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Summary

Ce protocole permet au lecteur d’analyser la formation de biofilm induite sur les sels biliaires dans les pathogènes entériques à l’aide d’une approche à multiples facettes pour capturer la nature dynamique des biofilms bactériens par évaluation de la conformité, formation de la matrice extracellulaire substance polymérique, et la dispersion.

Abstract

La formation de biofilm est un processus dynamique, à plusieurs étapes qui se produit chez les bactéries sous des conditions environnementales difficiles ou des moments de stress. Pour les pathogènes entériques, une réponse à un stress important est induite pendant le transit gastro-intestinal et à l’exposition de bile, une composante normale de la digestion humaine. Pour surmonter les effets bactéricides de la bile, de nombreux agents pathogènes entériques forment un biofilm l’hypothèse afin de permettre la survie lorsque le transit à travers l’intestin grêle. Nous présentons des méthodes pour définir la formation de biofilms par le biais de tests d’adhérence de la phase solide ainsi que de détection de matrice de substances polymériques extracellulaires (EPS) et de visualisation. En outre, évaluation de dispersion de biofilm est présentée pour imiter l’analyse des événements déclenchant la libération des bactéries durant le processus d’infection. Une coloration violette en cristal est utilisée pour détecter des bactéries adhérentes dans un essai d’adhérence haut débit plaque à 96 puits. Évaluation de production EPS est déterminée par deux essais, à savoir la microscopie de coloration de la matrice de l’EPS et les analyse semi-quantitative avec une lectine liant de polyosidique conjugué fluorescent. Enfin, dispersion de biofilm est mesurée à travers des comptages de colonies et le placage. Résultats positifs de tests multiples soutiennent la caractérisation des biofilms et peuvent être utilisés pour identifier la formation de biofilm induite sur les sels biliaires chez les autres souches bactériennes.

Introduction

La formation de biofilm est une stratégie de survie bactérienne importante induite lors des conditions environnementales difficiles. Exposition à des composés bactéricides comme des antibiotiques ou des modifications des éléments nutritifs ou de disponibilité de l’oxygène induit un état de stress chez les bactéries qui peuvent être soulagées par le biais de la formation de biofilm. Un biofilm est caractérisé par l’attachement des bactéries à une surface ou d’autres bactéries et s’accompagne de la sécrétion d’une matrice d’EPS essentiellement composée de polysaccharides^1,2,3. La formation de biofilm est un processus dynamique dans lequel une cascade d’événements aboutit à la formation d’une communauté bactérienne adhérente mature^1,2,3. Bactéries peuvent produire des adhésines pour faciliter l’attachement précoce tout en déplaçant les profils d’expression génique adhésine afin de renforcer l’attachement au cours de la maturation du biofilm. Simultanément, la production d’EPS se produit pour bien enrober les communautés bactériennes dans une matrice pour protéger les cellules contre le stress initial. Les bactéries contenues dans le biofilm sont à croissance lente ; et à ce titre, rend la plupart des antibiotiques inefficaces. En outre, la croissance lente conserve l’énergie jusqu’à ce que les conditions changent afin de favoriser la croissance bactérienne^1,2,3. Après que les dures conditions se sont écoulées, bactéries dispersent le biofilm et reprendre un mode de vie planctonique^1,2,3. Traditionnellement, les biofilms sont observées sur les surfaces et représentent un défi clinique persistant en raison des réservoirs d’infection présentes sur cathéters et en vivant dans les dispositifs^1,2,3.

La formation de biofilm a été récemment décrit pour plusieurs pathogènes entériques ; bactéries qui infectent l’intestin grêle ou du côlon⁴. Pour les espèces de Shigella , , l’infection survient dans le côlon humain après un transit par la majorité du tractus gastro-intestinal. Au cours du passage dans l’intestin grêle, Shigella est exposée à la bile ; un détergent dégradant lipides sécrété dans l’intestin pour faciliter la digestion des lipides, tout en tuant en même temps la plupart bactéries⁵. Les pathogènes entériques ont une capacité unique à résister aux effets bactéricides de bile⁶. Notre récente analyse utilisées en vivo-comme des combinaisons de glucose et de sels biliaires pour démontrer la formation de biofilm robuste dans S. flexneri et autres espèces de Shigella, pathogène Escherichia coliet Salmonella⁴. Auparavant, Salmonella enterica serovar Typhi a été montré pour former un biofilm induite par la bile, en raison de la colonisation unique de la vésicule biliaire au cours de l’infection chronique par le^{7,8,9, 10}. en outre, des recherches antérieures avec Vibrio¹¹et Campylobacter¹² a démontré la formation de biofilm en réponse à la bile. Donc, les analyses étendu les observations de la formation de biofilm induite par la bile d’autres agents pathogènes et aident à établir la démonstration d’une réponse de pathogènes entériques conservée à la bile. À la différence des biofilms chroniques dans lequel la transcription de gène bactérien est limitée et la sénescence cellulaire peut se produire de^1,2,3, nous proposons que le biofilm entérique induite par la bile est plus transitoire dans la nature. Ce transitoire, biofilm virulent est caractérisent par un démontage rapid (comme vu dans le test de dispersion) et amélioré l’expression de gènes de virulence observée dans le biofilm population^4,6. 

Comme la formation de biofilm est un processus dynamique, aux multiples facettes et l’utilisation des sels biliaires comme un facteur déclencheur n’a été récemment décrit pour les pathogènes entériques plus, les outils et les techniques utilisées sont des applications uniques et créatives des méthodes traditionnelles. Ainsi, sont présentées ici de trois stratégies complémentaires de quantifier plusieurs caractéristiques importantes de la formation de biofilm induite sur les sels biliaires, dont l’adhérence bactérienne, production de la matrice de l’EPS et la dispersion des bactéries viables de biofilm. Ces techniques ont été utilisées principalement pour la recherche avec Shigella; et donc, évaluation d’autres pathogènes entériques peut-être nécessiter optimisation. Néanmoins, les données positives de tous les trois épreuves soutiennent l’identification des biofilms et établissent des protocoles reproductibles pour la formation de biofilm induite sur les sels biliaires.

Protocol

1. préparation des réactifs Moyen de sels biliaires : pour préparer le bouillon trypticase soja (TSB) contenant des sels biliaires de 0,4 % (poids/volume), resuspendre 200 mg de sels biliaires dans 50 mL BST autoclavé. Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm. Faire un milieu frais chaque semaine.Remarques : Les sels biliaires couramment utilisés est un mélange de 1:1 de cholate de sodium et le désoxycholate de sodium isolées de vésicules biliaires ovines et bovines. Comme démontré précédemment4, la présence de glucose était nécessaire pour la formation de biofilm induite sur les sels biliaires. BST a ajouté glucose par rapport au bouillon Luria-Bertani (LB) ; et par conséquent, était suffisante pour induire la formation de biofilm dans Shigella et les autres pathogènes entériques analysés. Selon les bactéries pour être analysés, les glycémies différentes ou des exigences différentes de sucre pourraient être nécessaires. 0,5 % p/v cristal violet dans l’eau : dissoudre 2,5 g de cristal violet dans 500 mL d’eau distillée. Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm. La concanavaline A (ConA) conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) : reconstituer le stock dans du PBS 1 x. Diluer le stock de 10 mg de concentré avec 400 μl de PBS 1 x à une concentration finale de 25 µg/mL et protéger de la lumière. PBS + Glucose : Dissoudre 0,2 g de glucose dans 10 mL de PBS 1 x (finale de glucose 2 % p/v). Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm. Faire des frais sur le jour d’utilisation. PBS + sels biliaires : Dissoudre 40 mg dans 10 mL de PBS 1 x (sels biliaires 0,4 % w/v finales). Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm. Faire des frais sur le jour d’utilisation. CPE + de glucose et de sels biliaires : dissoudre les sels biliaires 40 mg et 0,2 g de glucose dans 10 mL de PBS 1 x (0,4 % w/v les sels biliaires et 2 % w/v glucose final). Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm. Faire des frais sur le jour d’utilisation. Préparer des boîtes de gélose LB. Solution de formaldéhyde/glutaraldéhyde : 810 ajouter µL formaldéhyde (solution mère de 37 %, 3 % concentration finale) et le 125 glutaraldéhyde µL (solution mère de 25 %, la concentration finale de 0,25 %) à PBS 1 x 14 mL. Bien mélanger et conserver à 4 ° C. Le correctif doit être froid pour une utilisation correcte.ATTENTION : Le correctif est toxique et nécessite l’élimination des déchets dangereux. Mountant Antifade solution : utiliser mountant antifade solution contenant 4, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) tache pour inhiber le photoblanchiment des échantillons de la microscopie par immunofluorescence tandis que fluorescent coloration de l’ADN de la bactérie. 2. préparation de bactéries Cultiver des cultures durant la nuit des souches bactériennes à tester en inoculant des 3 mL du BST avec une colonie unique, bien isolée dans un tube à culture stérile. Incuber à 37 ° C sous agitation à 225 tr/min pour une nuit d’incubation (16-24h).NOTE : Souches devraient être restreaked provenant des stocks du congélateur tous les 2 à 4 semaines et entretenu sur plaques non âgés de plus de 2 semaines. 3. phase solide adhésion Assay NOTE : Cet essai quantifie les bactéries adhérentes à l’aide d’une méthode de la plaque à 96 puits. Les bactéries sont cultivées statiquement dans les plaques de fond plat. Laver est effectué afin d’éliminer les bactéries non adhérents et adhérentes bactéries sont colorées au violet de gentiane. La tache violette en cristal lie le peptidoglycane de la paroi cellulaire bactérienne et peut être solubilisée à l’éthanol. Le nombre de bactéries adhérentes est déterminé en fonction sur la rétention de violet de gentiane. Mis en place deux tubes de 1,5 mL. L’étiquette avec le BST ou TSB + sels biliaires (BS). Ajouter 1 mL de TSB ou BST + BS aux tubes respectifs. Ensemencer des tubes avec 20 µL de la culture au jour le jour (à une 01:50 dilution). Dans une plaque à 96 puits stérile, claire, à fond plat, imprégnées de culture de tissus, ajoutez 130 µL/puits de médias de témoins non inoculées à trois puits pour servir le contrôle à blanc. Mettre en place trois puits de contrôle pour chaque type de média (TSB et BST + BS) à tester. Ajouter 130 µL/puits de culture inoculée dans trois puits et répétez jusqu’à ce que toutes les conditions expérimentales sont plaquées en triple exemplaire. Incuber à 37 ° C pendant 4-24 heures statiquement. À l’aide d’un lecteur, enregistrer l’ OD600. Définir les puits de contrôle comme « vide ». Confirmer que le fluide est clair sans aucun signe de turbidité. Si toute turbidité est détectée, jeter l’expérience. Les valeurs de600 OD permet de normaliser les données, s’il y a des différences significatives dans les taux de croissance entre les souches bactériennes. Enlever le milieu de culture à l’aide d’une ligne vide en inclinant légèrement la plaque et en aspirant lentement le milieu sur le bord inférieur du puits. N’oubliez pas de collecter tout le milieu de culture sans perturber la population bactérienne adhérente, située sur la surface en plastique. Si la matrice de l’EPS a été développée au cours de la période d’incubation, la matrice va être visualisée comme un précipité blanc. Ne pas déranger la matrice de l’EPS. Laver délicatement les puits une fois avec 200 µL de PBS stérile. Retirez le lavage de PBS à l’aide de la ligne du vide. Il faut inverser la plaque à sécher. Prévoyez un minimum de 20 minutes pour sécher.Remarque : Étant donné que le biofilm doit être complètement séché avant la coloration, le protocole peut être suspendue à cette étape pour quelques heures ou même une nuit ou plus. Le temps de séchage supplémentaire ne changera pas la procédure de marquage, tandis que le séchage incomplet affectera la quantification des résultats et reproductibilité. Ajouter 150 µL de violet de gentiane 0,5 % pour chaque expérimental et contrôle bien. Incuber 5 min à température ambiante (RT). Laver les puits une fois avec 400 µL d’eau distillée. Le volume supplémentaire est utile pour enlever les tache résiduelle cristal violet sur les côtés des puits. Retirez le lavage avec la conduite d’aspiration. Laver les puits cinq fois avec 200 µL d’eau distillée. Retirez le lavage avec la conduite d’aspiration.Remarque : Le lavage complet est important pour la quantification. Lorsque les blancs sont clairement de l’eau distillée et ne contiennent aucune tache résiduelle cristal violet, passez à l’étape suivante. Il faut inverser la plaque à sécher, abri de la lumière. Obtenir un séchage complet de la plaque comme indiqué plus haut. Décolorer les puits avec 200 µL d’éthanol à 95 %. Incuber les plaques sur l’agitateur pendant 30 min. Pour éviter l’évaporation, en particulier aux températures élevées, effectuez cette étape à 4 ° C. À l’aide d’un lecteur, enregistrer l’ OD540.Remarque : La longueur d’onde d’absorbance maximale de violet de gentiane est près de 590 nm. La littérature fait état d’une gamme de OD540 – OD5954,13,14,15,16 d’absorbance de violet de gentiane ; ainsi, choisir une longueur d’onde disponible basé sur le lecteur. 4. détection de matrice EPS Remarque : Ces tests gratuits quantifier et visualiser l’EPS. Dans les deux, EPS est détecté par une lectine pour lier des polysaccharides. La protéine conjugué fluorescent permet la quantification (étape 4.1) ou visualisation (étape 4.2). Détection semi-quantitative d’EPS Mis en place deux tubes de 1,5 mL. Étiquette avec le BST ou TSB + BS. Ajouter 1 mL de TSB ou BST + BS aux tubes respectifs. Ensemencer des tubes avec 20 µL d’une culture (un 01:50 dilution). Dans une plaque à 96 puits stérile, noire, à fond plat, imprégnées de culture de tissus, ajoutez 130 µL/puits de médias de témoins non inoculées à trois puits pour servir le contrôle à blanc. Mettre en place trois puits de contrôle pour chaque type de média à tester. Ajouter 130 µL/puits de culture inoculée dans les puits et répétez jusqu’à ce que toutes les conditions expérimentales sont plaquées en triple exemplaire. Incuber à 37 ° C pendant 4-24 heures statiquement. Transférer le milieu de culture sur une plaque à 96 puits clair avec une pipette, idéalement une pipette multicanaux. Soyez prudent pour recueillir tout le milieu de culture sans perturber la population adhérente et/ou l’EPS situé sur la surface en plastique. Mettre de côté. Fixer la plaque noire pendant 15 min à ta en solution 1 PBS x à l’aide de 200 µL/puits de la formaldéhyde/glutaraldéhyde. Alors qu’est la fixation de la population adhérente, d’évaluer la fraction surnageante à l’étape 4.1.6. À l’aide d’un lecteur, enregistrer l’ OD600. Définir les puits de contrôle comme « vide ». Confirmer que le fluide est clair sans aucun signe de turbidité. Si toute turbidité est détectée, jeter l’expérience. Sinon, le test complet peut être effectué dans une plaque de fond transparent noir. Dans ces conditions, les valeurs de600 OD peuvent être enregistrés et le milieu de culture peut être jeté par la suite avant de passer à l’étape 4.1.7. Les valeurs de600 OD peuvent être utilisés pour normaliser les données dans le cas il y a des différences significatives dans les taux de croissance entre les souches bactériennes. Supprimer le correctif et éliminer les déchets dangereux. Laver délicatement les puits deux fois avec 200 µL/puits de PBS stérile. Retirez le lavage de PBS à l’aide de la ligne du vide en inclinant doucement la plaque et en aspirant doucement le lavage au bord inférieur du puits. Ajouter 150 µL/puits de 25 µg/mL ConA-FITC et incuber pendant 15 min à température ambiante. Laver délicatement deux fois avec 200 µL de PBS. Ajouter 150 µL de PBS dans chaque puits. Enregistrer la fluorescence à 488 nm. Visualisation de microscopie confocale de production d’EPS et calcul de l’épaisseur du biofilm Mis en place deux tubes de 1,5 mL. Étiquette avec le BST ou TSB + BS. Ajouter 1 mL de TSB ou BST + BS aux tubes respectifs. Ensemencer des tubes avec 20 µL de la culture au jour le jour (à une 01:50 dilution). Mettre en place une plaque 24 puits stérile avec 12 mm stériles round couvre-objet en verre. Ajouter 400 µL/puits de médias de témoins non inoculées à trois puits pour servir le contrôle à blanc. Mettre en place trois puits de contrôle pour chaque type de média à tester. Ajouter 400 µL de culture inoculée dans les puits en double exemplaire et répétez jusqu’à ce que toutes les conditions expérimentales sont plaquées. Incuber à 37 ° C pendant 4-24 heures statiquement. Ne Confirmez visuellement la croissance dans la condition du BST, croissance et condition de BS, + EPS précipité (blanc) dans le BST et aucune croissance et/ou précipité blanc dans les puits de contrôle stérile. Supprimer les surnageants. Difficulté à RT à l’aide de 200 µL/puits de la solution de formaldéhyde/glutaraldéhyde dans 1 x PBS pendant 15 minutes. Supprimer le correctif et disposer de déchets dangereux. Laver délicatement les puits deux fois avec 200 µL/puits de PBS stérile. Retirez le lavage de PBS à l’aide de la ligne du vide. Ajouter 150 µL/puits de 25 µg/mL ConA-FITC et incuber pendant 15 min à température ambiante. Laver délicatement deux fois avec 200 µL/puits de PBS. Monter avec solution antifade mountant au DAPI.Remarque : La solution est une solution de montage prêtes à l’emploi, axée sur le glycérol contenant DAPI pour préserver les étiquettes fluorescentes tout en simultanément coloration de l’ADN dans des cellules bactériennes pour la visualisation comme contre-colorant. Suivre les instructions et les recommandations du kit pour les temps d’incubation avant l’imagerie des échantillons. Le DAPI souillant le procédé peut être effectué avant d’appliquer la solution mountant antifade qui ne contient-elle pas de DAPI. Évaluer par microscopie confocale. Sur un microscope confocal, affectez le laser nm/519 495 nm excitation/émission pour la visualisation de la FITC. Définissez un deuxième laser à 360 nm/460 nm excitation/émission de visualiser DAPI. Localiser le biofilm en mettant l’accent sur le canal DAPI. Utiliser des canaux du FITC tant DAPI pour déterminer la pleine épaisseur et définir la partie supérieure et inférieure d’imagerie frontières. Enregistrer des images de pleine épaisseur Z-pile en capturant des images chaque 0,25 µm après avoir réglé les périmètres en haut et en bas de la pile-z. Pour plus d’informations sur la microscopie confocal, veuillez vous reporter aux publications de Paddock et al. 17 , 18 , 19 , 20 Reconstruire les images 3D dans ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) pour visualiser la formation de biofilm complet et calculer l’épaisseur du biofilm. L’épaisseur moyenne obtenue pour S. flexneri sels biliaires induits biofilms était 14 µm4. 5. Dispersion Assay Remarque : Dans cet essai, le démontage du biofilm par dispersion bactérienne est détecté. Ici, biofilms matures sont établies et par la suite (habituellement le lendemain), les médias sont remplacés par PBS ou complétées de PBS. Le composant surnageant est ensuite évalué pour quantifier le nombre de bactéries qui ont dissocié le biofilm. Mis en place deux tubes de 1,5 mL. Étiquette avec le BST ou TSB + BS. Ajouter 1 mL de TSB ou BST + BS aux tubes respectifs. Ensemencer des tubes avec 20 µL de la culture au jour le jour (à une 01:50 dilution). Dans une plaque à 96 puits stérile, claire, à fond plat, imprégnées de culture de tissus, ajoutez 130 µL/puits de médias de témoins non inoculées à trois puits pour servir le contrôle à blanc. Mettre en place trois puits de contrôle pour chaque type de média à tester. Ajouter 130 µL/puits de culture inoculée à trois puits et répétez jusqu’à ce que toutes les conditions expérimentales sont plaquées en triple exemplaire. Incuber les plaques pendant 4 à 24 heures à 37 ° C statiquement. Avant de continuer, réchauffer le PBS, PBS + glucose, PBS + sels biliaires et PBS + sels biliaires + glucose à 37 ° C. Préparer ces frais du jour réactifs. À l’aide d’un lecteur, enregistrer l’ OD600. Définir les puits de contrôle comme « vide ». Confirmer que le milieu est clair sans aucun signe de turbidité. Si toute turbidité est détectée, jeter l’expérience. Les valeurs de600 OD permet de normaliser les données, s’il y a des différences significatives dans les taux de croissance entre les souches bactériennes. Enlever le milieu de culture à l’aide d’une ligne vide. N’oubliez pas de collecter tout le milieu de culture sans perturber la population adhérente située sur la surface en plastique. Laver délicatement les puits deux fois avec 200 µL/puits de PBS stérile. Retirez le lavage de PBS à l’aide de la ligne du vide. Remplacer le lavage avec 130 µL/puits de ce qui suit dans trois puits chaque : PBS, PBS + glucose, PBS + sels biliaires et PBS + sels biliaires + glucose. Ces réactifs doivent être pré chauffées à 37 ° C. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 ° C. Retirer délicatement la plaque de l’incubateur à 37 ° C. Transférer les surnageants dans une plaque à 96 puits fraîche, stérile. À l’aide d’un bloc de plaque ou d’une dilution de 96 puits, préparer un facteur 10 (01:10) série de dilutions de surnageant dans PBS stérile.NOTE : La série de dilution doit varier de non dilué à 10-6 selon les souches bactériennes à tester. Expériences pilotes peuvent être effectuées pour déterminer la plage de la dilution optimale. Repérer la plaque 5 µL de chaque dilution en gélose LB à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber à 37 ° C pendant la nuit. Dénombrer les colonies sur le lendemain et compte pour le facteur de dilution lors de la détermination de la colonie de récupération formant des unités (UFC). Pour calculer la dispersion pour cent par rapport à la 1 x contrôle de PBS (fixé à 100 %), divisez la récupération UFC dans chaque condition de traitement par la récupération UFC dans l’échantillon de contrôle de PBS 1 x.NOTE : Plaques de médias de Routine pour la souche bactérienne d’intérêt peuvent également être utilisés. Par exemple, Shigella peuvent être plaqués sur les plaques rouge Congo. S’assurer que les plaques soient sèches pour les techniques de placage à l’endroit appropriés.

Representative Results

Dans la Figure 1, la formation de biofilm est induite dans la plupart de la croissance suivante testé six pathogènes entériques dans des milieux contenant des sels biliaires. Une augmentation significative des bactéries adhérentes après que exposition de sels biliaires est observée dans presque toutes les souches testées. L’exception est entéroaggrégatif e. coli (CEEA) ; cependant, note l’observation induite des mutantsaa…

Discussion

Analyse de la formation de biofilm est difficile en raison de la nature dynamique des biofilms et la variabilité entre les souches, les matériaux, laboratoires et analyses. Ici, plusieurs stratégies sont présentées afin de déterminer la formation de biofilm dans entéropathogènes après exposition de sels biliaires avec perspicacité expérimentale prévue pour promouvoir la reproductibilité. Il y a des considérations supplémentaires pour assurer la reproductibilité. Tout d’abord, nous vous recommandons d’…

Materials

Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
Crystal Violet	Sigma	C6158-50
Concanavalin-A FITC	Sigma	C7642-10mg
Glucose	Sigma	G7021-1KG
Bile Salts	Sigma	B8756-100G
LB Agar	Sigma	L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile	Fisher	14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635-500
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear)	TPP	92696
Flat-bottomed 96-well plates (black)	Greiner Bio-One	655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear)	TPP	92424
Glass coverslips 12mm, round	Fisher	08-774-383
96-well plate reader	Spectramax
Flourescent plate reader	Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope	Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator	New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator	Thermolyne Series 5000