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Article de méthode

Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

12.6K vues

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DOI :

10.3791/57346

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12 septembre 2018

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1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences, University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Kentucky, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky

Dans cet article

Résumé

Capillaires cérébraux isolés du tissu de cerveau humain peuvent servir comme un modèle préclinique pour étudier la fonction de barrière dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous présentons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain frais.

Résumé

Comprendre la fonction de barrière hémato - encéphalique dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est essentielle pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques qui tiennent la promesse d’améliorer la livraison de drogue cerveau, améliorer la protection du cerveau et traiter le cerveau les troubles. Cependant, il est difficile d’étudier la fonction de barrière hématoméningée humaine. Ainsi, il y a un besoin crucial pour les modèles appropriés. À cet égard, capillaires de cerveau isolés à partir des tissus cérébraux humains représentent un outil unique pour étudier la fonction de barrière comme proche de la situation humaine in vivo que possible. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du tissu de cerveau humain à un rendement élevé et avec une pureté et une qualité constante. Capillaires sont isolés du tissu de cerveau humain frais utilisant la filtration, centrifugation de gradient de densité et homogénéisation mécanique. Après l’isolement, les capillaires du cerveau humain peuvent être utilisés pour diverses applications, notamment les tests de fuite, l’imagerie de cellules vivantes et analyses immunitaire pour étudier l’expression des protéines et la fonction, l’activité enzymatique ou signalisation intracellulaire. Cerveau humain isolé capillaires sont un modèle unique d’élucider la régulation de la fonction de barrière hématoméningée humaine. Ce modèle peut donner un aperçu de la pathogenèse du système nerveux central (SNC), qui contribuera à l’élaboration de stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles du SNC.

Introduction

La barrière hémato - encéphalique est une interface étroitement contrôlée entre le sang et le cerveau qui détermine ce qui se passe dans et sort du cerveau. Anatomiquement, cellules endothéliales composent la barrière hémato - encéphalique et forment un réseau capillaire complexe et continu. Physiologiquement, ce réseau capillaire alimente le cerveau en oxygène et en nutriments tout en simultanément élimination du dioxyde de carbone et les déchets métaboliques. Ce qui est important, la preuve étaye que les modifications apportées à la barrière contribuent à nombreuses pathologies comme la maladie d’Alzheimer, l’épilepsie et AVC1,2,3,4,5 , 6 , 7. cerveau cellules endothéliales servent également un obstacle au traitement en bloquant l’absorption de drogues dans le cerveau, par exemple., chimiothérapie du glioblastome multiforme suite tumeur résection8,9, 10. À cet égard, les capillaires du cerveau humain isolé représentent un modèle de barrière hémato - encéphalique unique ex vivo qui ressemble étroitement à barrière propriétés in vivo, qui permet l’étude de la fonction de barrière et de dysfonctionnement en santé et la maladie. Dans cet article, nous fournissons un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du cerveau humain à une qualité constante capillaire et le rendement afin d’étudier la barrière hémato - encéphalique.

En 1969, Siakotos et al. 11 ont été le premier à signaler l’isolement des capillaires de cerveau du tissu de cerveau bovines et humaines utilisant la densité gradient centrifugation et verre perle colonne séparation. Plus tard, Goldstein et al. 12 ce procédé amélioré en ajoutant plusieurs étapes de filtration pour diminuer la quantité de tissu nécessaire pour étudier les capillaires de cerveau isolées de rats, tout en maintenant l’activité métabolique du transport du glucose. Depuis lors, les chercheurs optimisé la technique d’isolation capillaire maintes fois, amélioration du procédé et cerveau modèle capillaire avec chaque itération13,14,15. Par exemple, airelles et al. 16 isolé bovines capillaires à l’aide de la digestion enzymatique et non homogénéisation mécanique et puis par la suite passé une suspension capillaire à travers un filtre à tamis 210 µm et une colonne de perle de verre. Ces modifications amélioré la tache d’exclusion bleu trypan des capillaires cérébraux isolés et ainsi, augmenter la viabilité des cellules endothéliales. Dans les années 1990, Dallaire et al. 17 isolées des bovins et rat des capillaires qui étaient claires de contamination neuronale et maintient l’activité métabolique des γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase) et la phosphatase alcaline. En 2000, Miller et al. 18, utilisé isolé du rat et des capillaires de cerveau porcin en combinaison avec la microscopie confocale à montrer l’accumulation des substrats de transport dans la lumière des capillaires. Par la suite, notre laboratoire a continué d’optimiser la procédure d’isolement capillaire de cerveau et nous avons établi des essais de transport afin de déterminer la P-glycoprotéine (P-gp)19,20,21, le cancer du sein résistance à la protéine (BCRP)22,23et multirésistance protéine 2 (Mrp2) activité de transport de24 . En 2004, nous avons publié deux rapports où nous avons utilisé des capillaires de cerveau de rat isolé pour enquêter sur les différentes voies de signalisation. Hartz et al. 21, nous avons trouvé que le peptide de l’endothéline-1 rapidement et de façon réversible réduit fonction transport P-gp dans les capillaires de cerveau en agissant par l’intermédiaire du récepteur de l’endothéline récepteur B (ETB), l’oxyde nitrique synthase (NOS) et protéine kinase C (PKC). Dans Bauer et al. 19, nous avons démontré l’expression du récepteur récepteur nucléaire pregnane X (PXR) et montre PXR-modulation de la P-gp expression et transport fonction dans les capillaires du cerveau. Dans des expériences avec des souris transgéniques de PXR humanisés, nous avons élargi cette ligne de recherche et montré in vivo de serrage de la barrière de ses P-gp et hPXR activation25. En 2010, Hartz et al. 26 a utilisé cette méthode pour restaurer l’expression des protéines P-gp et transporter l’activité chez les souris de protéine (hAPP) précurseur de l’amyloïde humain transgénique qui surexpriment hAPP. En outre, rétablir la P-gp dans hAPP souris réduit significativement la bêta-amyloïde (Aß)40et taux bêta-amyloïdes dans le cerveau42.

En plus d’étudier les voies de signalisation, les capillaires cérébraux isolés peuvent être utilisés pour déterminer les changements dans la perméabilité capillaire que nous appelons une fuite capillaire. En particulier, le test de fuite de Texas Red est utilisé pour évaluer la fuite du colorant fluorescent Texas rouge de la lumière capillaire dans le temps et ces données sont ensuite utilisées pour analyser le taux de fuite. Les taux de fuite capillaire accrue par rapport à celles des capillaires de contrôle indiquent des changements dans l’intégrité physique de la barrière hémato - encéphalique2. C’est précieux parce qu’il y a de nombreux états pathologiques liés à la rupture de la barrière, par exemple., épilepsie, sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer et traumatisme cérébral lésion27,28,29, 30. Autres groupes ont également utilisé des capillaires isolées pour discerner les voies de signalisation qui régulent l’expression de la protéine et l’activité de transport des protéines31,32,33,34, 35,36,37. Enfin, nous avons continué à optimiser cette méthode pour l’isolement des capillaires du cerveau humain et, récemment, nous avons montré expression accrue de la P-gp à l’humaine barrière hémato - encéphalique chez les patients atteints d’épilepsie par rapport aux individus de témoin sans saisie38 . Pris ensemble, ces développements démontrent que les capillaires cérébraux isolés peuvent servir d’un modèle polyvalent pour étudier la fonction de barrière.

Divers in vivo, ex vivoet in vitro de barrière hémato - encéphalique modèles ont été utilisés en recherche fondamentale et de dépistage des drogues industrielle, principalement dans le but de tester des medicaments pour le cerveau39,,40,41 ,42,43,44. Outre isolés ex vivo le capillaires du cerveau, les modèles actuels de barrière hémato - encéphalique comprennent des modèles de in silico , in vitro culture cellulaire des cellules endothéliales des capillaires cérébraux isolés ou de lignées cellulaires immortalisées par divers espèces, la culture in vitro des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) qui se différencient en cellules endothéliales capillaires du cerveau et des modèles sur une puce microfluidique.

In silico modèles sont plus couramment utilisés dans le développement de médicaments pour la sélection des candidats-médicaments basés sur prédite d’absorption, distribution, métabolisme et excrétion (ADME) Propriétés. Méthodes telles que les modèles de relation (QSPR) quantitative structure-propriété et quantitative structure-activité (RQSA) sont des méthodes populaires utilisés dans le criblage à haut débit des bibliothèques pour prédire la pénétration de cerveau de candidats-médicaments 45 , 46. ces modèles sont utiles aux molécules d’écran des propriétés de barrière de la pénétration.

Betz et al. 47 a créé monocouches de cellules endothéliales des capillaires cerveau cultivé comme un système de modèle in vitro barrière hémato - encéphalique. In vitro cell cultures de modèles à l’aide de tissu frais ou lignées de cellules endothéliales immortalisées comme les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébrale humaine (hCMECs) peuvent être un autre outil de criblage à haut débit pour la pénétration du cerveau ou des études mécanistes. Cependant, les modèles de culture de cellules endothéliales capillaires cerveau n’ont pas la contrainte de cisaillement physiologique du débit sanguin à l’intérieur de la lumière capillaire, sont limitées à une complexité biologique dans l’ensemble et subissent des changements dans l’expression et la localisation des composants de la barrière importante comme les protéines des jonctions serrées, ion, les transporteurs, les enzymes et les récepteurs de surface de canaux48,49,50. À l’inverse, monocouches endothéliales dérivé de hPSCs, présenter une perméabilité de saccharose faible par rapport aux cultures hCMEC/D3 et contenir l’expression polarisée de certains transporteurs de barrière hémato - encéphalique, molécules d’adhérence et de jonctions serrées51, 52. Cependant, ces cellules sont également sous réserve de modification des propriétés dans la culture et le système doit être validé pour sa récapitulation de in vivo de propriétés de barrière52.

Nouvelles tendances dans la recherche de la barrière hémato - encéphalique incluent utilisant des systèmes de culture de tissu 3D pour créer artificielles capillaires, utilisant la technologie de l’orgue-on-chip pour générer des dispositifs microfluidiques, ou utilisant les fibres creuses technologie53, 54 , 55. les capillaires artificiels, cependant, ont significativement plus grands diamètres (100 – 200 µm) que des capillaires de cerveau (3 – 7 µm). Par conséquent, les forces de cisaillement l’in vitro ne ressemblent pas entièrement à la situation in vivo . Ceci est abordé dans la microfluidique « blood-brain-barrier-on-a-chip », où les membranes artificielles forme « sang » et le « cerveau » compartiments et fluides sont pompés grâce à ces dispositifs de génération de forces de cisaillement microfluidique. De même, des cultures de cellules endothéliales dans différentes combinaisons avec les astrocytes et les cellules musculaires lisses vasculaires ont également été utilisés avec la technologie de fibres creuses pour recréer les paramètres rhéologiques présents sous in vivo des conditions56 , 57 , 58. Toutefois, on ignore comment ce modèle reflète les autres propriétés de la barrière hémato - encéphalique, tels que le transport, le métabolisme, de signalisation et d’autres. Ces modèles capillaire et puce artificiels ne conviennent pas pour le criblage à haut débit des médicaments, mais les cellules utilisées pour générer ces modèles sont également sujettes à modification durant la culture.

Tranches de cerveau gelé et fixe ou cerveau primitif des cultures de cellules endothéliales capillaires sont des modèles supplémentaires qui peuvent être utilisé pourétudier la microcirculation humaine5,59,60,61. Par exemple, immunohistochimie des tissus cérébraux fixe est utilisée pour déterminer la localisation des protéines et expression en bonne santé par rapport aux tissus malades.

En plus de modèles in vitro et de tranches de tissus capillaires du cerveau décrit ci-dessus, fraîchement isolées peuvent être utilisés pour étudier la fonction de barrière hémato - encéphalique. Limites de ce modèle capillaire isolé comprennent la difficulté pour obtenir des tissus du cerveau humain frais, absence d’astrocytes et les neurones et un processus relativement long isolement. Un avantage du modèle capillaires cérébraux isolés est que ce modèle ressemble beaucoup à la situation in vivo et, par conséquent, peut être utilisé pour caractériser la dysfonction et la fonction de barrière. Ce qui est important, il peut être également utilisé de discerner les mécanismes de signalisation à l’aide d’une multitude de tests et techniques moléculaires3,19,62,63.

Notre laboratoire a accès à ces deux tissus de cerveau humain frais et surgelés à travers le centre de Sanders-Brown sur le vieillissement (CISR #B15-2602-M)64. Dans ce contexte, les autopsies suivent un protocole standard, les cerveaux est obtenus en < 4 h et toutes les procédures sont conformes aux NIH recueillis de pratiques recommandées,65. Compte tenu de cet accès unique aux tissus du cerveau humain, nous avons établi et optimisé un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain qui se traduit par un rendement élevé des capillaires de cerveau humain intact et viables. Deux points de terminaison communes d’intérêt sont à déterminer l’expression de la protéine et l’activité. À cet égard, nous et autres avons établi divers tests qui peuvent être utilisés avec les capillaires cérébraux isolés pour étudier l’expression des protéines et des niveaux d’activité. Ces essais incluent Éponger occidental, dosage Simple Western, immuno enzymatique (ELISA), chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR), PCR quantitative (qPCR), zymographie, tests d’activité de transport, et essais de fuite capillaire. Ces tests permettent aux chercheurs d’étudier des changements en fonction de la barrière dans des conditions pathologiques humaines, déterminer les voies qui régissent l’activité et l’expression de la protéine et identifier les cibles pharmacologiques pour le traitement de la barrière hémato - encéphalique associé maladies.

Prises ensemble, fraîchement capillaires cérébraux isolés peuvent servir de modèle robuste et reproductible de la barrière hémato - encéphalique. Surtout, ce modèle peut être associé à plusieurs différents dosages pour déterminer un large éventail de points de terminaison pour étudier la fonction de barrière.

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Protocole

Les informations ci-dessous repose sur la sécurité actuelle et des normes de réglementation à l’Université du Kentucky, Lexington, KY, é.-u.. Par mesure de précaution, se référer au programme de biosécurité de l’institution et les plus récents règlements et recommandations avant de travailler avec les tissus humains.

ATTENTION : Le tissu humain peut être une source de pathogènes à diffusion hématogène, y compris le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), virus de l’hépatite B (VHB), virus de l’hépatite C (VHC) et d’autres. Travailler avec des tissus humains pose le risque d’infection par des pathogènes à diffusion hématogène. Par conséquent, certaines considérations réglementaires et de sécurité sont indispensables lorsque vous travaillez avec des tissus humains pour protéger le personnel de laboratoire. L’utilisation de tissus humains aux Etats-Unis exige un laboratoire de niveau 2 de biosécurité ainsi que de mesures de sécurité et de formation conformément aux NIH Section IV-B-7, Loi OSHA de 1970 Clause 5(a)(1) et programme de biosécurité institutionnels de l’utilisateur. En général, approbation Comité institutionnel de biosécurité et/ou Institutional Review Board doit être obtenue avant d’effectuer toute recherche impliquant le matériel humain (tissus, fluides corporels). La formation est nécessaire pour tout le personnel travaillant avec des matériaux humains et comprend la formation de sécurité de laboratoire de base, par exemple, chimique hygiène et sécurité en laboratoire, ainsi qu’une formation spécifique sur la sécurité biologique, déchets dangereux et l’homme agents pathogènes transmissibles par le sang. Tout le personnel travaillant avec des matériaux humains est fortement recommandé afin d’obtenir des vaccins contre l’hépatite B, avant de travailler avec le matériel humain. Le personnel est tenu de porter un équipement de protection individuelle spécifique tout en travaillant avec le matériel humain, par exemple., une blouse collerette et un visage de bouclier et porter des gants en tout temps. Tous les travaux dans une placard de biosécurité (classe 2). Tout le matériel qui vient en contact avec le matériel humain et tout déchet de matériel humain est géré adéquatement pour éviter la contamination ou infection du personnel. Tous les équipements et les surfaces sont nettoyées avec 10 % d’éthanol eau de Javel et 75 % après chaque procédure impliquant le matériel humain. Un déversement avec matériel humain doit être immédiatement nettoyé. Verrerie est stérilisé après chaque utilisation. Déchets, y compris les interprétations des tissus humains, sont recueillie dans un sac à déchets étiquetés biohazard et stérilisés à l’autoclave. Objets pointus ou tranchants sont recueillies dans un récipient et fuite-résistant à la perforation étiqueté comme biologiques dangereuses. Tous les déchets de matériel humain respect des normes de sécurité biologique de l’institution.

NOTE : Notre laboratoire obtient des échantillons frais de cortex frontal de personnes décédées à travers le centre de Sanders-Brown sur le vieillissement (CISR #B15-2602-M). Critères d’inclusion sont : inscription à l’étude de cohorte longitudinale autopsie UK-ADC et un intervalle Post-Mortem (PMI) ≤4 h64. Autopsies suivent un protocole standard et toutes les procédures sont conformes aux NIH recueillis de pratiques recommandées,65. Un PMI court de moins de 4 h est de la plus haute importance pour assurer la viabilité capillaire après l’isolement. Les tissus frais et congelés peuvent être utilisés. Si le gel est nécessaire, tissus cérébraux humains fraîchement obtenu devraient être choc congelés dans l’azote liquide et conservés à-80 ° C. Tissu fraîche ou décongelé devrait être stocké dans le tampon d’isolement (voir ci-dessous) et traité rapidement. Nous trouvons que 10 g de tissu humain frais fournit environ 100 mg des capillaires de cerveau (poids humide).

1. le programme d’installation

  1. Préparation du tampon
    Remarque : Le volume de tampon nécessaire dépend de la quantité de tissu. Tous les volumes de mémoire tampon dans le protocole suivant sont basés sur 10 g de tissus de cortex cérébraux humains.
    1. L isolement tampon : Utiliser 1,5 L de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD ; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) et compléter avec le D-glucose (1,35 g 5 mM ) et pyruvate de sodium 1 mM (0,165 g). Après avoir ajouté du glucose et du pyruvate, ajuster le pH 7,4 avec l’hydroxyde de sodium. Laisser refroidir et stocker le tampon à 4 ° C avant de l’utiliser.
    2. L’albumine sérique bovine (BSA) : Ajouter 10 g de poudre de BSA à 1 L de tampon d’isolement à une concentration finale de BSA de 1 %. Remuez lentement pour éviter les bulles, ajuster le pH 7.4 et conserver à 4 ° C durant la nuit. Immédiatement avant utilisation, remuer doucement ; éviter la formation de bulles pour éviter la dénaturation de l’albumine.
    3. milieu de gradient de densité : peser 18 g de milieu de gradient de densité dans une bouteille en verre et ajouter un magnétique. Ajouter 60 mL de tampon d’isolement et agiter vigoureusement pendant 5 min jusqu'à ce que toute la poudre est suspendue. Magasin pendant la nuit à 4 ° C pour permettre le milieu de gradient de densité à dissoudre. Remuez pendant 10 min juste avant utilisation.
    4. Stocker tous les tampons à 4 ° C ; garder tous les outils et les tampons sur la glace lors de la procédure d’isolement complet. Mélanger tous les tampons avant utilisation.
  2. Montage expérimental
    1. Monter le pilon de la meuleuse de tissu Potter-Elvehjem sur l’agitateur électronique généraux. Placez le moulin de tissu de Potter-Elvehjem et l’homogénéisateur Dounce avec pilon sur la glace sous le capot. Préparer une maille de filtre de 300 µm (5 x 5 cm2), pliez-le à un cône et insérer et attachez-le à un 50 mL tube Falcon avec du ruban adhésif (Figure 1 a).
    2. Placez les bagues d’étanchéité raccordement et de filtres de souche de cellules (taille des pores : 30 µm) sur tubes Falcon de 50 mL. Préparer des sacs de déchets biologiques. Placer les équipements requis dans la prévention des risques biotechnologiques armoire (voir Table des matières).

2. préparation des échantillons de cerveau

Remarque : La Figure 1 a montre le diagramme de flux de travail de la technique d’isolation complet décrit ci-dessous. Le tissu de cerveau humain peut provenir de n’importe quelle partie du cortex et peut être utilisé frais ou congelés. Tissu cérébral congelés peut être décongelé à température ambiante (pas de mémoire tampon ; ~ 30 min pour 10 g). Pour obtenir des résultats comparables, le tissu cérébral devrait provenir de la même région du cerveau pour chaque expérience. Ce protocole est optimisé pour les frais (PMI < 4 h) cortex cérébral humain qui n’a pas été congelé.

  1. Préparation du tissu de cerveau humain : documenter le poids du tissu cérébral. Tous les numéros dans le protocole suivant sont appropriés pour 10 g de tissu cérébral humain frais. Placer le tissu cérébral dans une boîte de Pétri de 100 mm. Enlevez soigneusement toutes les méninges avec une pince. Utiliser un scalpel pour couper la matière blanche.
  2. Hacher du tissu cérébral humain : soigneusement découpé le tissu cérébral et il mâche avec un scalpel. Hacher finement pendant environ 5 min (morceaux de 2 à 3 mm). Transférer le tissu cérébral à la meuleuse de tissu de Potter-Elvehjem. Ajouter 30 mL de tampon de l’isolement.
    Remarque : Les morceaux de tissus hachées sont difficiles à voir car le tissu cérébral se transforme en bouillie par le processus de hachage.

3. homogénéisation

  1. Moulin de tissu Potter-Elvehjem (clairance : 150 – 230 µm) : homogénéiser chaque échantillon avec 100 coups à une vitesse d’homogénéiseur de 50 tr/min. Le document le temps chaque 25 coups et le temps total nécessaire pour 100 coups. Voir le tableau 1 pour un protocole proposé homogénéisation ; la durée totale de 10 g de cortex frontal humain l’homogénéisation est d’environ 22 min. Ne remuez pas dans l’air pour éviter les bulles.
  2. Dounce homogénéisateur (clairance : 80 – 130 µm) : transférer l’homogénat dans un homogénéisateur Dounce sur glace. Homogénéiser la suspension avec 20 coups (~ 6 s/course, total d’environ 2 min). Éviter les bulles.

4. centrifugation

  1. Distribuer l’homogénat de cerveau également dans quatre tubes de centrifugation de 50 mL et le volume total de l’homogénat de document. Distribuer 50 mL de tampon de gradient de densité dans les tubes de centrifugation (12,5 mL par tube). 10 mL de tampon d’isolement permet de rincer le pilon et l’homogénéisateur et distribuer dans les quatre tubes de centrifugation (~2.5 mL par tube).
  2. Bien fermer les tubes de centrifugeuse avec bouchons. Mélanger l’homogénat, milieu de gradient de densité et tampon en secouant vigoureusement les tubes. Centrifuger à 5 800 x g pendant 15 min à 4 ° C (rotor angle fixe) ; Sélectionnez une vitesse de décélération moyenne pour garder le culot au tube. Jeter le surnageant et remettre chaque culot en suspension dans 2 mL de 1 % de BSA.

5. filtration

NOTE : Pour séparer les capillaires de globules rouges et autres débris cellulaires, plusieurs étapes de filtration sont nécessaires.

  1. 300 µm maille : après re-suspension du culot, filtrer la suspension à travers les mailles de 300 µm. Capillaires sont filtrés à travers les mailles, considérant que les navires plus grands et plus gros débris de cerveau demeurent sur le maillage. Laver soigneusement la maille avec jusqu'à 50 mL, de 1 % de BSA. Jeter le filet.
    Remarque : Cette étape de filtration efface la suspension capillaire de plus gros navires ou morceaux de débris de cerveau.
  2. Filtre de 30 µM cellule souche
    Remarque : Cette étape de filtration sépare les capillaires des globules rouges et autres débris de cerveau.
    1. Distribuer le filtrat capillaire de l’étape 6.1 sur les filtres de déformation de cellule cinq 30 µm (environ 10 mL de filtrat capillaire par filtre de cellule souche). Capillaires sont freinés par ce filtre, tandis que les globules rouges monocellules et autres débris de petit cerveau passent par le filtre et sont rassemblés dans le filtrat.
    2. Lavez chaque filtre avec 25 mL de 1 % de BSA. Par la suite, tous les filtrats Napper le sixième filtre pour augmenter le rendement. Lavez chaque filtre avec 50 mL de BSA 1 % ; conserver la cellule souche filtres avec contenant les capillaires et d’ignorer le filtrat.

6. capillaire Collection

  1. Renversez les filtres et laver les capillaires avec 50 mL de BSA 1 % pour chaque filtre en tubes de 50 mL. Doucement, appliquer une pression avec la pointe de la pipette d’une pipette de 5 mL et déplacez-le dans le filtre pour éliminer les capillaires du cerveau.
  2. Assurez-vous de laver tous les capillaires de cerveau, en particulier de la jante du filtre. Éviter les bulles car cela complique le processus de filtration et augmente les risques de perte capillaire.

7. laver

  1. Après avoir recueilli les capillaires, centrifuger les échantillons à 1 500 x g pendant 3 min à 4 ° C (balancement seau rotor). Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans environ 3 mL de tampon d’isolement. Combiner tous les granulés resuspendues dans un échantillon dans un tube conique de 15 mL et remplissez-le avec le tampon de l’isolement. Centrifuger à nouveau à 1 500 g pendant 3 min à 4 ° C et laver deux fois plus.
  2. Le document la pureté capillaire avec un microscope (grossissement de X 100) et l’appareil photo (Figure 1 b).
    Remarque : Le rendement de capillaire de cerveau de 10 g de tissus cérébraux humains est habituellement environ 100 mg. Les capillaires cérébraux isolés peuvent maintenant être utilisés pour des expériences, transformés (p. ex.., lysat, isolation membrane), ou être congelés flash et stockées à-80 ° C dans des cryotubes pour un minimum de 6 à 12 mois (éviter de multiples cycles de gel-dégel).

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Résultats

L’isolement des tissus cérébraux humains produire une suspension enrichie dans des capillaires de cerveau humain (Figure 1 b) avec de petites quantités de gros navires, globules rouges, autres cellules individuelles et quelques débris cellulaires. Certains capillaires sont ramifiés, et, dans certains cas, les globules rouges sont pris au piège dans les lumières du capillaires. Le capillaire typique a un 3 – 7 µm de diamètre et est environ 100 à 200 µm long av...

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Discussion

Le présent protocole décrit l’isolement des capillaires de cerveau humain intact et viable de tissus frais. Dans cette section, nous discutons en détail de ce qui suit : 1) les modifications au protocole 2) dépannage des messages d’erreur, 3) les limites de la technique, 4) l’importance du modèle en ce qui concerne l’existant et des modèles alternatifs de barrière hémato - encéphalique, et 5). applications potentielles pour les capillaires du cerveau humain isolé.

Le protocole décrit ici est o...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercier et remercier Dr Peter Nelson et Sonya Anderson à la Banque de tissus du cerveau UK-ADC permettant de cerveau humain tous les échantillons de tissus (numéro de licence de NIH : P30 AG028383 du National Institute on Aging). Nous remercions Matt Hazzard et Tom Dolan, Services informatiques, technologie universitaire et Engagement de faculté, Université du Kentucky pour assistance graphique. Ce projet a été soutenu par grant 1R01NS079507 numéro du National Institute of Neurological Disorders et accidents vasculaires cérébraux (à B.B.) et par grant 1R01AG039621 numéro du National Institute on Aging (à A.M.S.H).. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la National Institute of Neurological Disorders et accident vasculaire cérébral ou l’Institut National sur le vieillissement. Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

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Matériaux

Chemicals
Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équipement de protection individuelle (EPI)
Diamond Grip Plus, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, USA32916-636EPI
Blouses de protection jetablesVWR, Radnor, PA, USA470146-214EPI ; en raison de la nature du matériel d’origine humaine, l’utilisation d’une blouse de laboratoire jetable est recommandée
Écran facial, jetableThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis19460102EPI ; en raison de la nature du matériel d’origine humaine, l’utilisation d’un écran facial jetable est recommandée
Matériaux
Clavies Sacs autoclave haute température 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis01-815-6
Versi Papier d’établi sec 18 » x 20 »Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA14-206-32pour couvrir les zones de travail
VWR Sharps Container SystemsThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75800-272pour scalpels usagés
Bleach 8.2 % Clorox Germicide 64 oz.Centre d’approvisionnement du Royaume-Uni, Lexington, KY, États-Unis323775
Equipment
4 ° ; C RéfrigérateurThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, États-Unis13-986-148
Accume BASIC AB15 PH-mètreThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, États-UnisAB15
Heidolph RZR 2102 ControlHeidolph, Elk Grove Village, IL,États-Unis 501-21024-01-3
Centrifugeuse Sorvall LEGEND XTRThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, États-Unis75004521
Microscope de dissection Leica L2Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, États-Unisutilisé pour enlever les méninges
POLYTRON PT2500 HomogénéisateurKinematica AG, Lucerne, Suisse9158168
Échelle P-403Denver Instrument, Bohemia, NY, États-Unis0191392
Mini Stir standardThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, États-Unis1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, USA11-670-4Cutilisé pour congeler le tissu ?
Balance analytique Voyager ProOHAUS, Parsippany, NJ, États-UnisVP214CN
ZEISS Axiovert MicrocopeCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, États-Unisutilisé pour vérifier les capillaires isolés
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377823T1laver les capillaires filtre
Finnpipette II Pipette 100-1 000 & micro ; LThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377821T1réapprovisionner les granulés en BSA
Pipet BoyIntegra, Hudson, NH, USA739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/csVWR, Radnor, PA, USA21008-951
EISCO Scalpel BladesThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAS95938Chacher le tissu cérébral
PARAFILMVWR, Radnor, PA, USA52858-000pour couvrir le bécher et la fiole jaugée
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21-377-304pour laver les capillaires du filtre
Seringue de 60 mL avec Luer-LokThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USABD309653utilisé avec bague de connexion pour filtrer les capillaires
Scalpel Handle #4Fine Science Tools, Foster City, CA, USA10060-13utilisé pour hacher
Dumont Forceps #5Fine Science Tools, Foster City, CA, USA11251-10utilisé pour enlever les méninges
Potter-Elvehjem Tissue GrinderThomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA3431E25Volume de 50 ml, dégagement : 150-230 &mu ; m
Dounce HomogénéisateurVWR, Radnor PA USA62400-642Volume de 15 mL, dégagement : 80-130 &mu ; m
Spectra/Mesh Woven Filters (300 & micro ; m)Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA146424Utilisé pour filtrer la suspension capillaire afin d’éliminer les méninges qui peuvent être laissées
par les pluriStrainers (taille des pores : 30 & micro ; m)pluriSelect Life Science, Leipzig, Allemagne43-50030-03
Anneau de connexionpluriSelect Life Science, Leipzig, Allemagne41-50000-03réutiliser plusieurs fois
1 L Fiolepour la préparation du tampon d’isolement
1 L Bécherpour la préparation de la barre
d’agitation BSA à 1 %pour la préparation de 1 % de BSA et de Ficoll® ;
Schott Bouteille (60 mL)pour la préparation de Ficoll® ; Seau de Pétri
Icegarder tout froid
Louis, MO, États-UnisA9647-500gpréparer en DPBS avec Ca2+ & Mg2+ la veille. Évitez les bulles pendant la préparation. Conserver au réfrigérateur. Remuez lentement pendant 10 min avant utilisation.
DPBS avec Ca2+ & Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - fait partie du tampon d’isolement
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF4375Une mesure précise est importante ici. Peser en bouteille avec agitateur. Agitez vigoureusement après avoir ajouté DPBS. Conserver au réfrigérateur O/N. Le temps sera dégagé dans la matinée. Remuez doucement pendant 10-15 min avant utilisation. Garder sur la glace jusqu’à utilisation.
Glucose (D-(+) Dextrose)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAG7528Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration : 5 mM
solution étalon d’hydroxyde de sodiumSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA71474pour ajuster le pH du DPBS
Pyruvate de sodiumSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP2256Concentration : 1 mM
Gants en latex de sécurité jaugée pour Boîte de Pétri de 100 mm pour le hachage du tissu cérébral Racleur de cellules de culture tissulaire VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 pour éliminer le surnageant après centrifugationBSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. de

Références

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer's disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer's disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805(2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40(2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149(2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18(2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer's disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer's subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709(2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis - Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -C., Lee, T. -H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).

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