Article de méthode

PROCEDE de blessure extensibles haute vitesse de l’homme induite par des neurones de dérivés de cellules souches pluripotentes dans un Format 96 puits

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DOI :

10.3791/57305

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20 avril 2018

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1Department of Neurosurgery, NorthShore University HealthSystem, 2Midwestern University/Chicago College of Osteopathic Medicine, 3Independent Contractor

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une méthode pour un modèle humain in vitro de lésion extensible dans un format 96 puits sur une échelle de temps pertinent à l’impact d’un traumatisme. Cela inclut des méthodes de fabrication des plaques étirables, quantifier l’insulte mécanique, cultivant et blessant des cellules, l’imagerie et haute analyse de contenu pour quantifier le préjudice.

Résumé

Traumatisme crânien (TCC) est un défi clinique avec taux élevé de morbidité et de mortalité. Malgré des décennies de recherche pré-clinique, aucun traitements éprouvés pour TBI n’ont été développés. Cet article présente une nouvelle méthode pour la recherche pré-clinique neurotrauma destiné à compléter les modèles précliniques existants. Elle introduit la physiopathologie humaine grâce à l’utilisation de neurones de dérivés de cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCNs). Il réalise des impulsions de chargement durée similaire pour les durées de chargement des cliniques fermées des blessures de choc de la tête. Il utilise un format de 96 puits qui facilite les expériences d’un débit élevé et fait un usage efficace des cellules coûteux et les réactifs de la culture. Membranes de silicone sont d’abord traitées pour supprimer neurotoxique polymère non polymérisée et ensuite collés aux organes de la plaque à 96 puits commerciaux pour créer des plaques de 96 puits extensibles. Un dispositif sur mesure est utilisé en retrait de tout ou partie des culs bien de dessous, induisant une déformation mécanique equibiaxial qui blesse mécaniquement les cellules en culture dans les puits. La relation entre la profondeur d’indentation et sollicitations mécaniques est déterminée empiriquement à l’aide de vidéographie de haute vitesse de fond bien au cours de la mise en retrait. Cellules, y compris hiPSCNs, peuvent être cultivées sur ces membranes de silicone à l’aide de versions modifiées des protocoles de culture de cellules conventionnelles. Fluorescents images microscopiques des cultures cellulaires sont acquis et analysés après blessure de façon semi-automatique pour quantifier le niveau de dommage dans chaque puits. Le modèle présenté est optimisé pour hiPSCNs mais pourrait, en théorie, être appliqué à d’autres types de cellules.

Introduction

TBI est une cause majeure de mortalité et de morbidité dans les États Unis, provoquant le décès environ 52 000 et 275 000 hospitalisations chaque année1. Plus de 30 essais cliniques de produits thérapeutiques candidat pour TBI ont été menées sans un seul succès2. Cet échec uniform donne à penser que l’homme des processus séparer TBI humaine de la physio-pathologie observée dans des modèles précliniques couramment utilisés.

L’avènement de hiPSCNs a créé une occasion d’étudier la neurotraumatologie un modèle humain in vitro . Avec modèles axés sur les hiPSCN de dépistage de drogue peut produire des résultats qui sont plus prédictives du succès clinique que les modèles utilisant des cellules de rongeurs. En outre, hiPSCNs peuvent être génétiquement manipulés pour isoler et étudier l’effet des variants génétiques humains individuels sur la pathologie3.

La méthode décrite dans ce manuscrit est conçue pour apporter les avantages uniques de maladies hiPSCN modélisation de neurotraumatologie. In vitro le modèles de lésion extensibles de neurotraumatologie sont bien établis4,5,6 avec les cellules primaires de rongeurs et de lignées cellulaires cancéreuses neurales humaines. La plupart de ces modèles génère stretch par chargement pneumatique une membrane de silicone. Cette approche est efficace dans un format bien simple mais s’avère difficile à l’échelle jusqu'à un format multipuits7. En conséquence, il n’a jamais été un écran de haut débit pour les agents traiter des neurones lésés extensibles.

Dans ce modèle, la membrane s’étend en raison de la mise en retrait du dessous avec un pénétrateur rigide. Cette approche a été démontrée à plusieurs reprises pour générer une pathologie cliniquement pertinente in vitro dans les systèmes simples bien8,9,10. Nos travaux récents ont montré qu’il évolue facilement vers le haut pour un format 96 puits tout en conservant des durées d’impulsion sur l’ordre de plusieurs dizaines de millisecondes11, qui est la fois domaine de fermé le choc de la tête des événements12,13.

En résumé, les principaux avantages de ce modèle de blessures in vitro sont le format 96 puits, l’utilisation de hiPSCNs et le domaine temps cliniquement pertinente de l’insulte.

Protocole

1. désintoxication de silicone

  1. Couper les 254 µm épais, membranes de silicone de 30,48 cm x 30,48 cm en rectangles de 7,5 cm x 11 cm à l’aide d’une lame de rasoir et un modèle d’acrylique. 10 membranes rectangulaires sont possibles avec chaque feuille. Enregistrez le document qui vient avec le silicone.
  2. Placer la membrane dans un baquet d’eau désionisée de (DI) avec du savon de la verrerie. Un à la fois, frottez les membranes vigoureusement avec des doigts gantés pendant au moins 20 s ou jusqu'à ce que mousser.
  3. Rincer les membranes DI l’eau courante jusqu'à ce que le savon moins est visiblement enlevé. Poser les membranes sur le papier (à partir de leur emballage) et autoclave selon un cycle de gravité.
  4. Faire tremper chaque membrane silicone dans 250 mL d’éthanol à 70 % par la membrane dans un agitateur orbital à 60 tr/min pendant 24 h. utiliser un conteneur fabriqué dans un matériau qui ne réagit pas avec de l’éthanol, comme le polypropylène.
    1. Si plus d’une membrane est placée dans un bac unique, ou si les membranes collent au fond du bac, séparer les membranes de leur environnement avec pointes de pipette en plastique et Pipeter grilles de pointe.
  5. Transférer les membranes de silicone avec des mains gantées dans 250 mL d’eau DI par membrane et faire tremper dans l’agitateur orbital pendant 48 h à 60 t/mn.
  6. Poser les membranes sur le papier et les place dans un four de verrerie de 93 ° C pendant 4 h.
  7. Stocker les membranes sur le papier, dans un endroit propre et sec, recouvert d’une autre feuille de papier pour les protéger de la poussière.

2. plaque Fabrication

  1. Plasma traiter un dessus de la plaque à 96 puits avec un plasma W 200 nettoyant (voir Table des matières) pour 60 s à puissance maximale, il mise bas-côté-vers le haut à l’intérieur du plasma cleaner. Vous recherchez une lueur pourpre visible à travers la fenêtre de la chambre, ce qui indique qu’un plasma efficace a formé. Cette technique de collage est une adaptation d’Allan et al. 14
  2. Dans les 60 s, placez la plaque dans 200 mL de 1,5 % (3-Aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) dans l’eau distillée pendant 20 min, fond incliné. Cette solution est instable : Préparez-le ne dépasse pas 60 s avant d’introduire la plaque.
    ATTENTION : Les travaux avec APTES sous une hotte.
  3. Plasma traiter une membrane de silicone extraite dans le plasma nettoyant pour 60 s à puissance maximale. Le temps du traitement plasma telle qu’elle finit pas plus de 5 min avant la fin de la période de 20 min à l’étape 2.2.
  4. Utiliser les pinces pour positionner la membrane plasmique traité sur le dessus un rectangle de papier parchemin 7,5 x 11 cm2 . Aligner un 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm en aluminium dalle sur la partie inférieure de la pince de fabrication de plaque. Aligner le papier siliconé de membrane et le parchemin sur la dalle en aluminium avec une pincette.
    NOTE : Les fichiers de conception assistée par ordinateur (CAO) pour cet appareil sont fournis dans les matériaux supplémentaires comme un fichier de code supplémentaire ' Die Presse - 3D génériques. ÉTAPE '. La nomenclature associée est fournie en supplémentaire tableau 1 : Custom construit des dispositifs - BOM.xlsx.
  5. Retirer le dessus de la plaque du bain selon et secouer excédent de solution. Plongez dans un bain d’eau de 200 mL DI pour 5 s et secouer de l’eau en excès. Plongez dans un bain d’eau différents 200 mL DI pour 5 s et secouer de l’eau en excès. Remplacer l’eau dans ces bains avant de plonger un autre sommet de la plaque.
  6. Utiliser l’air comprimé pour sécher complètement le dessus de la plaque.
  7. Placez le dessus de la plaque dans la partie supérieure de la bride de fabrication de plaque. Fermez doucement la pince plaque de fabrication pour appuyer simultanément sur le dessus de la plaque et le silicone. Pince au moins 1 h.
  8. Laissez la plaque guérir pendant 24 h à température ambiante avant utilisation, protégée de la poussière.

3. étirer une plaque

  1. Nettoyer les indenters.
    Remarque : Voir supplémentaire Figure 1.
    1. Préparer un sonicateur de bain style 60 W avec DI l’eau à température ambiante.
    2. Soutien du bloc de pénétrateur au-dessus du bain sonicateur, inversé de sorte que seulement les sommets de l’indenters sont submergés à une profondeur d’au moins 1 mm. soniquer les indenters pendant 8 min à 42 kHz.
    3. Séchez les indenters à l’air comprimé.
  2. Aligner le bloc du pénétrateur.
    1. Positionner une caméra avec une alimentation de phase au-dessus de l’appareil qui s’étend de sorte que c’est en regardant vers le bas sur le tableau de pénétrateur. Mettre l’accent sur les sommets des indenters.
      Remarque : La configuration décrite dans la Section 4, « Caractérisant la Membrane Stretch », est une configuration de la caméra possible pour cette tâche.
    2. Fixer une plaque sur la scène de l’appareil de blessures à l’aide des pinces de stade (Figure 1) et placez un plafonnier au-dessus de l’appareil.
      Remarque : Consultez la Table des matières pour le logiciel de contrôle d’instrument.
    3. Lancer le logiciel de contrôle d’instrument en cliquant sur l’icône du logiciel sur le Bureau de l’ordinateur qui contrôle l’appareil de la blessure. Exécutez le projet « in_vitro_neurotrauma.lvproj » en cliquant dessus dans la fenêtre de lancement. Dans la fenêtre projet, lancer la commande de mouvement et position des instruments virtuels tracker (VIs), qui sont appelés « motion_control.vi » et « position_tracker.vi », respectivement, en double-cliquant sur eux.
    4. Fermer la cage entourant le dispositif de la blessure. Appuyez sur le bouton « flèche » dans le coin supérieur gauche de la commande de mouvement VI pour exécuter la VI et cliquez sur « Près de bas » pour abaisser la diligence à moins de 2 mm de contacter les indenters. Cliquez sur le bouton « Stop » pour arrêter la VI.
      Mise en garde : Garder les mains hors de la civière lors de la manipulation de la caméra dans la cage. La cage doit être équipée d’un interrupteur de porte qui fournit la puissance de l’appareil d’étirement que lorsque la porte de la cage est fermée.
    5. Dans la fenêtre projet, faites un clic droit sur le « Axe 1 ». Cliquez sur « Panneau de Test interactif ». Dans la fenêtre qui s’ouvre, définissez la taille de l’étape à 50 µm en entrant '500' unités dans le domaine de la « Position de la cible ».
    6. Cliquez sur le bouton « go » vert au bas de la fenêtre « Panneau de Test interactif » à plusieurs reprises jusqu'à ce que la plaque tout d’abord entre en contact avec n’importe quel indenters. Vous recherchez un contact avec l’image affichée par la caméra en direct. Remarque la position verticale stade signalée dans le coin supérieur gauche de la fenêtre de « Panel de Test interactif » ; Il s’agit de la première position de contact.
    7. Plus bas (comme indiqué au point 3.2.6) jusqu'à ce que chaque cupule a fait contact avec les indenters. Si nécessaire, déplacez la caméra pour voir la plaque entière et monter la scène (en spécifiant une Position négative « cible ») et vers le bas. Remarque la position verticale stade signalée dans le coin supérieur gauche de la fenêtre lorsque tous les messages sont en contact (c’est la position de coordonnées complètes).
    8. Notez la différence entre le premier contact et coordonnées complètes. Fermez le « panneau de Test interactif ». Exécutez le « motion control VI » (Voir l’étape 3.2.4) et cliquez sur « Top » pour déclencher la scène. Arrêter la commande de mouvement VI avec le bouton « Stop ».
    9. Une fois que la scène est au sommet de sa course, ouvrir la porte pour désactiver le périphérique. Ajuster les vis de réglage sur les coins du bloc avec pénétrateur. Desserrer la vis de réglage sur l’angle que fait le premier contact, à abaisser et serrez la vis opposée pour soulever l’angle que fait le dernier contact.
    10. Répétez le processus d’abaissement de la scène jusqu'à ce que la plaque entre en contact avec les indenters, inspectant les images contact pour tilt, soulevant la scène, et réglage (étape 3.2.9) le pénétrateur bloquer. Lorsque la scène et le bloc sont alignés, tous les indenters fera, contactez immédiatement.
    11. Ouvrir la porte pour désactiver le périphérique. Insérez les vis de retenue dans leurs trous du bloc de pénétrateur et serrez-les. Confirmer que le bloc soit de niveau avec les vis de fixation en place (pas 3.2.4-3.2.8). Prendre note de la position d’allure signalée par le « Panel de Test interactif » lorsque la plaque fait contact. Il s’agit de la position zéro pour des expériences de mise en retrait.
  3. Lubrifier les indenters.
    1. Si le bloc de pénétrateur juste a été mis en place et n’a pas encore été lubrifié, nettoyer un tapis en caoutchouc solide (7,5 x 11 cm x 1.5 mm) et un tampon de caoutchouc mousse molle, cellules fermées (7,5 x 11 cm x 3 mm) avec un chiffon imbibé d’éthanol de laboratoire. Laisser les sécher à l’air.
    2. Tremper un chiffon de laboratoire dans de l’huile de maïs et l’étaler sur le pad en caoutchouc solide pour une brillance mate.
    3. Placez le coussin de mousse sur la garniture en caoutchouc solide à transférer du pétrole sur le tampon de mousse. Placez un 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm en aluminium dalle sur le dessus de la garniture de mousse et de charger avec un poids de lest d’environ 360 g (p. ex., 6 tubes coniques chargés avec 45 mL d’eau de chaque) pour assurer le transfert cohérent d’huile du coussinet en caoutchouc solide pour le coussin de mousse. Permettre à 10 s pour l’huile de transférer à la garniture en caoutchouc mousse.
    4. Déplacer le coussinet de caoutchouc mousse sur le tableau du pénétrateur. Placer la plaque en aluminium et le poids de lestage au-dessus de celui-ci pour assurer le transfert cohérent de l’huile à la pointe des indenters. Permettre à 10 s pour l’huile de transférer aux indenters.
    5. Si aucun plaque n’a été étiré depuis le bloc de pénétrateur a été mis en place et lubrifiés pour la première fois, étirer une plaque d’essai avant de commencer l’expérience.
      Remarque : Cela empêchera toute incompatibilité entre le premier tronçon et ultérieures s’étend de l’expérience de confusion. Pour les tronçons suivants, répéter seulement pas 3.3.2-3.3.5 avant chaque étirement.
  4. Étirer une plaque.
    1. Lubrifier les indenters comme indiqué au point 3.3.
    2. Fixer la plaque sur la scène de l’appareil de blessures avec les pinces de la scène. Si la stérilité est nécessaire, ajuster la position du couvercle pour fixer la plaque sans exposer la surface de la culture à l’air ambiant.
    3. Abaisser la scène vers la position zéro à l’aide de la commande de mouvement de 'VI' (voir étapes 3.2.4-3.2.6) ; zéro-position est déterminé au cours de l’étape 3.2.
    4. Changer le nom du fichier dans le champ « file path » dans le « VI suivi de position » pour un nom de fichier unique, puis exécutez-le avec la touche « flèche » dans le coin supérieur gauche de cette fenêtre.
    5. Régler la profondeur et la durée de mise en retrait (en général de 1 à 4 mm et de 30 ms, respectivement, profondeur max. 5 mm, durée minimum 15 ms) dans les domaines de la « Blessure Duration (ms) » dans le « mouvement control panel VI » en cliquant sur les champs et en tapant dans la direction désirée et la « Blessure (mm) » valeurs.
    6. Exécutez le « mouvement control panel VI » et cliquez sur « Injure » mettre en retrait de la plaque.
    7. Déplacer la scène jusqu’au sommet de sa course en cliquant sur « Top ». Puis arrêter la VI avec la touche « Stop » et désactiver le périphérique de la lésion en ouvrant la porte.
    8. Inspecter l’historique de déplacement de la scène présentée dans la « position tracker VI » pour confirmer que le déplacement maximal spécifié a été appliqué. Faites un clic droit sur le graphique et cliquez sur « Exporter vers Excel ». Cliquez sur "fichier | Enregistrer "pour enregistrer les données.

4. caractérisation Membrane Stretch

  1. Peindre la niche en haut de chaque blanc de pénétrateur de prévoir un fond contrasté vidéographie de haute vitesse.
    ATTENTION : Ne pas peindre les jantes des indenters où ils font contact avec les plaques.
  2. 3D imprimer avec poly(lactic acid) (PLA), ou sinon fabriquer, un timbre cylindrique permettant de faire un point dans chaque puits. Faire le cylindre 5,9 mm de diamètre et 12,2 mm de hauteur, avec un diamètre de 1,5 mm saillie cylindrique et 1,0 mm de hauteur centrée sur le dessus.
    Remarque : Un modèle 3D imprimable ' timbre. STL' est disponible sous forme de fichier supplémentaire.
  3. Plasma traiter la plaque droit-côté-vers le haut pour activer la surface de culture de cellules de silicone dans les puits pendant 60 s, tel que mentionné à l’étape 2.1.
  4. Placer la plaque sur un tapis de caoutchouc ou autre surface molle. Amorcer la petite protubérance sur le timbre (Voir l’étape 4.2) avec de l’encre du stylo marqueur permanent. Insérez le timbre dans le puits à tester et tapoter pour assurer le bon transfert de l’encre. Amorcer le timbre avant chaque cupule.
  5. Aligner le bloc avec pénétrateur et lubrifier les indenters de l’appareil de blessure (voir étapes 3.2-3.3). Fixer la plaque sur la scène de l’appareil de la blessure. Placez une lumière diffuse axiale au-dessus du dispositif de la blessure.
  6. Mettre en place une caméra à grande vitesse sur une perche sur le périphérique de la lésion, orientées directement vers le bas, avec l’objectif défini sur le plus petit diaphragme numéroté et allumez-le. Lancer le logiciel de la caméra sur l’ordinateur connecté à la caméra. Dans le cadre taux menu déroulant, sélectionnez images 2 000 par seconde et dans le volet déroulant menu, sélectionnez le temps d’exposition plus rapide, ce qui donne des images à fort contraste. Centre sur les puits en pointillés.
    1. Positionner la caméra de sorte que le champ de vision contient 12 puits dans une grille de 3 x 4.
      Remarque : Ce champ de vision offre un compromis optimal entre débit et résolution d’une image de 1 280 × 1 024.
  7. Abaissez la plaque au point zéro (voir étapes 3.2.4-3.2.6). Un seul clic le dossier touche sur le logiciel de la caméra afin qu’il dise « trigger dans ». Lancer le tracker position VI (étape 3.4.4).
  8. Allumez la lumière diffuse axiale. Retrait de la plaque comme décrit à l’étape 3.4.6.
  9. Éteignez la lumière diffuse axiale.
  10. Sur l’ordinateur de contrôle caméra, accédez à la fenêtre de 30-40 ms de l’enregistrement où survient l’indentation : faites glisser les flèches de début et de fin dans la barre de lecture de la vidéo à haute vitesse dans le logiciel de la caméra. Cliquez sur enregistrer, définissez le nom dans le champ « Nom de fichier », sélectionnez « TIFF » dans le champ « Format » et cliquez sur « Sauvegarder ».
    1. Regardez à travers la. Fichiers TIF pour les images les moins étiré (début) et plus tendu des États (mise en retrait de la crête).
    2. Pour mesurer la hauteur et la largeur des points dans les deux images, utilisez Fidji pour ouvrir les images du moins élevé et la crête stretch-by-side. À l’aide de l’outil de sélection rectangulaire par défaut, cliquez et glissez pour dessiner un rectangle autour d’un point dans l’image moins extensible. Mesurer la hauteur et la largeur avec ' Analyze | Mesure ".
    3. Répétez la procédure pour le point dans le même puits sur l’image de bout droit de pointe. Répéter pour le reste des puits.
  11. Calculer la souche lagrangien dans les directions x et y comme suit :
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    NOTE : Ici, Exx est la souche de lagrangien dans la direction x , EAA est la souche de lagrangien dans la direction y , X est la largeur du point, Y est la hauteur de la dot, f désigne l’image finale (c'est-à-dire, l’image d’indentation de pointe), et j’ai désigne l’image initiale (c.-à-d., l’image mise en retrait préalable). La moyenne des deux valeurs pour déterminer la souche dans ce puits.

5. les cellules cultivées de placage

  1. Autoclave les bacs et les masses d’alourdissement qui seront utilisés pour la stérilisation.
  2. Plasma traiter le plaques à fond silicone droite-up pendant 60 s (reportez-vous à l’étape 2.1). Immédiatement, immerger les plaques dans les bacs stériles contenant de l’éthanol à 70 % pendant 15 min.
  3. Immerger les plaques dans une solution saline de stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans des bacs stériles séparés pendant 30 min.
  4. Aspirer les PBS des puits. Seulement séchez une plaque à la fois pour éviter les puits de perdre le traitement plasma.
    ATTENTION : Silicone plaques à fond fournissent la rétroaction tactile moins que des plaques rigides lors du pipetage et sont plus susceptibles de bloquer l’extrémité de la pipette.
  5. Ajouter 100 µL de 0,1 mg/mL poly-L-ornithine (OLP) par puits dans les plaques stérilisés. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
  6. Rincer les puits deux fois avec 100 µL de PBS stérile, laissant le second lavage sur les puits jusqu'à ce que la suspension cellulaire est prête.
  7. Retirer la cuvette de hiPSCNs de stockage d’azote liquide à l’aide de gants de sécurité et placer sur la glace sèche. Transporter le flacon dans un bain d’eau de 37 ° C et rapidement décongeler pendant exactement 3 minutes. Pas agiter le flacon.
  8. Sous une hotte stérile, doucement transvaser le contenu du flacon dans un tube conique de 50 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 1 mL.
  9. Rincer le flacon vide cryogénique avec 1 mL de milieu de maintenance complète de la température ambiante (périphérique d’amarrage + supplément).
  10. Transférer le 1 mL de médias dans le tube de 50 mL goutte-à-goutte à environ une goutte par seconde. Agiter doucement le tube lors de l’ajout. Ajoutez 8 mL de milieu de maintenance complète de température ambiante pour le tube de 50 mL environ 2 gouttes/s.
  11. Boucher le tube et inverser 2 ou 3 fois. Compter les cellules avec un hémocytomètre. Calculer le volume du média supplémentaire nécessaire pour diluer la suspension cellulaire à 225 000 cellules/mL.
  12. Pipetez doucement la quantité de données (calculées ci-dessus) dans le tube de suspension de cellules à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL.
  13. Ajouter 10 µL de 1 mg/mL de bouillon de laminine pour 1 mL de suspension cellulaire avec une micropipette µL 1 000 pour atteindre 10 µg/mL de laminine dans la suspension cellulaire. Aspirer en haut et en bas une fois avec la pointe utilisée pour la laminine, puis Boucher le tube et inverser le tube une fois.
  14. Aspirer les PBS des plaques, une plaque à la fois. Utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 100 µL de la suspension de cellules hiPSCN dans chaque puits. Les puits ont une zone de culture de 0,33 cm2, donc la densité des cellules surfacique est de 67 500 cellules/cm2.
  15. Reposer les plaques à température ambiante pendant 15 min après l’ensemencement pour promouvoir la pièce jointe. Pour éviter les vibrations du ventilateur de hotte de culture stériles, placer les plaques couvertes sur le banc de laboratoire. Incuber les cultures à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  16. Effectuer un changement de support complet après 24 h, remplissage des puits avec 200 µL de médias de maintenance complète. Effectuer un demi médias changent de 100 µL/puits tous les 2-3 jours.

6. blessant Cultures

  1. Aligner le bloc avec pénétrateur et trouver la position zéro, comme indiqué au point 3.2. Lubrifier les indenters comme indiqué au point 3.3.
  2. Définissez le nom de fichier de l’historique de déplacement dans le « tracker position VI » (étape 3.4.4). Définissez les paramètres de blessure dans le « motion control VI » (étape 3.4.5).
  3. Prendre la plaque à être blessés hors de l’incubateur et la fixer sur la scène. Ajustez la position du couvercle pour fixer la plaque sans exposer les cultures à l’air ambiant.
  4. Abaissez la plaque au point zéro (mesures 3.2.4-3.2.6) à l’aide de la « motion control VI ». Lancer la « position tracker VI » (étape 3.4.4).
  5. Utilisez le contrôle de mouvement VI en retrait de la plaque (comme décrit à l’étape 3.4.6). Pour les tronçons de l’imposture, passez seulement cette étape.
  6. La scène de retour vers le haut de son amplitude de mouvement (Voir l’étape 3.4.7). Remettez la plaque dans l’incubateur.
  7. Inspecter et enregistrer la trace de déplacement (comme dans l’étape 3.4.8).

7. microscopie

  1. Préparer un 10 x solution 2 µg/mL Hoechst 33342 et 5 µg/ml calcéine AM dans les médias de l’entretien de la coloration.
  2. Chaque tache bien avec un pic de 20 µL de 10 x solution de coloration.
  3. Incuber pendant 15 minutes avec la tache à 37 ° C.
  4. Acquérir des images fluorescentes à grand champ. Utilisation conventionnelle FITC et DAPI filtre ensembles afin d’imager la calcéine AM et les signaux de Hoechst 33342, respectivement. Si la séquence d’imagerie multipuite prendra plus de 10 min, placer la plaque dans un incubateur haut de scène à maintenir la santé des cultures.
    Remarque : 10 X, 0,30 NA objectif offre suffisamment de détails pour la détermination de la viabilité cellulaire et de morphologie. Ajuster les gains afin d’assurer la bonne visualisation des neurites, même si cela provoque une saturation du soma beaucoup plus lumineux.
  5. Débat consacré aux images de cellules vivantes dans le canal vert de calcéine AM pour identifier le soma et les neurites. Utiliser des images nucléaires dans la couche de Hoechst 33342 bleue pour aider à l’identification du soma.

Résultats

Le dispositif de la civière est capable de déplacer la scène répétable avec des durées d’impulsions aussi courtes que 10 à 15 ms selon l’amplitude de l’impulsion (Figure 2 a). Les amplitudes des impulsions sont hautement reproductibles, mais la durée de l’impulsion varie par environ 1 ms entre les répétitions. L’amplitude d’impulsion réelle s’écarte l’amplitude d’impulsion prescrits lorsqu’un grand nombre de puits est chargé et l’amplitude prescrite est élevé (voir la Figure 2 b). Comme l’amplitude du déplacement de la scène est augmentée au-delà de 3 mm, l’amplitude de déplacement réel inférieur plus en plus l’amplitude de déplacement prescrite (voir la Figure 2 b). Un alignement soigné du bloc post élimine toute tendance à la déformation de la membrane sur lignes ou colonnes (Figure 2). À la 3.5 mm prescrit l’amplitude de déplacement de phase (amplitude de déplacement réel de 3,3 mm) avec 52 puits mis en retrait, la souche de lagrangien moyenne dans l’ensemble de tous les emplacements de puits a été 0,451 (écart-type d’un dispositif de tous les emplacements = 0,051, moyenne des écarts-types pour tous les emplacements = 0,065, n = 5 mesures par puits). Ces résultats sont présentés ici par souci d’exhaustivité, bien que certains d'entre eux ont déjà été signalés11.

Une culture optimale, pas blessée aura peu ou pas de touffes de plus de 5 éléments. Neurites sera individuel, longue, mince et incurvée avec peu ou pas de signe de tension ou de perles (Figure 3 a). Dans des conditions idéales, la viabilité des cultures devrait approcher étroitement la viabilité spécifiée dans la fiche technique du fabricant (généralement de 60 à 70 %) et cultures sur silicone doivent ressembler à celles qui étaient maintenues sur des substrats de culture rigide conventionnelle ( Figure 3 b). Neurites peut ou peut ne pas apparaître sur un microscope de champ lumineux de faible puissance. Concentration de laminine et de densité cellulaire influencent les cultures au départ et après une blessure. L’augmentation de la densité cellulaire augmente le nombre et la taille des amas qui se forment dans la culture. Augmentation de la concentration de la laminine souvent contrecarré cet effet (Figure 3 a). Cependant, concentration augmentant la laminine trop émoussé la sensibilité des cultures à l’injure (Figure 4). La concentration optimale de laminine pour cultures blessés était de 50 µg/mL de laminine (Figure 3), mais la séparation optimale entre les populations sham et extensibles de blessés a été obtenue à 10 µg/mL de laminine (Figure 4). Des concentrations plus élevées de la laminine réduit la sensibilité des cultures pour les blessures aux points de courte période (Figure 4), mais aussi la viabilité cellulaire améliorée référence aux points de temps plus longues (par exemple, 7 jours). En résumé, il vaut la peine d’optimiser la concentration de la laminine pour chaque scénario expérimental.

Déformation de la membrane, imagerie point de temps après l’accident, concentration de laminine et densité cellulaire tous exercent un effet principal statistiquement très significatif sur la longueur des neurites par cellule (ANOVA, p < 0,001). L’effet de la déformation de la membrane sur la longueur des neurites par cellule avait des interactions statistiquement très significatives avec après la lésion d’imagerie temps point et laminine concentration (ANOVA, p < 0,001) et une interaction significative avec cellule densité (ANOVA, p < 0,05). De même, déformation de la membrane, après l’accident point dans le temps, l’imagerie cellulaire densité et laminine concentration tous exercée un effet principal statistiquement très significatif sur la viabilité cellulaire (ANOVA, p < 0,001). L’effet de la souche de la membrane sur la viabilité cellulaire a une interaction statistiquement très significative avec le point de temps après l’accident d’imagerie (ANOVA, p < 0,001) et une interaction significative avec la densité des cellules (ANOVA, p < 0,05). Ces résultats prouvent que les timing et densité cellulaire laminine concentration exercent une influence importante sur la relation entre les insulte appliquée et les résultats expérimentaux, afin que chacun devrait être optimisé avec soin.

Viabilité cellulaire faible et les neurites perlée, ainsi que de la croissance des neurites rabougris, indiquent des conditions de culture toxiques qui peuvent en découler mal préparé silicone. Sauter ou en raccourcissant le trempage à l’eau ou le four sec peut laisser absorbé l’éthanol ou l’eau dans la membrane, respectivement, qui peut diffuser dans les médias et souligner les cellules. Cultures bien blessés aura réduite viabilité cellulaire, raccourcie ou manquant de neurites, neurites perlée et neurites qui ont l’air tendus ou tendue. Peuvent provoquer des blessures s’agglutiner dans des cultures cellulaires qui ont été bien dispersé avant l’accident. Grosses touffes peuvent confondre l’analyse morphologique. Pour une analyse morphologique, le niveau du préjudice doit être accordé, telle que des modifications sont perceptibles, mais les cellules sont toujours présents avec des neurites.

figure-results-1
Figure 1 : A étiqueté schématique du dispositif blessure. (A) vue de dessus, vue isométrique (B), (C) vue de face, vue du côté droit (D). La barre d’échelle s’applique pour les vues orthogonales (A, B et D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : La cinématique de l’insulte mécanique. (A), le déplacement du stade histoires sur 5 impulsions à une gamme des amplitudes prescrites (amplitudes prescrits sont répertoriés dans la légende) quand aucun puits ne sont chargés. (B) le déplacement du stade histoires sur 10 impulsions à une gamme des amplitudes prescrites (amplitudes prescrits sont répertoriés dans la légende) quand 52 puits sont chargés. (C), la souche moyenne dans chaque puits d’amplitude de déplacement du stade de 3,3 mm (n = 5 mesures par puits, moyenne écart-type / puits = 0,029). Notez que C4-F4 et C9-F9 sont les puits témoins non étiré. Ce chiffre a été modifié par Sherman et al. 11 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Optimisation de la culture des conditions silicone. (A) l’effet de la variation de concentration cellulaire de densité et de la laminine sur hiPSCN cultures sur silicone. Agglutination augmente avec l’augmentation de la densité cellulaire et la diminution de concentration de la laminine. La concentration cellulaire laminine et de densité doit être optimisée pour atteindre des cultures mono dispersées. Mono-dispersé les cultures sont moins vulnérables aux artefacts au cours de la quantification. Notez que la plage dynamique a été ajustée pour optimiser la visualisation des neurites. En conséquence, beaucoup plus brillant soma sont saturés. Cette présentation est préférable à la solution d’optimisation de la gamme dynamique en ce qui concerne le soma, qui restitue bien les neurites gradateur presque invisible. L’État a mis en évidence par la place rouge était censé pour être optimale pour des expériences in vitro blessure extensibles. (B) dans des conditions optimales, cultures sur les membranes silicone semblent être similaires aux cultures sur substrats rigides classiques. Le panneau de gauche montre hiPSCNs cultivés à 33 750 cellules/cm2 avec 3,3 µg/mL de laminine sur une plaque à 96 puits conventionnelle, rigide (le substrat de culture cellulaire est un copolymère de culture de tissus traité d’oléfine cyclique). Le panneau de droite reproduit le panneau contour rouge de (A). Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Le phénotype de la blessure et sa dépendance sur la concentration de la laminine. (A) culture saine, à l’aide de 10 µg/mL laminine et 67 500 cellules/cm2. Neurites sont longs avec aucun perles. Il y a peu de noyaux morts et quelques touffes. Culture (B) en utilisant les mêmes conditions de culture, blessé avec la souche de pic de 57 % et imagés après 4 h. Neurites sont raccourcies ou endommagées et certaines ont des perles (indiqués par des flèches). Il y a moins de cellules calcéine AM séropositifs et AM-négatif de calcéine plus noyaux (c.-à-d., morts). Blessure a augmenté agglomérante parmi les cellules survivantes. (C) 4 heures après l’accident, neurite longueur par cellule diminue avec l’augmentation de la souche d’une manière qui dépend de la concentration de la laminine. (D) 4 heures après l’accident, la viabilité des cellules diminue avec l’augmentation de la souche d’une manière qui dépend de la concentration de la laminine. (E) 24 heures après la lésion, neurite longueur par cellule diminue avec l’augmentation de la souche d’une manière qui dépend de la concentration de la laminine. (F) 24 h après la lésion, la viabilité cellulaire diminue avec l’augmentation de la souche d’une manière qui dépend de la concentration de la laminine. (n = 4 par barre, barres d’erreur sont ± 1 écart-type, barres d’échelle = 100 µm). Valeurs de déformation sont déduites par déplacement de phase à l’aide de données provenant d’une publication préalable par Sherman et al. 11 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1 : technique de dessin de la pénétrateur. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Supplémentaire tableau 1 : Custom construit dispositifs. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Table supplémentaire 2:96 bien plaque-chargeur brochage diagramme de câblage. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.

Supplémentaire 1 fichier de Code : dessins de conception assistée par ordinateur de l’appareil de la blessure. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Complémentaire 2 fichier de Code : dessins de conception assistée par ordinateur de la pince de fabrication plaque. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de Code supplémentaire 3 : représentation 3D de la géométrie de timbre, adaptée pour être utilisé avec une imprimante 3D. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaire 4 fichier de Code : sous-VI pour MuStLiMo_si_initialize.vi, qui est un sous-VI pour motion_control.vi. Convertit les entrées dans les boîtes de dialogue Paramètres de requête. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de Code supplémentaire 5 : sous-VI pour plusieurs Moves_simplified.vi de ligne droite, qui est un sous-VI pour motion_control.vi. Convertit les entrées dans les boîtes de dialogue Paramètres de requête. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaires 6 fichier de Code : sous-VI pour position_tracker.vi. Déplacement de titres compteur entrée de codeur linéaire. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de Code supplémentaire 7 : Base projet LabVIEW. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaire Code fichier 8 : Top niveau VI qui se déplace le dispositif de. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de Code supplémentaire 9 : sous-VI pour motion_control.vi. Exécute le déplacement rapid qui s’étend de la plaque. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

10 de fichier Code supplémentaire : sous-VI pour motion_control.vi. Exécute le déplacement lent qui se déplace de la scène. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaire Code dossier 11 : sous-VI pour motion_control.vi. Trace une histoire de déplacement (généralement sous-échantillonnés) dans le panneau de contrôle motion_control.vi. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaire 12 fichier de Code : Top niveau VI qui enregistre l’historique de déplacement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Dossier de Code supplémentaire 13 : contient Variable2, qui communique entre motion_control.vi et position_tracker.vi. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

14 de fichier Code supplémentaire : schématique pour circuit imprimé. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de Code supplémentaire 15 : mise en page pour circuit imprimé. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La clé à l’obtention d’un accord, phénotype biofidelic dans ce modèle applique une insulte mécanique conforme biofidelic. Ce modèle peut générer des impulsions durée aussi brève que 10 à 15 ms, qui ressemblent aux durées d’impulsion pour tête anthropisation selon expériences cadavériques12,13. La cohérence de cette insulte dépend de l’alignement entre la plaque et le bloc de pénétrateur et lubrification cohérente des indenters. Lorsque le bloc de pénétrateur est bien aligné, il n’y aucune tendance dans la souche appliquée à travers des lignes ou des colonnes (Figure 2). Une mince couche de lubrifiant crée généralement moins de friction qu’une couche épaisse et visqueuses graisses ne sont pas recommandés parce qu’ils encrassent le silicone et obstruent le passage de la lumière au cours de la microscopie. L’amplitude de déplacement de la scène réelle peut parviendrait pas substantiellement l’amplitude de déplacement prescrite lorsque plusieurs indenters sont utilisés, et l’amplitude de déplacement de phase réglementaire est de grande taille (> 3 mm). Cependant, le déplacement réel est inférieur le déplacement prescrit à grande amplitude, mais il reste répétable (Figure 2 b). Par conséquent, amplitudes de déplacements grand, réelle peuvent être obtenues de fiable en entrant une valeur prescrite supérieure à la valeur souhaitée. Amplitude du déplacement des questions uniquement parce que c’est un proxy facilement enregistré pour la souche de membrane de pointe, qui mesure directement l’insulte mécanique qui induit la pathologie. Par conséquent, la procédure décrite pour déterminer la déformation de la membrane par déplacement de phase est essentielle. Ce processus doit être répété si importants changements sont apportés au système qui affectent l’interaction entre la plaque et les indenters, par exemple s’il est différent indenters de diamètre, avec pénétrateur différents matériaux ou revêtements ou différents types de silicone plaque de fond sont utilisés. Le processus de réalignement du bloc avec pénétrateur et de déterminer la position zéro doit être répété au début de chaque expérience. Une représentation schématique de l’appareil d’étirement est illustrée à la Figure 1. Modèles CAO nécessaires à la reproduction de l’appareil sont fournis à titre de matériaux supplémentaires : "lésion périphérique - assemblage complet - 3D génériques. ÉTAPE ' ; la nomenclature associée fournie commesupplémentaire tableau 1 : Custom construit des dispositifs - BOM.xlsx. Voir aussi complémentaire 2 96 bien plateau _loader – Diagram.xlsx de câblage de brochage, qui décrit les connexions de câbles qui relient les différents composants des systèmes. « Interconnector_circuit_board.dip » décrit un circuit imprimé qui interconnecte les câbles.

Si le périphérique est désactivé dans la scène vers le milieu de sa course, la scène se déplace après que l’alimentation électrique est coupée, parce que c’est à ressort. Lorsque le courant est rétabli, la boucle de rétroaction permet de détecter une différence importante entre la dernière position connue prescrite et la position effective. Cela entraînera la scène pour bouger brusquement au poste, qu'elle était avant de l’appareil a été désactivé. Ce mouvement brusque peut entraîner des erreurs dans la sortie de l’encodeur, donc il faut désactiver l’appareil que lorsqu’elle repose dans son non alimentés position au sommet de sa course.

La pince de fabrication vise à rassembler le bas de corps et silicone plaque d’une manière qui permet une adhérence optimale. À cette fin, il y a trois caractéristiques essentielles dans la conception présentée dans le fichier supplémentaire ' Die Presse - 3D génériques. ÉTAPE '. Tout d’abord, le support de corps de plaque de serrage est parallèle au fond silicone. Si c’est correctement construit, il ne faudra aucun ajustement après l’installation initiale. Deuxièmement, la couche de mousse en caoutchouc dans la pince fournit une petite quantité de conformité dans le cadre de la plaque, comme un système complètement rigide subirait théoriquement une augmentation soudaine de zéro force de serrage à l’infinie force de serrage lors de la fermeture de la pince. La position de la barre transversale et vis de réglage du collier sont réglables pour que la distance entre les deux côtés de la pince peut être affinée.

Tout doit être fait pour fournir un arrière-plan lumineux et blanc derrière le dot sur le fond du puits au cours d’expériences de caractérisation de la souche. Plus le contraste de ces images, il sera facile d’automatiser le processus de mesure de la hauteur et la largeur du point, qui peut devenir fastidieux pour un opérateur humain analyse une grande expérience. Vidéographie à grande vitesse du fond d’un puits dans une plaque à 96 puits pose des difficultés parce que les parois du puits ont tendance à projeter des ombres. L’utilisation d’un dôme de lumière ou lumière axiale diffuse qui peut éclairer le long de la ligne de mire de la caméra sans obscurcir l’image élimine les ombres ou les reflets spéculaires qui pourrait se poser avec une source lumineuse classique. La plus brillante source lumineuse disponible doit être utilisée parce que l’éclairage lumineux permet les images destinées à être absorbées avec un temps d’exposition court. Temps d’exposition court minimisent le flou de mouvement. La mise à niveau de l’éclairage des diodes électroluminescentes (del) à la lumière diffuse axiale permet des temps d’exposition plus courtes pendant l’acquisition vidéo à haute vitesse. La LED peut être amélioré en ouvrant le feu axial diffus, enlevant le stock LED, montage 4 haute puissance LED tableaux au volet arrière à l’aide de supports de LEDs, afin qu’ils connaissent une alimentation courant constant et du remontage de la lumière diffuse axiale (voir Table de Matériaux pour les numéros de catalogue). L’inconvénient de mettre à niveau les LEDs, c’est que les LED refroidies passivement ne peuvent être maintenus plus de quelques secondes en raison du risque de surchauffe. Par conséquent, un éclairage différent est nécessaire pour l’alignement de l’ajustement après bloc et caméra.

La méthode présentée de quantifier la déformation de la membrane en mesurant la dilatation d’un point estampillé sur la membrane est relativement grossière, mais il peut mesurer jusqu'à plusieurs puits de manière robuste. Le champ de déformation bien bas peut se caractériser plus en détail à l’aide de la corrélation d’images numériques. Cette technique consiste à pulvériser une moucheté sur la base du puits et ensuite d’imagerie à haute vitesse pendant la déformation. Logiciel commercial permet ensuite de quantifier la déformation à chaque point de l’image grâce au suivi de l’évolution de la moucheté.

Ce protocole produit un phénotype de blessures aux multiples facettes, cliniquement pertinentes et extensibles à hiPSCNs. La mort cellulaire, dégénérescence des neurites et perler de neurites sont tous bien documentés séquelles du TBI chez l’être humain et animal modèles15. La clé du succès de ce modèle est établir et maintenir des cultures en bonne santé. En général, un protocole de culture cellulaire développé avec des plaques rigides classiques est un point de départ utile pour la culture de plaque extensible. Toutefois, la possibilité que les cellules en question peuvent répondre différemment sur le silicone doit toujours être envisagée. Cela est particulièrement vrai de hiPSCNs, qui sont très sensibles aux conditions de culture. Quelques exemples d’optimisation de la concentration cellulaire laminine et de densité sont fournis dans la section Représentant résultats (Figure 3, Figure 4). Activation de la silicone avec traitement plasma est vitale. Silicone est hydrophobe et pas réactif ; dans son état naturel, il ne liera pas laminine ou autres molécules utilisées pour favoriser la fixation des cellules. Traitement au plasma rend la surface hydrophile et expose des groupes réactifs. Ces modifications permettent aux molécules d’adhérence à lier à la silicone et de promouvoir la fixation des cellules. Il est important de noter que l’effet du traitement plasma se dissipe dans les minutes, sauf si la surface est immergée dans un liquide, et donc les procédures qui impliquent la surface activée de séchage doivent être effectuées aussi rapidement que possible. Une méthode simple pour vérifier si l’effet du traitement plasma s’est dissipé doit verser une goutte d’eau sur la surface. Silicone non traitée, la gouttelette sera billes vers le haut alors que sur les plasma traité au silicone, il se répandrait. Avec le hiPSCNs que nous avons utilisé (voir Table des matières), le fabricant recommande d’ajouter la laminine avec la suspension cellulaire plutôt que le revêtement avant. Ce protocole a incorporé cette approche avec succès. Alors que la segmentation peut, en théorie, être accomplie avec des logiciels libres ou des langages de programmation généraliste, un haut degré de maîtrise de ces outils est nécessaire pour obtenir de bons résultats. Neurites sont souvent difficiles à distinguer du signal de fond parce qu’ils sont tellement minces. Par conséquent, nous recommandons l’utilisation d’outils logiciels commerciaux, distribués par les sociétés de microscopie contenu élevé avec des modules dédiés pour la segmentation et quantification des neurones, si elles sont disponibles. Même avec un logiciel commercial, il est sage d’exporter des images de la segmentation de vérifier visuellement l’exactitude.

Il y a certaines limites associés au travail en plaques étirables par rapport à travailler avec des plaques classiques, rigides. Les plaques extensibles peuvent être photographiées comme d’habitude avec les objectifs de l’air. Toutefois, l’imagerie avec les objectifs à immersion est très difficile. Huile de lentille peut endommager le silicone. En outre, l’objectif exerce une pression sur la membrane de silicone comme il se déplace vers le haut. Cette pression déplace la membrane verticalement, rendant difficile d’amener l’échantillon dans le foyer. Les membranes de silicone actuellement utilisés dans la fabrication des plaques sont environ 250 µm d’épaisseur. Cette épaisseur est supérieure à la distance focale de nombreux haute puissance, objectifs à immersion. Il faut en particulier à poser les membranes parfaitement plat avant serrage pour réaliser la planéité requise pour la microscopie. Systèmes autofocus peuvent compenser des écarts dans la platitude de la plaque finie dans une certaine mesure. Les versions futures du protocole peuvent pre tendre la membrane avant elle est collée sur le dessus de la plaque pour assurer la planéité. La procédure sans adhésif pour coller la membrane silicone au haut de la page plaque14 est considéré comme une force importante du protocole actuel. Il élimine le risque de neurotoxicité de l’adhésif ainsi que tout écart par rapport à la planéité en raison de l’épaisseur non uniforme de la couche de colle.

Rangées d’électrodes multiples sont utilisées dans des expériences avec hiPSCNs pour évaluer leur maturité et leur fonctionnalité. Malheureusement, ces systèmes sont incompatibles avec ce modèle, parce que le substrat de culture cellulaire est rigide. Il est possible de créer un tableau multi-électrode extensible, bien que cela a jusqu'à présent seulement été démontré dans un seul bien format16,17. Notez qu’indenters peuvent être retirés individuellement du bloc avec pénétrateur afin que certains puits ne sont pas en retrait et peuvent servir de couvre-oreillers. Enlever le pénétrateur empêche la mise en retrait, mais n’élimine pas complètement chargement mécanique puisqu’il n’y a toujours inertiel mouvement du fluide dans les puits alors que la scène se déplace. Il est intéressant de comparer ces puits puits dans les plaques qui ont jamais fait l’objet de mouvement étape pour mesurer toute influence pathologique d’un mouvement fluide. En outre, le tableau d’indenters dans le bloc devrait être bisymmetric (symétrique d’avant en arrière et latéralement). Cette précaution garantit que la plaque est chargée uniformément au cours de la mise en retrait, afin que le stade ne pas incliner latéralement et provoquer les tiges lier dans les paliers.

L’un des principaux défis pour l’innovation thérapeutique en neurotraumatologie est la complexité et l’hétérogénéité de la condition. Traumatisme s’applique stress multimodale pour chaque type de cellule dans le système nerveux central en même temps. Les neurones ont été sûrement générés à partir des cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) et sont maintenant largement disponibles chez les revendeurs commerciaux. L’innovation progresse rapidement dans ce domaine, et autres types de cellules neuronales comme astrocytes18 et la microglie19 sont également étant dérivés de hiPSCs. Bientôt, il serait possible d’isoler les réponses cellulaires-autonome de chacun de ces types de cellules à trauma in vitro , puis à la co-culture différents types de cellules à comprendre comment ils communiquent après un traumatisme. De cette façon, il peut être finalement possible de recréer le défi clinique du bas vers le haut pour bien le comprendre dans un système humain. Cette approche se distingue de l’approche traditionnelle en s’appuyant sur les modèles de rongeurs et a le potentiel pour générer des idées nouvelles qui conduisent aux premières thérapies pour cette affection courante, dévastatrice et intraitable.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail est soutenu en partie par une subvention de la National Institutes of Health (R21NS098129). Nous tenons à remercier son aide technique SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng et Feng Yuan Bu, qui a conçu et construit une structure pour prendre en charge les lumières utilisées au cours d’expériences d’imagerie haute vitesse décrits dans ce manuscrit .

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Feuille de silicone .010"Specialty Manufacturing, Inc#70P001200010feuille de polydiméthylsiloxane (PDMS)
SparkleenFisher Scientific  ;#043204
Nunc 256665Fisher Scientific  ;#12-565-600Bottomless 96 Well
Plate Kim WipesULINES-8115
Nettoyeur de plasmaHarrick Plasma#PDC-001-HC
(3-Aminopropyl) triethoxysilaneSigma-Aldrich#440140APTES
Papier sulfuriséReynoldsN/A
Dome LightCCS incLFX2-100SW
Bloc d’alimentation pour plafonnierCCS incPSB-1024VB
Unité d’éclairage diffus axial  ;   ;   ;   ;   ;SiemensNerlite DOAL-75-LEDLumière axiale diffuse
Matrice de LED haute puissance  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;CREEXLamp CXA2540Réseau de LED haute puissance  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
Support LEDMolex1807200001Support LED  ;   ;
Bloc d’alimentation à LEDMean WellHLG-320H-36BBloc d’alimentation à courant constant  ;   ;
Logiciel FastCam Viewer  ;Caméra photronsofteware
Fastcam Mini UX50PhotronN/ACaméra haute vitesse
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8Nikon#1455Objectif de caméra haute vitesse
0.1 mg/mL Poly-L-OrnithineSigma-Aldrich#P4597
iCellsCellular Dynamics International#NRC-100-010-001
Média iCellCellular Dynamics International#NRM-100-121-001  ;
Supplément iCellCellular Dynamics International#NRM-100-031-001
LamininSigma-Aldrich#L2020
Hoechst 33342Fisher Scientific  ;
Calcein AMFisher Scientific  ;
actionneur de bobine mobile  ;BEI KimcoLA43-67-000A  ;
codeur linéaire optique  ;RenishawT1031-30A  ;
servovariateurCopley ControlsXenus XTL  ;
ContrôleurNational InstrumentscRIO 9024 Contrôleur PowerPC temps réel  ;
Châssis cRIONational InstrumentsModule d’entrée numérique cRIO 9113
National InstrumentsNI 9411
Châssis d’acquisition de donnéesNational InstrumentsNI 9113
LabVIEWLogicielde contrôle
hiPSCNsCellular Dynamics International
#H3570#C3099d’instruments National Instruments

Références

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Traitement de membrane en siliconeInduction de contrainte m caniqueVid ographie haute vitesseAnalyse en microscopie fluorescenceDispositif de l sion fabriqu sur mesureContrainte m canique quibiaxialeQuantification de la longueur des neurites

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