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Article de méthode

Le protocole MPLEx pour Multi-omic Analyses d’échantillons de sol

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DOI :

10.3791/57343

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30 mai 2018

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1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Un protocole est présenté pour simultanément extraction de métabolites, les protéines et les lipides provenant d’un échantillon de sol unique, ce qui permet des temps de préparation d’échantillon réduite et permettre multi-omic analyses de spectrométrie de masse des échantillons avec des quantités limitées.

Résumé

Spectrométrie de masse (MS)-fonction intégrée metaproteomic, métabolomique et études lipidomic (multi-omic) transforment notre capacité de comprendre et de caractériser des communautés microbiennes dans les systèmes biologiques et environnementales. Ces mesures permettent même des analyses améliorées des communautés microbiennes des sols complexes, qui sont les plus complexes systèmes microbiens connus à ce jour. Multi-omic analyses, cependant, ont défis d’échantillon de préparation, car séparé les extractions sont généralement nécessaires pour chaque étude omic, amplifiant ainsi considérablement le temps de préparation et de la quantité d’échantillon requis. Pour combler cette lacune, une méthode 3-en-1 pour l’extraction simultanée des métabolites, des protéines et des lipides (MPLEx), partir du même échantillon de sol a été créé en adaptant une approche à base de solvant. Ce protocole MPLEx s’est avéré pour être simple et robuste pour de nombreux types d’échantillons, même lorsqu’utilisé pour des quantités limitées d’échantillons de sol complexes. La méthode MPLEx activé aussi grandement les mesures rapide multi-omic nécessaires pour acquérir une meilleure compréhension des membres de chaque communauté microbienne, tout en évaluant les changements qui se produisent lors de perturbations biologiques et environnementale.

Introduction

Évaluation des communautés microbiennes du sol a des implications importantes pour la compréhension de carbone vélo et le changement climatique. Des études récentes ont cependant mis en évidence des difficultés, telles que l’absence de génomes séquencés pour microbiote dans divers types de sols et de la fonction inconnue de la plupart des protéines détectées. Résultat de ces défis en raison du sol étant la communauté microbienne plus complexe connue à ce jour1,2,3. Des analyses multi-omic qui combinent les résultats de la métagénomique, metatranscriptomic, metaproteomic, métabolomique et lipidomic études, ont récemment été mis en œuvre dans de nombreuses études de sol pour mieux connaître dans les microbes présents, tout en obtenir des informations complètes sur les changements moléculaires qui aura lieu en raison de perturbations de l’environnement1,4,5. Un défi avec multi-omic études est que la spectrométrie de masse (MS)-base de mesures metaproteomic, métabolomique et lipidomic exigent généralement un procédé d’extraction spécifique pour chaque omic MS compatible6,7 , 8 , 9. ces procédures précises font leur mise en œuvre extrêmement difficile, voire impossible lorsque seule une quantité limitée de l’échantillon est disponible. Ces défis nous ont incités à étudier une simultanée métabolite, protéines et lipides (MPLEx) méthode d’extraction capable d’utiliser des petits volumes d’échantillon ou de masses, améliorer la précision et fournissant des préparations plus rapides pour tous les trois analyses 10. a ce jour, il n’y a aucune procédure d’extraction de sol remplaçant qui peut atteindre tous ces objectifs.

Pour activer le multi-omic global analyse d’un échantillon de sol unique, un protocole d’extraction par solvant organique basé sur le chloroforme méthanol et séparations d’eau a été utilisé10. Cette méthode a été développée pour les extractions de lipides totaux9,11 et plus récemment a été modifiée pour l’extraction simultanée des métabolites, des protéines et des lipides d’un seul échantillon12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, ce qui permet de la moindre quantité d’échantillon et 10de la variabilité expérimentale. Dans le protocole MPLEx, chloroforme n’est pas miscible avec l’eau, qui constitue la base de la triphasique la séparation chimique des constituants de l’échantillon en fractions distinctes. La phase aqueuse supérieure contient donc les métabolites hydrophiles, suivies d’un disque de protéine, puis une couche de lipides dans la phase chloroformique bas (Figure 1). Lorsque MPLEx est appliqué à la plupart des sols, débris particulaires s’accumule au bas des tubes d’échantillonnage et peuvent être ignorées après que tous les calques sont collectées. Chaque type de sol peut être différent, cependant et dans un sol très organique tels que de la tourbe, les débris du sol reste dans la couche intermédiaire et ne tombent pas au fond du tube d’échantillonnage. MPLEx offre plusieurs avantages lorsque isoler une molécule plusieurs types du même échantillon, tels que 1) plus petites quantités d’échantillon peuvent être utilisées pour les analyses multi-omic, les extractions de la même diminution de l’échantillon 2) multi-omic variabilité expérimentale dans l’ensemble, et 3) un plus grand nombre d’échantillons peut être préparé beaucoup plus vite pour un débit plus élevé studies10. Ensemble, ces avantages sont essentiels pour fournir de meilleures capacités de mesure permettant d’évaluer des échantillons de sol et de leurs communautés microbiennes complexes.

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Protocole

NOTE : Sols très humides peuvent être lyophilisées avant extraction sans que cela nuise à l’efficacité de l’extraction. Humidité du sol peut également être utilisé, mais sont à considérer lors de l’ajout de réactifs à des rapports spécifiques.

Remarque : Il est recommandé d’utiliser 20 g de poids de sol sec par extraction, qui doit être partagée entre deux tubes de 50 mL (maximum de 10 g de sol par tube de 50 mL). Les extractions peuvent être redimensionnées, haut ou bas selon échantillon disponible.

Remarque : Les échantillons de sol sec peuvent être tamisés à travers un écran de 3 mm afin d’homogénéiser et d’enlever les roches et les petites racines. Tamis pas des échantillons de sol humide, car l’échantillon sera coincé à l’écran.

1. sur le sol la lyse cellulaire et l’Extraction des métabolites, des protéines et des lipides (Timing ~ 1 d)

  1. Par échantillon de 20 g de sol, peser 10 g dans deux tubes séparés de 50 mL qui sont compatible méthanol/chloroforme. Soyez vigilants avec les tubes choisis, comme le chloroforme lixiviation de la plupart des plastiques, contaminer les échantillons. Utiliser le verre chaque fois que possibles ou en plastique de tubes en polypropylène ou polytétrafluoroéthylène (PTFE).
    NOTE : Gardez le sol sur la glace et aussi frais que possible pendant les étapes initiales de la pesée et l’homogénéisation.
  2. Ajouter 10 mL de chloroforme lavé en acier inoxydable et de perles de grenat dans chaque tube. Sur la glace, ajouter 4 mL de froid ultrapure (voir Table des matières pour système de purification) d’eau dans chaque tube (un échantillon scission entre deux tubes) et transférer les échantillons dans un bac à glaçons dans une hotte aspirante.
  3. À l’aide d’une pipette sérologique de verre de 25 mL, rapidement ajouter 20 mL de chloroforme : méthanol de glacee 2:1 (v/v).
    ATTENTION : Chloroforme : méthanol a effets aigus sur la santé : peau, irritation, brûlures chimiques possibles et une irritation du système respiratoire. Elle peut affecter les reins, le foie et le coeur. Porter des gants, des vêtements et des lunettes de protection adaptés et toujours travailler sous une hotte.
  4. Visser les couvercles et les vortex en solution. choloroform:methanol 2:1 aide à briser le mur de cellules des procaryotes et désactive également les activités enzymatiques.
  5. Attachez les tubes de 50 mL tube vortex attaches et, horizontalement, Vortexer pendant 10 min à 4 ° C à l’intérieur d’un réfrigérateur si possible. Ensuite, placer les échantillons à l’intérieur d’un congélateur-80 ° C pendant environ 15 min afin de les refroidir complètement.
  6. En utilisant un sonicateur de sonde à l’intérieur d’une hotte aspirante, soniquer chaque échantillon avec une sonde de 6 mm (1/4") à amplitude 60 % pour 30 s de chaque sur la glace.
    ATTENTION : Il est recommandé d’utiliser un son apaisement enceinte et oreille protection sonification. Haute tension est présente dans le câble d’alimentation et de haute fréquence. Évitez de toucher le fond et les bords du navire échantillon avec une sonde active ; Il peut casser ou faire fondre le plastique.
  7. Placer les échantillons dans le congélateur-80 ° C pendant environ 15 min, sonification peut générer beaucoup de chaleur.
  8. Répétez les étapes 1,5 à 1,7.
    Remarque : Assurez-vous que les échantillons restent froides durant toute la procédure de lyse.
  9. Centrifuger les échantillons à 4 000 x g pendant 5 min, 4 ° C. À ce stade, l’échantillon sera séparé dans la couche supérieure de métabolite, l’intercalaire de protéine, la couche inférieure de lipides (et granule de débris restant). Voir la Figure 1.
  10. Placer les échantillons sur la glace dans un bac à glaçons et, à l’intérieur d’une hotte aspirante et à l’aide d’une pipette sérologique de verre de 10 mL, enlever les couches supérieures de métabolite provenant des deux tubes de 50 mL dans un grand verre flacon.
    Remarque : Évitez d’aspiration de la couche de protéine dans la pipette ; laisser une petite couche de métabolite si nécessaire.
  11. Inclinez légèrement le tube de 50 mL pour libérer l’intercalaire de protéine pour qu’il soit libre flottant sur la couche inférieure de lipides. En utilisant une spatule de tête plate lab nettoyer l’acier inoxydable, soigneusement ramasser tous les deux les intercalaires de protéine et placez-les ensemble dans un nouveau tube de 50 mL.
  12. À l’aide d’une pipette sérologique de verre de 25 mL, enlever les couches de lipides plus faibles dans un flacon de verre grand.
    NOTE : Essayez d’éviter les particules du sol ; Cependant, quelques débris de sol et les particules aspiraient le long avec les lipides seront supprimés à une date ultérieure.
  13. Place des membranes perméable à l’air sur le dessus du métabolite et lipides fioles en verre et sécher dans un concentrateur sous vide jusqu'à séchage (lipides ~ 4-5 h, métabolites du jour au lendemain).
  14. Le tube d’échantillon de protéine et les tubes de granules débris restants, ajouter 20 mL de méthanol glacée à chacun et vortex. Ceci est fait pour les pellets de débris rince chloroforme avant de tenter de solubiliser toute protéine restant possible hors les débris avant de jeter.
  15. Centrifuger les pastilles de débris et de protéines intercalaires à 4 000 x g pendant 5 min, 4 ° C, puis décanter le méthanol dans un conteneur de déchets dangereux à l’intérieur d’une hotte aspirante.
  16. Geler les pellets de protéine et de débris dans l’azote liquide et sécher dans un lyophilisateur (avec une température collecteur capable de-105 ° C en raison de méthanol ayant un très bas point de congélation de-98 ° C) pendant environ 2 heures.
    Remarque : Ne pas trop sécher les pellets, car ils seront plus difficiles à solubiliser.
  17. Ajouter 10 mL de tampon de solubilisation de protéine (4 % SDS, 100mM DTT (DL-dithiothréitol) dans un tampon tris 50mM, pH 8,0 ; voir Complémentaire réactif Set-up) pour le tube intercalaires de protéines et 20 mL de chacune des pastilles débris.
    ATTENTION : SDS provoque une toxicité aiguë et est inflammable. C’est une peau, yeux et des voies respiratoires irritantes. Porter des gants et des lunettes de sécurité.
  18. Sous la hotte, sonde soniquer les échantillons à amplitude de 20 % pendant 30 s pour les mettre en solution. Vortexer pendant 2 min.
  19. Placer l’échantillon intercouche de protéine dans une coiffe de tube de laboratoire pendant 30 min à 300 tr/min, 50 ° C, pour solubiliser les protéines.
  20. Horizontalement vortex les échantillons de débris pendant un 10 min supplémentaire à la lyse des cellules intactes restantes, puis faites tourner avec les échantillons intercouche de protéine pour les 20 minutes restantes.
  21. Tous les échantillons à 4 500 g pendant 10 min, température ambiante (RT), centrifuger et recueillir le surnageant de chaque éprouvette par échantillon dans deux tubes de 50 mL.
  22. Ajouter 10 mL de solubilisation tampon au culot intercouche protéine, puis laisser agir et vortex de nouveau dans la solution et centrifuger comme avant.
  23. Combinez les surnageants dans les deux tubes de 50 mL tout aussi et centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min, 4 ° C, dans un seau rotor à angle fixe.
    Remarque : Une centrifugation finale est nécessaire pour éliminer les substances humiques contaminantes excessives.
  24. Décanter les surnageants dans deux tubes de 50 mL pour qu’il y a 30 mL chacune. Puis, à l’aide d’une pipette sérologique de verre de 10 mL, ajouter 7,5 mL de TCA (acide trichloracétique) dans chaque tube. Vortex solution. Cela fait 20 % TCA dans chaque échantillon de 30 mL (ajuster en conséquence),
    ATTENTION : Le TCA est caustique, toxique et peut provoquer des brûlures de la peau. Porter des gants et des lunettes de sécurité.
  25. Placer les échantillons dans un congélateur à-20 ° C pendant 2 h pour la nuit.
    Remarque : Les protéines précipiteront typiquement moins de 1 h mais peuvent être laissé pour la nuit (jusqu'à 18 h).
    Remarque : Ne laissez pas l’extraction de la TCA aller plus que 18 h en raison de la possible hydrolyse acide de la protéine. Si l’échantillon est congelé, décongelez-le sur glace ; ne pas laisser l’échantillon d’échauffement après le dégel.
  26. Pour les protéines précipitées de granule, centrifuger l’échantillon à 4 500 g pendant 10 min, 4 ° C et décanter le liquide surnageant dans des déchets.
  27. Ajouter 10 mL d’acétone glacée 100 % à chaque granule de protéine, les vortex et les combiner comme boulettes dans un tube.
  28. Centrifuger le tube contenant le culot combiné (utilisation d’une balance) et puis décanter le liquide surnageant dans des déchets.
    ATTENTION : L’acétone peut provoquer des voies respiratoires et irritation de la peau et des yeux et est un liquide et vapeurs inflammables. Porter des lunettes de protection gants et une blouse de laboratoire, travailler sous une hotte.
  29. Laver le culot deux fois à l’aide de 1,5 mL d’acétone et enfin transvaser dans un tube de 2 mL pour l’essorage final à 10 000 g pendant 5 min.
  30. Décanter le liquide surnageant dans déchets et permettre le culot sécher inversé sur un chiffon de papier dans une hotte de laboratoire pendant environ 20 min ou sous un courant d’azote jusqu'à ce que la pastille légèrement commence à craquer.
  31. Ajouter 100 à 200 µL de l’amortisseur de solubilisation de protéine, selon la taille de la pastille.
    NOTE : Gardez le volume de tampon de solubilisation ajouté à l’échantillon aussi bas que possible. Subséquentes filtre assistée par exemple préparation (FASP) ne peut utiliser jusqu'à 50 μL d’échantillon solubilisée par colonne ; tout doit être divisé en plusieurs colonnes FASP.
  32. Soniquer et vortex le culot dans la solution. Notez que l’échantillon peut être visqueux en raison des substances humiques, précipitant ainsi que de la protéine, qui est enlevée avec une centrifugation ultérieure.
  33. Agiter l’échantillon dans un incubateur/agitateur pendant 30 min à 300 tr/min, 40 ° C, pour solubiliser les protéines en solution et procéder à la digestion des protéines.
  34. Composant logiciel enfichable geler l’échantillon dans l’azote liquide et ranger dans un congélateur à-80 ° C jusqu’au moment de la digestion des protéines.

2. lipides préparation (calendrier ~ 20 min)

  1. Une fois que les échantillons de lipides sont secs, ajouter 200 μl de chloroforme : méthanol de 2:1 dans le flacon, vortex solution et transvaser dans un tube en polypropylène de 1,5 mL, ajouter une supplémentaire de 200 μl au verre flacon, vortex et pipeter les lipides restants et transférer dans le tube.
  2. Centrifuger les débris de l’échantillon à 12 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Transvaser le surnageant dans un flacon en verre de lipides et les conserver à-20 ° C jusqu'à l’analyse LC-MS/MS (des détails supplémentaires pour LC-MS/MS en Méthodes complémentaires).
  4. Si les échantillons ne peuvent pas être analysés immédiatement après la préparation, les lipides doivent être stockés dans un solvant à-20 ° C pour éviter l’oxydation et dégradation.

3. métabolite préparation et dérivation (calendrier ~ 5 h)

  1. Le jour après une extraction, retirer les échantillons de métabolite de l’aspirateur de vitesse et stocker à sec à-20 ° C jusqu’au moment de dérivation et d’analyse sur le GC. Si ce n’est pas le cas, les métabolites en cours d’exécution sur un GC, puis préparer en utilisant le protocole approprié pour l’instrument.
  2. Immédiatement avant la dérivatisation les métabolites d’analyse sur la GC, transférez-les des flacons en verre grand en ajoutant 200 μl de méthanol, Vortex et l’ajout d’un tube en polypropylène de 1,5 mL. Répéter une fois.
  3. Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 10 min, 4 ° C. Transvaser le surnageant dans petits flacons en verre, ajoutez une membrane perméable à l’air vers le haut et complètement sec dans un aspirateur de vitesse.
  4. Derivatize les métabolites en ajoutant 20 µL de solution de méthoxyamine dans le flacon et vortexer pendant 30 s sur un vortexer à vitesse moyenne.
    ATTENTION : Le chlorhydrate de méthoxyamine provoque des brûlures graves et lésions oculaires graves, peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau. Porter des lunettes de protection, des gants et blouse de laboratoire et travailler sous une hotte.
  5. Utilisez un sonicateur bain pour s’assurer que l’échantillon est complètement dissous.
  6. Incuber l’échantillon dans un incubateur avec un couvercle de prévention condensation maintenu à 37 ° C pendant 1 h 30 min avec 1 000 tr/min secouant.
  7. Inverser le flacon une fois pour mélanger les échantillons avec des gouttes condensées à la surface du bouchon. Faire tourner l’échantillon vers le bas à 1 000 x g pendant 1 min, RT
  8. Effectuer la silylation en ajoutant 80 µL (à l’aide d’une seringue) de N-méthyl - N-(triméthylsilyl) trifluoroacétamide avec 1 % triméthylchlorosilane. Vortex pendant 10 secondes.
    ATTENTION : MSTFA + 1 % TMCS peuvent causer la corrosion cutanée, lésions oculaires graves et toxicité pour certains organes cibles spécifiques et est un liquide et vapeurs inflammables. Porter des lunettes de protection, des gants et blouse de laboratoire et travailler sous une hotte.
  9. Incuber l’échantillon dans un incubateur avec un couvercle de prévention condensation maintenu à 37 ° C pendant 30 min à 1 000 tr/min secouant.
  10. Inverser le flacon une fois pour mélanger les échantillons avec des gouttes condensées à la surface du bouchon.
  11. Faire tourner l’échantillon vers le bas pendant 5 min à 2 000 x g, RT
  12. Transvaser la solution réagie dans flacons appropriés pour l’analyse par CPG-SM.

4. protéine Digestion (calendrier ~ 1 d)

  1. Centrifuger l’échantillon à 15 000 x g pendant 5 min, RT, pour granuler les débris.
  2. Effectuer filtre-Aided--préparation des échantillons (FASP), car la digestion à l’aide de la FASP kits (voir Table des matières) qui suit modification instructions31,32 du fabricant:
    1. Ajouter 400 ml du tampon urée 8 M dans une colonne de la FASP (500 filtre μL 30K MWCO essorage).
    2. Une fois l’exemple terminé centrifugation, Pipeter hors le surnageant (jeter le culot) et ajouter 50 μl de l’échantillon à la 400 μL d’urée 8 M dans la colonne.
      Remarque : Ajouter seulement jusqu'à 50 μL d’échantillon par colonne. Si il n’y a plus de 50 μL d’échantillon, utilisez plusieurs colonnes et combinez les peptides après digestion. Il est préférable de laisser ce volume aussi faible que possible (30 µL est idéal) afin d’assurer la FASP colonne supprimera tous le SDS qui peuvent gêner considérablement l’analyse masse spec.
    3. Placer la colonne dans le tube inclus 1,5 mL et centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 30 min, RT
    4. Supprimer les intermédiaires avec les ordures et ajouter 400 ml d’urée 8 M à la colonne et centrifuger à nouveau.
    5. Répétez l’étape précédente une fois de plus pour un total de 3 rinçages d’urée.
      Remarque : Assurez-vous que l’échantillon passe à proximité de la sécheresse sur la colonne, s’il y en a plus de ~ 30 µL restant sur le filtre après chaque tour, continuer la centrifugation.
    6. Ajouter 400 ml de 50 mM NH4HCO3 et centrifuger à 14 000 x g pendant 20 min, jeter les déchets et répéter une fois.
    7. Transférer les colonnes dans un tube à centrifuger propre de 1,5 mL.
    8. Ajouter 75 μL de tampon de digestion de trypsine aux colonnes et incuber à 37 ° C pendant 3 h dans un incubateur avec un couvercle de prévention condensation à 750 tr/min.
    9. Ajouter 40 µL de 50 mM NH4HCO3 dans les colonnes.
    10. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 15 min récupérer les peptides dans le tube tout en gardant les contaminants de poids moléculaire élevé sur le dessus de la colonne.
    11. Ajouter 40 μL de 50mM NH4HCO3 dans la colonne et centrifuger à nouveau.
  3. Jeter la colonne, les peptides à sec vers le bas les peptides dans le tube dans un ACC de vitesse pour ~ 30 µL et le dosage de la BCA (kit de dosage de protéine acide Bicinchoninic ; voir Table des matières).
  4. Vous pouvez également exécuter une étape de nettoyage si l'on soupçonne une contamination de SDS (bulles visibles)33. Une extraction en phase solide doit se faire par la suite, si vous choisissez cette option. Des informations détaillées sur cette méthode de nettoyage sont disponibles dans les Méthodes complémentaires.
  5. Diluer l’échantillon pour analyse par SM ou éventuellement procéder à fractionnement HPLC (deux étapes).
  6. Pour fractionner, diluer les échantillons à un volume de 400 µL avec un tampon de formiate d’ammonium 10 mM (pH 10,0).
  7. Régler sur une colonne C18 (voir Table des matières) en séparant, à 0,5 mL/min en utilisant un système HPLC avec formiate d’ammonium de phases mobiles (A) 10 mM, pH 10,0 et (B), formiate d’ammonium du 10 mM, pH 10,0/acétonitrile (10 : 90).
    1. Régler le gradient d’à 100 % A 95 % A au cours des 10 première min, 95 % A 65 % A plus de min 10 à 70, A de 65 % à 30 % A plus de min 70 à 85, maintenir à 30 % A plus de min 85 à 95.
    2. Rééquilibrer avec 100 % A plus min 95 à 105 et tenir à 100 % A min 120.
    3. Recueillir des fractions chaque min 1,25 (96 fractions sur le gradient entier) et enfin de combiner tous les rangs pour un total de 12 échantillons ou tous les deux rangs pour 24 échantillons (chacune avec n = 8 ou n = 4 fractions mis en commun).
  8. Séchez toutes les fractions sous vide et ajouter 15 µL d’eau ultrapure à chacun pour le stockage à-20 ° C jusqu'à l’analyse de LC-MS/MS.

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Résultats

Lorsque le protocole MPLEx servait à extraire les molécules du Kansas prairie indigène sol (un sol Mollisol), les analyses en triple a fourni des résultats pour les 3376 peptides, 105 lipides et 102 métabolites polaires (toutes les identifications uniques). Alors que le protocole MPLEx a été bien établi pour générale d’extraction des lipides et des métabolites12,13,14,

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Discussion

Il est important de noter que pas tous les laboratoires auront le même équipement disponible pour certaines méthodes, par exemple l’étape de lyse, peuvent être adaptés. Ici, nous utilisons vortex et la sonification, cependant l’utilisation d’un batteur de perle grand 50 mL fonctionnerait. Si un lyophilisateur avec une température collecteur capable de-105 ° C n’est pas disponible, les échantillons peuvent être séchés sous courant d’azote. Aussi les types de sol varient considérablement et peuvent inclure des sable, limon...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Nathan Johnson pour son aide dans la préparation des chiffres. Cette recherche a été soutenue par le programme Pan-omics qui est financé par le U.S. Department of Energy Office of Biological and Environmental Research (programme des sciences génomiques) les Microbiomes en Transition (MinT) laboratoire réalisé recherche développement Initiative à la Pacific Northwest National Laboratory, ainsi que le National instituts de santé National Institute de Environmental Health Sciences (R01 ES022190) et le NIH (P42 ES027704). KEBJ tiens à remercier R21 HD084788 pour un soutien financier élaborer et valider des techniques d’extraction de nouveaux multi-omic. Cette œuvre était jouée dans W. R. Wiley environnement moléculaire Sciences Laboratory (EMSL), une installation utilisateur scientifique national de DOE à la Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PPNL est un laboratoire national multi-programme exploité par Battelle pour l’entité opérationnelle désignée en vertu du contrat DE-AC06-76RL01830.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
ChloroformeSigma-Aldrich650498stocké à -20° ; C ! Attention le chloroforme a des effets potentiels aigus sur la santé, une irritation de la peau et d’éventuelles brûlures chimiques, une irritation du système respiratoire, peut affecter les reins, le foie, le cœur. Portez des lunettes de protection, des vêtements et des gants appropriés, travaillez dans une hotte.
MéthanolSigma-Aldrich34860stocké à -20° ; C ! Attention Le méthanol peut provoquer une irritation des voies respiratoires, de la peau et des yeux, ainsi que des dommages aux nerfs, aux reins et au foie. Portez des lunettes de protection, des vêtements et des gants appropriés, travaillez dans une hotte.
Eau purifiée du système de purification d’eau MilliporeMilli-Q.
Dodécylsulfate de sodiumSigma-AldrichL6026! Attention : le SDS provoque une toxicité aiguë et est inflammable. C’est un irritant pour la peau, les yeux et les voies respiratoires. Portez des gants et des lunettes de sécurité.
Kit d’extraction de protéines de solMoBio, NoviPure Kit d’extraction de protéines de sol, Qiagen30000-20
DL-dithiothreitolSigma-Aldrich43815
1M Trizma HCLSigma-AldrichT2694
Acide trichloracétiqueSigma-AldrichT0699 ! Attention Le TCA est caustique, toxique et peut provoquer des brûlures cutanées. Portez des gants et des lunettes de sécurité.
AcétoneSigma-Aldrich650501stockée à -20° ; C ! Attention L’acétone peut provoquer une irritation des voies respiratoires et de la peau et des yeux. Liquide et vapeur inflammables. Portez des lunettes de sécurité, des gants et une blouse de laboratoire, travaillez dans une hotte.
UreaSigma-Aldrich208884 ! Attention L’urée est un irritant pour les yeux et la peau, utilisez des gants et des lunettes de sécurité
Bicarbonate d’ammoniumFluka09830
TrypsinePromegaV528A20µ ; g flacons Kit de dosage des protéines d’acide
bicchoniniquePierce23227
Formiate d’ammoniumSigma-Aldrich09735
AcétonitrileSigma-Aldrich34998 ! Attention L’acétonitrile est un irritant pour la peau et les yeux. Hautement inflammable. Portez des gants et des lunettes de sécurité. Travaillez dans une hotte.
Acide trifluoroacétiqueSigma-AldrichT6508! Attention Le TFA est extrêmement dangereux en cas de contact avec la peau, les yeux, l’ingestion et l’inhalation. Peut produire des lésions tissulaires, en particulier sur les muqueuses des yeux, de la bouche et des voies respiratoires. Le contact avec la peau peut provoquer des brûlures. Portez des gants, une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et travaillez dans une hotte.
Chlorhydrate de méthoxyamineSigma-Aldrich226904 ! Attention Le chlorhydrate de méthoxyamine provoque de graves brûlures et des lésions oculaires graves, peut provoquer une sensibilisation par contact cutané. Portez des lunettes de sécurité, des gants et une blouse de laboratoire, travaillez dans une hotte.
PyridineSigma-Aldrich270970! Attention La pyridine peut provoquer une irritation de la peau et des yeux, une dépression du système nerveux central. La vapeur peut provoquer un feu instantané. Portez des lunettes de sécurité, des gants et une blouse de laboratoire, travaillez dans une hotte.
N-méthyl-N-(triméthylsilyl)trifluoroacétamide avec 1 % de triméthylchlorosilaneSigma-Aldrich69478 ! Attention : MSTFA + 1 % TMCS peut provoquer une corrosion cutanée, des lésions oculaires graves et une toxicité pour certains organes cibles. Liquide et vapeur inflammables. Portez des lunettes de sécurité, des gants et une blouse de laboratoire, travaillez dans une hotte.
Chlorurede potassium Sigma-AldrichP9541
Système de purification d’eau Milli-QModèle MilliporeMPGP04001
VortexScientific IndustriesSI-0236Vortex Genie 2
Sonde sonicatorFisherMarquemodèle FB505
Centrifugeuse réfrigéréeEppendorfmodèle 5810R
Tube de 50mL rotor à godets oscillantsEppendorfA-4-44
50mL rotor à angle fixeEppendorfFA-45-6-30
BalanceOHAUSmodèle V22PWE150IT
Contrôleur de pipettes sérologiquesEppendorf12-654-100
10mL, 25mL pipettes sérologiques en verreFisherBrand13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixeur avec ThermotopEppendorf5382000015, 5308000003
0,9 &ndash ; 2,0 mm mélange de billes en acier inoxydableNextAdvanceSSB14B
0,15 mm PearlMoBio13122-500
Plaque d’agitation magnétiqueFisherBrand11-100-16SH
Barre d’agitation magnétiqueFisherBrand14512130
bandes de papier pH, pH portée 0&ndash ; 14FisherBrandM95903
15mL, 50mL tube à centrifuger conique en polypropylèneGenesee Scientific21-103 21-108compatible chloroforme
50mL vortex attachmentMoBio13000-V1-50
Seau à glaceFisherBrand02-591-44
27.25x70mm flacons en verreFisherBrand03-339-22K
Breathe Membranes de plaque plus facilesMidwest ScientificBERM-2000
Lingettes alcooliséesDiversified BiotechBPWP-1000
Incubateur de secousses de chauffageBenchmark, Incu-Shaker Mini
Rotateur de tube de rôtissoire analogiqueSoCal BioMed, LLC82422001
Kit de préparation d’échantillons assisté par filtreFASP ; Expedeon44250
Lecteur de microplaquesBiotek, Congélateur EPOCH-20
Degree CelsiusFisherCongélateur 13986149-80
Degree CelsiusStirling UltracoldSU78OUE
Q-Exactive Spectromètre de masse à piège ioniqueThermo Scientific
Agilent 7890A couplé à un seul quadripôle Spectromètre de masse 5975CAgilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap VeloThermo Scientific
Waters NanoEquityTM Système UPLCMillford, MA
Flacon de support de 250 mlFisherBrand1395-250
Flacon d’eauWaters186002805
Glass MS flacon d’échantillon et insertsMicroSolv9502S-WCV, 9502S-02ND
Verre Flacon HPLC et bouchons à pressionMicroSolv9512C-0DCV, 9502C-10C-B
Plaque HPLC à 96 puitsAgilent5042-6454
Grand flacon en verre 27,25 x 70 mmFisherBrand03-339-22K
LyophiliseurLabconco7934021
Spatule à tête plate en acier inoxydable poliSpoonula ; FisherBrand14-375-10
LingettesKimberly-Clark34721
XBridge C18, 250x4,6 mm, 5 &mu ; M avec colonne de garde 4,6 x 20 mmWaters186003117, 186003064
Agilent série 1100 Système HPLCAgilent TechnologiesG1380-90000
1,7 ml Tube à centrifugerSorenson11700
Seringues en verre Hamilton, 5 ml, 50 et micro ; L et 250µ ; LHamilton81517, 80975, 81175
Pipettes PasteurFisherBrand13-678-20A
Ampoules de pipette Pasteur Sigma-AldrichZ111597Sonicator
Branson 1800 Nettoyeur
Centrifugeuse sous videLabconco Centrivap Système
l’acide Colonnes MicroSpin, C18 SiliceLe Groupe NidSEM SS18V
Bath à ultrasonsde concentrateur résistant à

Références

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