Method Article

Génération de plantes transgéniques avec Insertions de copie unique à l’aide du vecteur binaire BIBAC-GW

DOI:

10.3791/57295

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March 28th, 2018

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1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un vecteur binaire pBIBAC-GW permet de générer des plantes transgéniques avec insertions de simple copie intactes, un processus facile. Une série de protocoles est présentée ici, qui guide le lecteur à travers le processus de génération des plantes transgéniques d’Arabidopsis et tester les plantes pour l’intégrité et de copier le nombre des plaquettes.

Abstract

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Lors de la génération de plantes transgéniques, en général, l’objectif est d’avoir une expression stable d’un transgène. Cela nécessite une intégration unique et intacte du transgène, copies plusieurs intégrations sont souvent victimes de silençage génique. Le vecteur binaire compatible Gateway basé sur les chromosomes artificiels bactériens (pBIBAC-GW), comme les autres dérivés de pBIBAC, permet l’insertion de transgènes exemplaire unique avec une grande efficacité. Comme une amélioration à le pBIBAC originale, une cassette de passerelle a été clonée en pBIBAC-GW, afin que les séquences d’intérêt peuvent maintenant être facilement incorporés dans l’ADN (ADN-T) de transfert de vecteur par clonage Gateway. Communément, la transformation avec pBIBAC-GW se traduit par une efficacité de 0,2 – 0,5 %, selon laquelle la moitié de la transgénèse portent une intégration simple copie intacte de l’ADN-T. Les vecteurs pBIBAC-GW sont disponibles avec résistance au Glufosinate-ammonium ou DsRed fluorescence dans les téguments de sélection dans les plantes et résistance à la kanamycine comme une sélection chez les bactéries. Ici, une série de protocoles est présentée qui guident le lecteur à travers le processus de génération de plantes transgéniques à l’aide de pBIBAC-GW : à partir de recombiner les séquences d’intérêt dans le vecteur pBIBAC-GW de choix, de planter la transformation avec Agrobacterium, sélection de la transgénèse et tester les plantes pour intact et copie le numéro des inserts utilisant l’ADN buvard. Attention est accordée à la conception d’une stratégie de transfert de l’ADN de reconnaître single - et multi - multicopies intégrations à locus unique et multiple.

Introduction

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Lors de la génération de plantes transgéniques, généralement l’objectif est d’avoir les transgènes intégrés exprimée de façon stable. Ceci peut être réalisé par intégrations exemplaire intact d’un transgène. Plusieurs intégrations peuvent conduire à une augmentation de l’expression d’un transgène, mais aussi de silençage génique. Silencieux d’échappement de transgènes est plus probable si les séquences insérées sont disposées en tandem ou des séquences inversées répétées1,2,3,4. Vecteurs binaires servent de navettes à Agrobacterium-médiée par des expériences de transformation pour livrer les séquences d’intérêt dans les génomes de plantes. Le nombre d’intégrations dans un génome végétal dépend du nombre de copies du vecteur binaire à Agrobacterium tumefaciens5,6. Beaucoup de vecteurs binaires couramment utilisés sont des vecteurs d’élevé de copies et donnent donc un nombre de copies de transgènes moyenne haute : copies de 3,3 à 4,9 dans Arabidopsis5.

Le nombre d’intégrations de l’ADN-T peut être abaissé à l’aide de vecteurs binaires qui ont un certain nombre de faibles copies dans a. tumefaciens, tels que BIBAC7, ou en lançant un ADN-T de l’a. tumefaciens du chromosome5. Le nombre moyen d’intégrations de transgene dans de tels cas est inférieur à 25,8,9,10. Car elle a été exemplaire unique dans a. tumefaciens et aussi chez Escherichia coli, BIBAC-dérivés peuvent maintenir et livrer des constructions plus grandes que 150 Ko,11.

GW-compatible BIBAC vecteurs10,12 permettre une introduction facile des gènes d’intérêt dans le vecteur à l’aide de clonage Gateway. L’utilisation de la technologie de passerelle qui simplifie grandement la procédure de clonage, mais aussi permet de surmonter les problèmes communs associés à13,grands vecteurs de basse-copie-numéro14, comme un faible rendement de l’ADN et une sélection limitée de restriction uniques sites disponibles pour le clonage de7,11. Les dérivés pBIBAC-GW sont disponibles avec une résistance au Glufosinate-ammonium (pBIBAC-BAR-GW) ou DsRed fluorescence dans les téguments (pBIBAC-DP-GW) de sélection dans les végétaux (Figure 1)10,12. Pour les deux vecteurs, un gène de résistance kanamycine est utilisé comme marqueur de sélection chez les bactéries.

Combinent les vecteurs pBIBAC-GW : (1) simplifie la conception et la manipulation génétique chez e. coliet (2) intact simple copie intégrations en planta à haute efficacité. Le rendement des vecteurs pBIBAC-GW intégrations moyenne 1,7 chez Arabidopsis avec environ la moitié des plantes transgéniques portant un seul intégré l’ADN-T10.

L’expression stable de transgènes est une exigence pour la plupart transgéniques générées. Expression du transgène stable est possible par des intégrations intactes, exemplaire unique. Toutefois, travailler avec des plantes transgéniques porteuses intégrations intactes, exemplaire unique est encore plus important si, par exemple, le but est d’étudier l’efficacité des processus axés sur la chromatine, tels que la mutagénèse, recombinaison, ou la réparation et la dépendance à l’égard de ces processus sur l’emplacement de la génomique et la structure de la chromatine au site d’insertion. Pour notre intérêt, pour étudier la dépendance de la mutagénèse oligonucléotide réalisé (ODM) sur le contexte local de génomique, un ensemble de lignes de journaliste avec des intégrations intacts, de la simple copie d’un gène rapporteur de mutagenèse a été généré (Figure 2)10. À l’aide de cet ensemble de lignes, il a été démontré que l’efficacité de l’ODM varie entre locus transgéniques intégrés à différents endroits de génomiques, malgré les niveaux d’expression de transgènes plutôt semblables.

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Protocol

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1. insertion de séquences d’intérêt en vecteur binaire

  1. Préparer l’entrée de la porte d’entrée et vecteurs binaires.
    1. Isoler le vecteur d’entrée passerelle contenant un fragment d’ADN ou le gène d’intérêt à l’aide d’un kit de mini-préparent selon les suggestions du fournisseur.
      NOTE : BIBAC-GW vecteurs nécessitent l’utilisation de kanamycine (Km) pour la sélection chez les bactéries, par conséquent, utiliser un vecteur d’entrée avec un autre marqueur de résistance au lieu de la kanamycine. Par exemple, le vecteur de la pENTR-gm, portant un gène de résistance gentamicine, est un bon choix de12.
    2. Propager et isoler le vecteur BIBAC-GW d’intérêt. Utilisez une souche d’e. coli qui résiste à la toxicité du gène BCDC présente au sein de la cassette de la passerelle. Isolat BIBAC-vecteurs en utilisant des protocoles ou des kits spécialement conçu pour les grands plasmides selon les suggestions du fournisseur.
  2. Effectuer une réaction de la passerelle.
    1. Préparer la réaction de recombinaison LR selon les suggestions du fournisseur. Mélanger les composants suivants dans un tube de microtubes de 1,5 mL à température ambiante (RT) : 100 – 300 ng clone d’entrée (surenroulé), 300 ng du vecteur BIBAC-GW, tampon de réaction Clonase LR (concentration finale : 1 x). Régler le volume du mélange à 16 µL avec TE (10 mM Tris, 1 mM d’EDTA, pH 8,0). Enfin, ajoutez 4 µL de mélange enzymatique Clonase LR et mélanger au vortex. Incuber le mélange à 25 ° C pendant 1 h.
    2. Au mélange prêt à l’étape 1.2.1, décharger la réaction LR en ajoutant 2 µL de solution de protéinase K (2 µg/µL). Mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant 10 min.
  3. Transformer des e. coli avec le mélange réactionnel passerelle par électroporation.
    1. Dessalement le mélange réactionnel LR avant l’électroporation.
      Remarque : Cette étape est critique pour l’électroporation réussie. Ci-dessous une dialyse méthode est décrites, mais d’autres méthodes comme la précipitation avec de l’acétate de sodium et l’éthanol peut aussi être utilisé.
      1. Préparer l’installation d’une dialyse de filtre de la réaction de LR. Verser 20 mL d’eau désionisée ultrapure dans une boîte de Petri stérile. Placer un disque de filtre de membrane (taille des pores = 0,025 µm) sur la surface de l’eau.
      2. Déposer la réaction LR ensemble soigneusement sur le dessus de la membrane et permettre le mélange de dialyser à ta pendant 1 h.
    2. Ajouter 5 µL du mélange morue dessalée LR à cellules DH10B electro dans une cuvette d’électroporation (0,1 cm). Electroporate les cellules (1,5 V/cm, résistance 200 Ω, capacité 25 µF) et immédiatement ajouter 1 mL de milieu de répression (SOC) préchauffé Super catabolique optimale aux cellules, suivies d’une incubation à 37 ° C pendant 45 min, 180 tr/min. (Moyenne SOC, extrait de 1 l : 20 g de Bacto tryptone, 5 g de levure, 0,5 g de NaCl, 2,5 mL de KCl 1M, 20 mL de 1 M stérilisée par filtration Glucose).
      Remarque : Les cellules de DH10B peuvent être substituées à autres cellules d’Escherichia coli qui maintiennent solidement les plasmides.
      Remarque : Les conditions optimales d’électroporation dépendent de l’électroporation de dispositif utilisé.
    3. Granulés de bactéries à la vitesse maximale pendant 30 s en utilisant une micro-centrifugeuse, enlever l’excès SOC et Resuspendre le culot dans environ 50-100 µL de milieu Luria-Bertani (LB). Transmettre la bactérie sur des plaques de kanamycine-LB (Km-LB) (concentration Km, 40 µg/mL) et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit. (Milieu LB, 1 l : 10 g de Bacto tryptone, 5 g de levure extrait, 10 g de NaCl. Pour milieu solide ajouter agar, 15 g/L).
  4. Identifier les dérivés BIBAC-GW recombinés et isoler l’ADN de plasmide.
    1. Pour être capables de se développer sur des plaques Km-LB, les cellules d’Escherichia coli devraient contenir le plasmide recombiné de BIBAC-GW dans lequel la séquence de la BCDC est remplacée par l’insertion désirée. Colonie Polymerase Chain Reaction (PCR)15 permet de contrôler si les colonies de bactéries de la plaque contient les plasmides corrects, vu la colonne vertébrale BIBAC-GW et l’insert d’intérêt.
      1. Pour identifier la colonne vertébrale pBIBAC-BAR-GW, effectuer une réaction de15 PCR avec des amorces DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 'et DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Cet ensemble d’apprêt afin d’amplifier un fragment bp 563 du gène bar .
      2. Pour vérifier la présence de la colonne vertébrale BIBAC-DP-GW, effectuer une réaction de PCR15 , à l’aide d’amorces M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 'et M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Cette combinaison d’amorces afin d’amplifier un fragment de bp 791 chevauchant la séquence cruciferin de promotor et DP .
      3. Effectuer des réactions de15 de PCR utilisant des amorces spécifiques aux gènes pour vérifier la présence de l’insert d’intérêt.
    2. Ensemencer une seule colonie positive en 2 à 5 mL de milieu LB contenant la kanamycine (40 µg/mL) pour DNA isolation16. Incuber à 37 ° C dans un agitateur orbital à 180 tr/min, du jour au lendemain.
    3. Isoler l’ADN de plasmide (voir étape 1.1.2).

2. Elaboration d’a. tumefaciens Floral assaisonnée d’Arabidopsis

  1. Transformer les dérivés BIBAC-GW à a. tumefaciens.
    1. Préparer des cellules capables d’electro Helper de souche C58C1 portant le pCH32 d’a. tumefaciens plasmide7. Croissance de bactéries en présence de tétracycline (5 µg/mL) et de la rifampicine (100 µg/mL) pour sélectionner pour pCH32 et assurer une croissance de seulement les cellules Agrobacterium .
    2. Ajouter 0,25 à 0,5 µg ADN d’un dérivé de pBIBAC-GW, préalablement dissous dans 10 à 20 µL stérile ultrapure eau désionisée, à 20 cellules de Agrobacterium compétentes µL dans des cuvettes d’électroporation (0,1 cm). Garder les cellules sur la glace.
    3. Electroporate les cellules (1,5 V/cm, résistance 400 Ω, capacité 25 µF). Immédiatement après l’électroporation, ajouter 1 mL de milieu de SOC pré chauffé (28 ° C) pour les bactéries et incuber les cellules à 28 ° C pendant 60 à 90 min.
    4. Propage 100 µL et le reste de la bactérie sur des plaques LB distinctes contenant de la rifampicine (100 µg/mL), kanamycine (40 µg/mL) et la tétracycline (5 µg/mL) et incuber dans l’obscurité à 28 ° C pendant 1 à 2 jours.
  2. Préparer la suspension d’Agrobacterium .
    1. Vérifier, par PCR, un couple des colonies a. tumefaciens de la plaque préparée à l’étape 2.1.4, la présence du vecteur correct (voir étape 1.4.1).
    2. Ensemencer une seule colonie confirmée pour contenir le vecteur binaire avec l’insert approprié sur un plat de livre contenant des antibiotiques (voir étape 2.1.4). Croître à 28 ° C durant la nuit.
    3. Répétez les rayures avec une seule colonie, obtenue à l’étape 2.2.2.
    4. Ensemencer une seule colonie de 2,5 mL de milieu LC additionné d’antibiotiques (voir étape 2.1.4) pour préculture. Incuber à 28 ° C pendant au moins 8 heures ou toute la nuit, à 180 tr/min. (Moyenne de LC, 1 l : 10 g de Bacto tryptone, 5 g de levure extrait, 0,5 g de NaCl, 2,5 g de MgSO4 · 7 H2O, 2 g de Maltose).
    5. Ajouter la préculture d’étape 2.2.4. jusqu'à 250 mL LC additionné d’antibiotiques (voir étape 2.1.4) et poussent à 28 ° C, à 180 tr/min, du jour au lendemain.
    6. Pellet la culture de la filature à 5 500 g pendant 12 min. Resuspendre le culot dans 100 mL de solution contenant 5 % de sucrose, 0,05 % Silwet L-77, 0,5 x MS. Pour la suspension dans un contenant stérile pour tremper floral des plantes.

3. Transformation d’Arabidopsis

  1. Préparer les plantes Arabidopsis transformation.
    1. Faire pousser des plantes Arabidopsis dans une chambre de croissance maîtrisée à effet de serre ou du climat jusqu'à ce qu’ils sont en fleur (12 pots avec 9 plants de chaque par trempage).
    2. Clip les boulons premières pour permettre plus de boulons secondaires à émerger. Les plantes sont prêts pour tremper 4 à 6 jours après la ligature, lorsque les plantes ont de nombreux capitules immatures et pas beaucoup fécondé siliques.
  2. Plongement floral
    1. Tremper les inflorescences pour 5 à 10 s en suspension Agrobacterium préparée à l’étape 2.2.6. Utilisez l’agitation douce.
    2. Envelopper les parties hors-sol des plantes s’accrochent film pour garder l’humidité élevée et couvrir les pots de plantes avec une boîte pour conserver les plantes dans l’obscurité. Incuber les plantes pendant 2 jours dans une chambre de serre/croissance.
    3. Retirez la boîte et le film s’accrochent et cultiver les plantes à maturité dans une chambre de serre/croissance.
      Remarque : Pour augmenter l’efficacité de transformation, les mêmes plantes peuvent être re-croisement de 7 jours après le premier trempage.
    4. Récolter les graines. Piscine et analyser les graines (T1) des plantes, transformés par la construction même, comme un jeu unique.
  3. Écran pour les plantes transgéniques.
    1. Pour dépister les plantes transgéniques transformées avec un dérivé de pBIBAC-DP-GW, analyser les graines à l’aide de la microscopie de fluorescence. Afin de détecter les téguments expression DsRed, image les graines à une excitation de 560 nm et d’émission de 600 – 650 nm. Séparer les graines fluorescents des homologues non fluorescent avec une pincette.
    2. Pour dépister les plantes transgéniques transformées avec un dérivé de pBIBAC-BAR-GW, semer les graines dans des bacs remplis de terre (~ 2 500 graines/0,1 m2). Afin d’assurer une diffusion même des graines sur les plateaux, suspendre les graines dans la gélose de 0,1 % à 0,5 x milieu de Murashige Skoog (MS) et répandre les graines à l’aide d’une pipette de 1 mL.
      Remarque : Afin de stimuler les graines à germer de manière synchrone, incuber les graines pendant au moins 2 jours à 4 ° C. Cela peut être fait avant ou après le semis des graines.
      1. Pulvériser les jeunes plants avec solution de Glufosinate-ammonium 0,5 % 2 semaines et 3 semaines après le semis en caissettes. Utiliser 500 mL de solution de Glufosinate-ammonium par 1 m2.
      2. Transférer survivants semis dans des pots individuels. Une image typique d’un plateau avec des semis avant et après traitement de Glufosinate-ammonium (deuxième) sont indiquées à la Figure 3.
      3. Analyser les plantes résistant au Glufosinate-ammonium par PCR pour la présence de la construction d’intérêt (Voir l’étape 1.4.1. pour les amorces).
        1. Isoler l’ADN génomique végétale pour PCR à l’aide de la méthode décrite par Edwards et al. 17

4. caractérisation transgéniques pour le nombre et l’intégrité des intégrations de l’ADN-T

  1. Stratégie des digestions de restriction
    NOTE : Déterminer le nombre d’intégrations de l’ADN-T et leur intégrité par ADN éponger à l’aide d’enzymes de restriction. Cette méthode permet d’identifier unique, mais également les intégrations aux loci identiques ou différents dans le génome.
    1. Une série de digestions de restriction permet d’identifier les modes d’intégration différents possibles :
      1. Sélectionnez une enzyme qui coupe une fois dans le milieu de l’ADN-T, pour en sonder indépendamment des séquences en amont et en aval du site de restriction (Figure 4 a et Figure 7 a-C). Voir la Figure 4 aet la légende de la figure pour les résultats attendus et l’interprétation.
      2. Sélectionner une enzyme ou une combinaison d’enzymes en découpant la séquence entière d’intérêt à la fois (Figure 4 b et Figure 7 a-D). Tout écart par rapport à la longueur connue indique la troncation de la cassette intégrée.
        Remarque : Veillez à n’utiliser que des enzymes de restriction qui ne sont pas sensibles à la méthylation de la cytosine.
  2. Préparer les échantillons d’ADN génomiques.
    1. Isoler l’ADN génomique de plantes porteuses de la construction d’intérêt. Une méthode de miniprep CTAB ADN peut être utilisée pour l' isolement de l’ADN18. Pour l’ADN de la tache analyse d' Arabidopsis ADN, 2 – 2,5 µg d’ADN génomique est nécessaire. Dissoudre l’ADN dans 50 µL de TE.
    2. Vérifier l’intégrité de l’ADN par électrophorèse de gel de16. L’ADN génomique intact migre comme une discrète bande en haut du gel. Dégradation de l’ADN peut être reconnue comme la présence d’un frottis. Pour éviter les dommages à l’ADN en raison de gel-dégel répété, des échantillons d’ADN génomiques sont conservés à 4 ° C.
    3. Digérer l’ADN génomique (2 – 2,5 µg dans le cas de l’ADN génomique d’Arabidopsis ) dans un volume total de 50 µL, du jour au lendemain, en utilisant des conditions de tampon proposées par le fournisseur de l’enzyme.
      1. Dans un tube à essai, mélanger 2 – 2,5 µg d’ADN génomique d’Arabidopsis , 5 µL de tampon de restriction x 10 et 5 U restriction enzyme dans un total de 50 µL d’eau déionisée ultrapure.
    4. Ajouter colorant de chargement (1 x concentration finale) pour les échantillons de restriction avant du charger sur un gel. Pour le bon suivi visuel, utilisez une des valeurs suivantes : co-migre avec de petits fragments (bleu de bromophénol, bp 350 – 400), ou co-migre avec les plus grands fragments (Cylene cyanol, kbp 3 – 4).
  3. Exécutez le gel de l’ADN.
    1. Préparer un long (20 cm) 0,5 x TBE de gel d’agarose19. Le pourcentage d’agarose dans le gel dépend de la taille de fragment attendue. 0,8-1 % sépare optimale des fragments > 1 Ko de taille. Utiliser 1 – 1,5 % d’agarose pour fragments < 1 Ko. N’ajoutez pas de bromure d’éthidium dans le gel. (5 x TBE, 1 l : 54 g de Trizma base, 27,5 g d’acide borique, 3,75 g d’EDTA).
      Remarque : Pour empêcher la contamination de l’ADN, utilisation des plateaux de gel qui ne servent pas à fractionner le plasmide et PCR ADN amplifié.
    2. Charger les échantillons sur le gel de19.
    3. Ajouter des marqueurs de l’ADN au gel qui se trouvent dans la gamme de taille des fragments attendus. Charge environ 1 µg de marqueur (50-250 ng de fragments de tailles différentes) sur le gel pour permettre la visualisation par la lumière UV.
    4. Taille-fractionner l’ADN à une tension faible (40 à 50 V/500 mA) du jour au lendemain.
  4. Se préparer pour le transfert de l’ADN du gel d’agarose à la membrane en nylon.
    1. Transférer le gel dans un bac séparé et souiller pendant 20 à 25 min en 0,5 x TBE contenant du bromure d’éthidium (5 µg/mL) en tournant à 40 tr/min dans un agitateur orbital.
    2. Visualiser le gel sur un Transilluminateur UV. Vérifier la séparation de la taille de l’ADN génomique, avec visibilité des bandes discrètes satellite (Figure 5 a). Un frottis vers des tailles de poids moléculaire inférieurs indique la dégradation de l’ADN.
    3. Sur le transilluminateur UV, posez une transparence sur le gel et marquer la position des bandes de repère et les fentes avec un marqueur (Figure 5 b). Cela facilitera la détermination de la taille des fragments hybrides plus tard dans le cas où les séquences de marqueur ne s’hybrident pas spécifiquement avec la sonde ADN. En indiquant les fragments de marqueur à cette étape, il est possible de surveiller la taille des fragments qui s’hybrident.
    4. Placer le gel dans la barre d’État, rincer à l’eau déionisée ultrapure et il submerge à 0,25 M HCl pendant 15 min à la fragmentation de l’ADN dans le gel. Laver à l’eau déionisée ultrapure. Utiliser suffisamment de HCl et l’eau pour couvrir le gel dans la barre d’État et faire pivoter le plateau contenant le gel submergé à 40 tr/min dans un agitateur orbital.
    5. Incuber le gel dans le tampon de dénaturation pour 30 min. laver à l’eau désionisée ultrapure. Utiliser suffisamment de mémoire tampon et l’eau pour couvrir le gel dans la barre d’État et faire pivoter le plateau contenant le gel submergé à 40 tr/min dans un agitateur orbital. (Tampon de dénaturation : 0,5 M NaOH, 1,5 M de NaCl).
    6. Incuber le gel dans le tampon de neutralisation pour 30 min. laver à l’eau désionisée ultrapure. Utiliser suffisamment de mémoire tampon et l’eau pour couvrir le gel dans la barre d’État, de faire pivoter le plateau avec gel submergé à 40 tr/min dans un agitateur orbital. (Tampon de neutralisation : 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7,6).
  5. Transfert de l’ADN d’une membrane de nylon.
    1. Préparer l’installation de transfert capillaire de l’ADN génomique. Placez une plaque de plastique (environ la taille du gel ou plus grand) sur un plateau rempli de 20 x saline-sodium citrate (SSC). Plier un morceau de papier filtre épais sur le bac, afin que tous les deux de ses extrémités sont accrochent dans le SSC. Couper un morceau de taille gel de membrane de nylon chargé positivement Hybond N + et 2 morceaux de papier filtre épais. (20 x SSC : 3 M NaCl, Citrate de Sodium 0,3 M).
    2. Préparer l’installation de buvard (Figure 6) en plaçant le gel, fentes vers le bas sur le dessus du filtre en papier sur la plaque en plastique. Poser une membrane Hybond superisolants dessus, suivie de 2 couches de papier filtre. Pré mouillage chaque couche dans 20 x SSC avant de les ajouter à l’Assemblée. Veillez à enlever les bulles d’air entre les couches qu’elles entravent le transfert de l’ADN.
    3. Couvrir l’Assemblée d’une épaisse couche de papier de soie. Placez une plaque de plastique d’un poids, comme une petite bouteille, sur le dessus. Assurez-vous que la pression est également divisée sur le gel. Cela assurera le transfert de l’ADN.
      Remarque : Le poids doit être environ 200 à 300 g ; poids lourds entravent le transfert de l’ADN.
    4. Couvrir la zone entourant l’Assemblée, notamment exposé papier-filtre, s’accrochent film (Figure 6) pour éviter l’évaporation du 20 x SSC tampon et cible que le capillaire des forces vers la membrane de nylon. Tache du jour au lendemain.
    5. Marquer la position de la machines à sous, nom, ou la date sur le dessus de la membrane avec un crayon et retirer la membrane de l’ensemble. Notez que la partie inférieure qui a été en contact avec le gel, porte l’ADN.
    6. Immédiatement fixer l’ADN à la membrane par irradiation aux rayons UV (2 400 µJ/m2) à l’aide d’un RETICULATION UV.
      Remarque : Des conditions de réticulation dépendent du type de membrane utilisée.
      Remarque : À ce stade la membrane peut être conservée à-20 ° C et utilisée pour l’hybridation avec une sonde plus tard. Rincer la membrane réticulée dans 2 x SSC et seal il plié en avant tube polyéthylène thermosoudable avant de le placer à-20 ° C.
  6. Préparer la sonde pour l’hybridation.
    1. Amplifier la séquence à utiliser comme la sonde pour éponger de l’ADN par PCR20. 50-100 ng d’un fragment PCR de 250 bp-2 kbp est utilisé comme sonde. Deux sondes distinctes, une hybridation de la région proximale de la bordure droite et l’autre à la région proximale du bord gauche de l’ADN-T, peuvent être utilisées pour évaluer la présence de l’ADN-T entière (Figure 4 a et Figure 7).
    2. Diluer 50-100 ng du produit PCR dans 24 µL d’eau déionisée ultrapure dans un tube à essai.
    3. Dénaturer le produit PCR dilué en la faisant bouillir pendant 5 min dans un bécher d’eau ou bloc chauffant, puis refroidir sur glace.
    4. Dégelez premade GCT-mix sur la glace. (GCT-mix : avis, dCTP, dGTP dTTP (tous les 0,5 mM), aléatoire hexamères 43,2 ng/µL, Acetylated BSA 1,33 mg/mL, 33 mM de β-mercaptoéthanol, 0,67 M Hepes, 0,17 mM Tris pH 6,8, 17 mM MgCl).
    5. Ajouter 21 µL du mélange GCT et 2 U de Klenow fragment du produit de PCR.
    6. Ajouter 2 µL de [32P] ATP au mélange et laisser incuber à 37 ° C pendant 1 h.
      ATTENTION : Toutes les étapes impliquant [32P] ATP nécessaire à effectuer dans un environnement désigné pour travail radioactive lors de l’utilisation d’une protection appropriée.
      Remarque : Assurez-vous que l’ATP [32P] est frais (pas plus de 1 mi-temps a réussi).
    7. Préparer un G-50 de Sephadex colonne (grossière ou moyenne)21 pour la purification de la sonde de nucléotides (radioactifs) non constituées en société. Prenez une seringue de 2 mL et couvrir la prise avec un petit cercle de papier filtre épais. Ajouter 2 mL de Sephadex G-50 dissous dans TE dans la seringue et évacuer tout le liquide de la colonne de la filature.
    8. Placer la colonne dans un tube en plastique de 15 mL, charger la sonde sur la colonne et essorer à température ambiante (définir la centrifugeuse à x 750 g, permettre la tr/min augmenter jusqu'à 750 x g est atteint, puis arrêter la centrifugeuse et permettent la rotation tomber à 0 x g) pour éluer la sonde. Ajouter 200 µL de TE à la colonne et l’essorage pour Éluer la sonde restante ; répéter une fois. Dans ces conditions, les fragments d’ADN marqués sont exclus de la matrice de Sephadex et éluer, tandis que les nucléotides libres restent dans la colonne.
    9. Utiliser 300 µL de la sonde par le tube de l’hybridation. Garder la reste de la sonde marquée à-20 ° C pour un usage ultérieur. Toutefois, n’oubliez pas la moitié du temps de l’ATP [32P].
  7. Hybrider la tache de l’ADN.
    1. Heat 2 x SSC et un tampon d’hybridation (15 mL / tube d’hybridation, maximum de 2 taches par tube) à 65 ° C. (Tampon d’hybridation : sulfate de dextran de 10 %, 1 % SDS, 1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, dissoudre à 65 ° C, maintenir aliquotes à-20 ° C).
    2. Préchauffer le four d’hybridation à 65 ° C.
    3. Placer les mailles de nylon dans un plateau avec un peu de chaud (65 ° C) 2 x SSC pour couvrir le plateau. Placer la tache de l’ADN sur le dessus de la maille, avec le côté de l’ADN vers le haut. Rouler la tache avec la maille et insérer le rouleau dans un tube de l’hybridation. Égoutter l’excès 2 x SSC.
    4. Dans un tube de microcentrifuge, faire bouillir 150 µL d’ADN de sperme de saumon (concentration 10 mg/mL) par tube d’hybridation pendant 5 min (voir aussi l’étape 4.6.3). Refroidir immédiatement sur la glace et ajouter de la mémoire tampon d’hybridation préchauffée.
    5. Ajouter la solution de sperme de saumon tampon hybridation au tube avec la tache. Avant de s’hybrider à 65 ° C pendant au moins 1 h dans une roue en rotation, à 12 tr/min.
    6. Lors de l’incubation préalable à l’étape 4.7.5. est presque terminé, faire bouillir 300 µL de la sonde pendant 5 min (voir aussi l’étape 4.6.3) et ajoutez immédiatement à la tache après l’incubation.
    7. S’hybrident du jour au lendemain dans la roue en rotation à 63 ° C, 12 t/mn. Ne pas pipeter la sonde directement sur la tache, mais dans la solution de sperme de saumon tampon hybridation.
  8. Lavez la tache.
    1. Préchauffer les solutions de lavage (1 x PESS, SDS 0,1 % et 0,1 x SSPE, SDS 0,1 %) à 65 ° C. (20 x SSPE : 3 M NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7,0).
    2. Jeter la solution d’hybridation et ajouter environ 100 – 150 mL de 1 x SSPE, solution SDS 0,1 % sur le tube de l’hybridation, fermer le tube et tournez à la main. Verser l’hybridation et la solution dans les déchets radioactifs liquides appropriés de lavage.
    3. Ajouter environ 100 – 150 mL de 1 x SSPE, solution SDS 0,1 % dans le tube, fermer et incuber le tube à 63 ° C dans la roue en rotation, 12 t/mn pendant 15 minutes. Jeter la solution de nettoyage appropriée.
    4. Ajouter environ 100 – 150 mL de 0,1 x SSPE, solution SDS 0,1 % sur le tube de l’hybridation, fermer et faire pivoter le tube pendant 5 min à 63 ° C, 12 t/mn. Jeter la solution de nettoyage appropriée.
    5. Prenez la tache du tube et placez-le dans un bac contenant suffisamment préchauffé 0,1 x PESS, SDS 0,1 % et agiter pendant 3 min dans un bain d’eau secouer à 65 ° C. Pendant ce temps, rincez le filet dans un bac rempli d’eau.
    6. Sortez le blot, placez-le entre plastique plié à l’avance (tubes de polyéthylène), soigneusement essuyer l’excès de liquide et laisser la tache sécher brièvement. Notez que le liquide va ruiner l’écran phosphorimager.
    7. Sceller la tache en plastique sur les trois côtés. Enlever tout excès de liquide entourant la tache et fermer le tube en plastique en scellant le quatrième côté. Couper l’excédent de plastique. Assurez-vous que la tache scellée ne coule pas et que le plastique est sec à l’extérieur.
  9. Exposez l’écran phosphorimager.
    1. Placer la tache scellée dans une cassette de phosphorimager, avec l’écran de phosphorimager face à l’ADN de la tache. Fermez la cassette et laisser pendant ± 2 à 4 jours, selon la force du marquage radioactif et la sensibilité de la phosphorimager.
    2. Balayer l’écran de phosphorimager en utilisant un phosphorimager. Prendre soin d’exposer le moins possible à la lumière d’écran avant de les numériser. Enregistrer l’image. Effacer l’écran du signal en l’exposant à une lumière vive.
  10. Analyser la tache.
    1. L’analyse dépend de la stratégie de restriction utilisée à l’étape 4.1. Lorsqu’on analyse la tache préparée selon la stratégie indiquée à l’étape 4.1.1.1 (Figure 4 a), compter le nombre des fragments détecté. Dans cette stratégie, le nombre de fragments hybrides se réfère au nombre d’intégrations de l’ADN-T.
      1. Comparer le nombre des fragments détecté avec une sonde pour la gauche (Figure 7 b) et la partie de droite (Figure 7) de l’ADN-T.
        Remarque : Si un nombre différent de fragments d’hybridation est détecté, puis soit i) plusieurs copies de l’ADN-T (que ce soit en orientation inversée ou directe) ou ii) incomplètement intégré T-ADN est présents.
      2. Estimer la taille des fragments hybrides sur la tache selon la taille des bandes de marqueur et compare la taille des fragments hybridées avec le fragment attendu taille calculée basée sur la stratégie de restriction d’insertions en tandem (Figure 4 a) à identifier l’arrangement tandem possibles de l’ADN-T. Utilisez la Figure 4 a comme guide pour calculer la taille des fragments attendus.
        Remarque : Si la taille des fragments hybrides est en désaccord avec ceux calculés, puis très probablement celui des intégrations présentes n’est pas complète.
    2. Lorsqu’on analyse la tache préparée selon la stratégie indiquée à l’étape 4.1.1.2 (Figure 4 b), estimer la taille du fragment qui s’hybrident sur la tache, basée sur la taille des bandes de marquage et la comparer avec la taille attendue. Une insertion intacte donne un seul fragment d’une longueur définie. Toute déviation de la durée attendue indique intégration incomplète (Figure 7).
  11. Bande de la tache pour ré-hybridation (facultatif).
    Remarque : La même tache peut être hybridée consécutivement avec différentes sondes. Avant de poursuivre avec une nouvelle sonde, dépouiller une précédente sonde hybridée de la tache.
    1. Pour retirer la sonde de la tache, placer la tache dans un plateau avec son ADN-face vers le bas. Verser un excédent de 0,5 % SDS dans le bac. Faire bouillir la membrane pendant 2 à 5 min. La durée du traitement dépend de la taille et le contenu en GC de la sonde utilisée. Sondes longues et GC-richer besoin d’un traitement plus long.
    2. Après le décapage, la tache d’hybridation avec une autre sonde, ou sceller et conserver à-20 ° C.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grâce au système BIBAC-GW, journaliste des constructions pour l’étude des ODM dans les usines ont été généré10. Des constructions ont été conçues dans l’entrée passerelle vecteur pENTR-gm12 et insérées dans pBIBAC-BAR-GW (Figure 1) à l’aide de la réaction de recombinaison Gateway LR.

Arabidopsis ont été transformées avec pDM19, un plasmide BIBAC-BAR-GW...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Critique pour générer des organismes transgéniques avec des intégrations unique et intactes d’un transgène est le choix du vecteur binaire utilisé. Vecteurs de famille BIBAC ont été utilisés pour livrer les séquences des intérêts de nombreuses plantes espèces23,24,25,26,27,28. Vecteurs BIBAC, y compris BIBAC-GW, rendement exe...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche est soutenue par le hollandais STW Foundation Technology (12385), qui fait partie de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), et qui est financé en partie par le ministère des affaires économiques (OTP Grant 12385 à MS).  Nous remercions Carol M. Hamilton (Cornell University, Etats-Unis) pour la fourniture de pCH20, l’épine dorsale des vecteurs BIBAC-GW.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sulfate de kanamycine monohydratéDuchefaK0126
Sulfate de gentamycineDuchefaG0124
RifampicineDuchefaR0146
Chlorhydrate de tétracyclineSigmaT-3383
DB3.1 cellules compétentesThermo Scientific - Invitrogen11782-018One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) par Invitrogen ou toute autre souche résistante au ccdB E. coli peut être utilisée à la place.   ;
Cellules compétentes DH10BThermo Scientific - Invitrogen18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  ;Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
Citrate tri-sodique dihydratéMerck106432
Base TrizmaSigma-AldrichT1503
EDTA disodique dihydratéDuchefaE0511
Protéinase KThermo Scientific  ;EO0491
Bacto tryptoneBD211705
Extrait de levureBD212750
Chlorure de sodiumHoneywell Fluka13423
Chlorure de potassiumMerck104936
D(+)-Glucose monohydratéMerck108346
Cuvettes d’électroporation, espace de 0,1 cmBiorad
Electroporator Gene PulserBioRad
Sulfate de magnésium heptahydratéCalbiochem442613
D(+)-Maltose monohydraté 90 %Acros Organics32991
SaccharoseSigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
Murashige Skoog mediumDuchefaM0221
AgarBD214010
Glufosinate-ammonium (Basta)Bayer79391781
Enzymes de restrictionNEB
Bromure d’éthidiumBio-Rad1610433
Système d’électrophorèseBio-Rad
Hydroxyde desodiumMerck106498
Acide chlorhydriqueMerck100316
Membrane buvard en nylon Hybond N+Sigma Aldrich15358ou GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr Papier buvardGE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
Acétylé BSASigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-MercaptoéthanolMerck805740
Sephadex G-50 CoarseGE Healthcare Life Sciences17004401ou Sephadex G-50 Medium (17004301)
Sulfate de dextran sel de sodiumSigma-AldrichD8906
Dodécylsulfate de sodium  ;US BiologicalS5010
Saumon Sperme ADNSigma-AldrichD7656
Dihydrogénophosphate de sodium monohydratéMerck106346
Storage Écran et casette au phosphoreGE Healthcare Life Sciences28-9564-74
Imageur au phosphoreGE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
UV CrosslinkerStratageneStratalinker 1800
film alimentaire (Saran wrap)Omnilabo1090681
AgaroseThermo Scientific - Invitrogen16500
Acide boriqueMerck100165
marqueur d’ADN ' Blauw' ; Échelle d’ADN.MRC HollandMCT8070
marqueur d’ADN ' Rood' ; Échelle d’ADNMRC HollandMCT8080
Hexanucléotide MixRoche11277081001
Large-Construct KitQiagen12462
Tube en polyéthylène thermoscellable, transparentdivers fournisseursla largeur du tube doit être plus large que celle de la membrane de transfert
Thermoscelleuse
Filtre à membrane disqueMerckVSWP02500
Chlorure de magnésiumMerck105833
Maille d’hybridationGE Healthcare Life SciencesRPN2519
1652089

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773(2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33(2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349(1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208(2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50(2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644(2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

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