Ce protocole permet au lecteur d’analyser la formation de biofilm induite sur les sels biliaires dans les pathogènes entériques à l’aide d’une approche à multiples facettes pour capturer la nature dynamique des biofilms bactériens par évaluation de la conformité, formation de la matrice extracellulaire substance polymérique, et la dispersion.
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Article de méthode
La Formation de Biofilm induite sur les sels biliaires chez les agents pathogènes entériques : Techniques d’Identification et de Quantification
Dans cet article
Résumé
Résumé
La formation de biofilm est un processus dynamique, à plusieurs étapes qui se produit chez les bactéries sous des conditions environnementales difficiles ou des moments de stress. Pour les pathogènes entériques, une réponse à un stress important est induite pendant le transit gastro-intestinal et à l’exposition de bile, une composante normale de la digestion humaine. Pour surmonter les effets bactéricides de la bile, de nombreux agents pathogènes entériques forment un biofilm l’hypothèse afin de permettre la survie lorsque le transit à travers l’intestin grêle. Nous présentons des méthodes pour définir la formation de biofilms par le biais de tests d’adhérence de la phase solide ainsi que de détection de matrice de substances polymériques extracellulaires (EPS) et de visualisation. En outre, évaluation de dispersion de biofilm est présentée pour imiter l’analyse des événements déclenchant la libération des bactéries durant le processus d’infection. Une coloration violette en cristal est utilisée pour détecter des bactéries adhérentes dans un essai d’adhérence haut débit plaque à 96 puits. Évaluation de production EPS est déterminée par deux essais, à savoir la microscopie de coloration de la matrice de l’EPS et les analyse semi-quantitative avec une lectine liant de polyosidique conjugué fluorescent. Enfin, dispersion de biofilm est mesurée à travers des comptages de colonies et le placage. Résultats positifs de tests multiples soutiennent la caractérisation des biofilms et peuvent être utilisés pour identifier la formation de biofilm induite sur les sels biliaires chez les autres souches bactériennes.
Introduction
La formation de biofilm est une stratégie de survie bactérienne importante induite lors des conditions environnementales difficiles. Exposition à des composés bactéricides comme des antibiotiques ou des modifications des éléments nutritifs ou de disponibilité de l’oxygène induit un état de stress chez les bactéries qui peuvent être soulagées par le biais de la formation de biofilm. Un biofilm est caractérisé par l’attachement des bactéries à une surface ou d’autres bactéries et s’accompagne de la sécrétion d’une matrice d’EPS essentiellement composée de polysaccharides1,2,3. ....
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Protocole
1. préparation des réactifs
- Moyen de sels biliaires : pour préparer le bouillon trypticase soja (TSB) contenant des sels biliaires de 0,4 % (poids/volume), resuspendre 200 mg de sels biliaires dans 50 mL BST autoclavé. Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm. Faire un milieu frais chaque semaine.
Remarques : Les sels biliaires couramment utilisés est un mélange de 1:1 de cholate de sodium et le désoxycholate de sodium isolées de vésicules biliaires ovines et bovines. Comme démontré précédemment4, la présence de glucose était nécessaire pour la formation de biofilm induite sur les sels biliaires. BST a ajouté glucose par r....
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Résultats
Dans la Figure 1, la formation de biofilm est induite dans la plupart de la croissance suivante testé six pathogènes entériques dans des milieux contenant des sels biliaires. Une augmentation significative des bactéries adhérentes après que exposition de sels biliaires est observée dans presque toutes les souches testées. L’exception est entéroaggrégatif e. coli (CEEA) ; cependant, note l’observation induite des mutantsaaf Δ
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Discussion
Analyse de la formation de biofilm est difficile en raison de la nature dynamique des biofilms et la variabilité entre les souches, les matériaux, laboratoires et analyses. Ici, plusieurs stratégies sont présentées afin de déterminer la formation de biofilm dans entéropathogènes après exposition de sels biliaires avec perspicacité expérimentale prévue pour promouvoir la reproductibilité. Il y a des considérations supplémentaires pour assurer la reproductibilité. Tout d’abord, nous vous recommandons d’effectuer au moins t.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucune divulgation.
Remerciements
Nous remercions Rachael B. Chanin et Alejandro Llanos-Chea pour l’assistance technique. Nous remercions Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski et Bobby Cherayil pour les souches utilisées dans cette étude. Ce travail a été soutenu par l’Institut National des allergies et K22AI104755 de subvention des maladies infectieuses (L.C.R.). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bouillon de soja tryptique | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sels biliaires | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| Tubes de culture de 14 ml, 17 x 100 mm, plastique, stériles | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield anti-décoloration avec DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldéhyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Plaques à fond plat 96 puits (transparentes) | TPP | 92696 | |
| Plaques à fond plat 96 puits (noir) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Plaques à fond plat 24 puits (transparent) | TPP | 92424 | |
| Lamelles en verre 12mm, rondes | Fisher | 08-774-383 | |
| Lecteur de plaques 96 puits | Spectramax | ||
| Lecteur de plaques fluorescentes | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal ou fluorescent Microscope | Nikon A1 microscope | ||
| 37° ; C Incubateur à secousses | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37° ; Incubateur à plaques C | Thermolyne Series 5000 |
Références
- Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R....
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Réimpressions et autorisations
