorbable 4-0), tampons alcool, tondeuses à cheveux, crème dépilatoire, Lubrifiant oculaire, gaze de coton, 10 % solution de polyvidone iodée, draps chirurgicaux, coussins chauffants, électroporateur d’onde carrée, pédale de sécurité, électrodes et leurs adaptateurs, buprénorphine et anesthésiques.
  2. Évaluer les souris pour la croissance de tumeur orthotopique par l’imagerie in vivo (Voir l’étape 4.17) par injection de 30 mg/kg de D-luciférine par voie intrapéritonéale.
    Remarque : Les tumeurs orthotopique sont idéales pour IRE traitement 8 à 10 jours après la nidation lorsque les tumeurs sont clairement visibles et encore confiné au pancréas comme on le voit sur les images de luminescence luciférase (voir les Résultats de représentant).
  3. Suivez les étapes 4.4-4.9, pour localiser la tumeur implantée. Si la tumeur n’est pas facile à localiser, utilisez une pince nez émoussée pour déplacer l’estomac et la rate doucement pour identifier la tumeur.
  4. Externaliser la tumeur avec une pince nez émoussé et capturer la tumeur étroitement avec les électrodes de platine de la pince à épiler-trode. Livrer les impulsions d’électroporation comme programmé à l’étape de 5,7 à l’aide de l’onde carrée électroporateur par lots de 10 impulsions contrôlées par la pédale de commande.
  5. Garder la tumeur externalisée pour au moins 60 post s IRE pour surveiller tout signe d’hémorragie. Remettez la tumeur dans la cavité abdominale et refermer l’incision comme décrits plus tôt (étapes 4.13-4.16) et contrôler la souris jusqu'à ce qu’il récupère.
  6. Surveiller les effets de l’IRE sur la croissance tumorale in vivo luciférase imagerie comme par l’Etape 4,17.

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Résultats

Nous avons suivi la procédure décrite ci-dessus et September 5-6 semaine vieilles souris C57BL/6 de type sauvage inoculés avec 1 x 106 cellules avec 50 % de tumeurs SQ BMM. Lorsque la taille de la tumeur a atteint 5-6 mm de diamètre, quelques-uns des souris ont été euthanasiés, leurs tumeurs ont été excisées et implantés orthotopically chez les souris C57BL/6 un destinataire. IRE a effectué 10 jours après la nidation, comme le montre la chronologie sur la F...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons démontré un modèle de souris immunocompétentes pour PC qui peut être utilisé pour étudier les effets de l’IRE sur la croissance de la tumeur. Actuellement, IRE est utilisé comme une technique d’ablation non-thermique uniquement chez les patients de PC localement avancés hautement sélectionnés qui n’ont pas de progression de la maladie lointain après des mois de thérapie préopératoire. Son utilisation a donc été limitée car la plupart des patients avec PC localement avancés développent lointai...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune divulgation financière pertinente.

Remerciements

RRW a reçu le soutien pour ce travail d’une subvention de recherche concertée translationnelle financés par la pédale de Padres de San Diego C3 la Cause (#PTC2017).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ECM 830 électroporateur à ondes carréesHarvard ApparatusBTX # 45-0002 ( 58018-004 )
2 aiguille réseau d’électrodesHarvard Apparatus45-0167
Pédale de sécuritéHarvard Apparatus45-0211
Platinum Tweezer-trodeHarvard Apparatus  ; 45-0486
DMEM-F12 médiaThermoFisher Scientific11320-033
Sérum de veau fœtalThermoFisher Scientific10437028
TrypsineThermoFisher Scientific25200056
MatrigelCorning  ;354230
IsofluraneSigma-Aldrich, Inc.
LacrilubeFisher Scientific  ;
BuprénorphineFisher Scientific  ;
D-luciferrinePerkin Elmer122799
IVIS. Système d’imagerie in vivo PerkinElmer124262
souche de souris C57BL/6JThe Jackson Laboratory  ;000664/Black 6
Cell line (KPC-Luc 4580)J.J. Yeh Lab à l’Université de Caroline
Aiguilles de seringue BD PrecisionglideSigma-Aldrich, Inc.
Écouvillon d’alcool Z192406 (alcool isopropylique à 70 %)BD326895
Pieds à coulisse numériquesThermoFisher Scientific14-648-17
Scalpels jetables, stérilesVWR21909
Applicateurs à pointe de cotonVWR89198
Aiguille de suture, 45 cm, taille 6-0Appareil de Harvard72-3308
Aiguille de suture, 45 cm, taille 4-0Harvard Apparatus72-3314
Povidone-iode 10 %BD29900-404
Coussin chauffant jetable  ;KENT SCIENTIFIC CORP.TP-3E
Tondeuse à cheveux de sourisKENT SCIENTIFIC CORP.CL8787
Champ chirurgicalHarvard Apparatus59-7421
Saline tamponnée au phosphateThermoFisher Scientific10010023
79263219090646NC1292810du Nord

Références

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Induction de tumeurs sous cutan esimplantation de tumeurs orthotopiquessouris immunocomp tentesvaluation de la croissance tumoraleadministration d impulsions d lectroporationanalyse histologiquevaluation de la n crose tumoraletudes de combinaisons de traitements
Un modèle de souris syngénique Cancer du pancréas pour étudier les effets de l’électroporation irréversible
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