Article de méthode

La co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion de façon efficace dans les plantes

DOI :

10.3791/57354

⸱

1 juillet 2018

 ,  , 
1College of Life Sciences, South China Agricultural University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons développé une nouvelle méthode pour exprimer conjointement plusieurs protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes à surmonter les difficultés des méthodes conventionnelles. Il prend avantage d’utiliser un plasmide d’expression unique qui contient plusieurs protéines fonctionnellement indépendant exprimant des cassettes pour atteindre la co-expression de protéine.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Informations sur la localization(s) subcellulaire spatio-temporelle d’une protéine sont essentielles de comprendre ses fonctions physiologiques dans les cellules. Protéines fluorescentes et génération des protéines de fusion fluorescents ont sauvagement servis comme un outil efficace pour visualiser directement la localisation des protéines et la dynamique dans les cellules. Il est particulièrement utile pour les comparer avec des marqueurs de l’organite bien connu après la co-expression avec la protéine d’intérêt. Néanmoins, les approches classiques pour la co-expression de protéines chez les plantes impliquent généralement plusieurs plasmides d’expression indépendante et par conséquent ont des inconvénients qui incluent la co-expression de faible efficacité, variation du niveau de l’expression et grand temps dépenses en traversant et le dépistage génétiques. Dans cette étude, nous décrivons une méthode nouvelle et robuste pour la co-expression de multiples protéines fluorescentes chimériques dans les plantes. Il surmonte les limites des méthodes courantes à l’aide d’un vecteur d’expression unique qui se compose de plusieurs cassettes exprimant semi-indépendante. Chaque cassette d’expression de protéine contient ses propres éléments d’expression de protéine fonctionnelle, et par conséquent il peut être souple ajusté pour répondre à la demande de l’expression diversifiée. En outre, c’est facile et pratique d’effectuer l’assemblage et manipulation de l’ADN des fragments dans le plasmide d’expression à l’aide d’une réaction en une seule étape optimisé sans digestion supplémentaire et étapes de ligature. En outre, il est entièrement compatible avec les technologies actuelles de bio-imagerie des protéines fluorescentes dérivées et applications, telles que la frette et BiFC. Comme une validation de la méthode, nous avons utilisé ce nouveau système récepteur tri vacuolaire express co fluorescent fusionnés et protéines membranaires du porteur. Les résultats montrent que leurs localisations subcellulaires perspective sont les mêmes que dans les études antérieures par expression transitoire et transformation génétique chez les plantes.

Introduction

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Protéines chimériques fluorescentes fusion ont été considérés comme des outils utiles pour étudier la dynamique intracellulaire et localisation subcellulaire et mieux comprendre leurs fonctions physiologiques et le travail des mécanismes1,2, 3 , 4. il est particulièrement bénéfique aux protéines de journaliste bien connu organite express Co avec la protéine en question pour mieux illustrer son raisonnement spatio-temporel, la distribution et l’ou les fonctions au sein du système endomembranaire dans les cellules4 , 5 , 6 , 7 , 8.

Une protéine de fusion fluorescent chimérique peut être exprimée dans les plantes par expression transitoire et de la transformation génétique stable, qui ont leurs avantages respectifs et les limites de10,9,11. Expression transitoire d’une protéine est une approche pratique qui comprend biolistique bombardement-, polyéthylène glycol (PEG)-, ou expression transitoire ADN induite par électroporation de protoplastes et Agrobacterium-médiée par infiltration de la feuille dans cellules végétales intactes, comme illustré à la Figure 1 a, B12,13,14,15,16. Toutefois, la co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes fusion dans une cellule végétale unique exige un mélange de plusieurs plasmides d’expression indépendante. Ainsi, les inconvénients d’employer plusieurs plasmides pour la co-expression de protéines chez les plantes sont plus faibles en raison de la chance considérablement réduite de plusieurs plasmides entrer simultanément dans les mêmes cellules par rapport à un plasmide, la co-expression et le variations des niveaux d’expression de protéine causées par le volume de chaque types de plasmide transféré dans la cellule17,18incontrôlable aléatoire. En outre, il est techniquement difficile d’introduire plusieurs plasmides d’expression indépendante dans un seul Agrobacterium pour la protéine co-expression9,10,11. Par conséquent, Agrobacterium-médiation protein expression transitoire par infiltration de tabac laisse est seulement capable d’exprimer un plasmide simultanément, comme illustré dans la Figure 1 b. En revanche, la génération de plantes transgéniques exprimant des protéines de fusion fluorescent est habituellement obtenue par Agrobacterium qui transporte un vecteur de transformation binaire. Toutefois, le vecteur binaire qui intervient dans le transfert de gène et l’insertion dans le génome de la plante n’est capable d’exprimer une seule fusion fluorescent protéine (Figure 1 b)9,10,12. Générant une plante transgénique exprimant simultanément plusieurs protéines fluorescentes chimériques nécessite plusieurs cycles de croisement génétique et le dépistage, qui peut prendre des mois ans selon le nombre de gènes d’être exprimée conjointement.

L’emploi de qu'un vecteur d’expression unique pour la co-expression de multiples protéines végétales a été signalé par plusieurs précédentes études19,20,21. Toutefois, plusieurs cycles de digestion enzymatique et ligature d’ADN des molécules d’ADN et des vecteurs de la colonne vertébrale sont habituellement exigées pour la génération du plasmide final pour la co-expression de protéine ou une surexpression. Ici, nous avons développé une méthode nouvelle et robuste permettant d’exprimer conjointement plusieurs protéines fluorescentes chimériques dans les plantes. C’est une méthode très efficace et pratique qui permet d’obtenir plusieurs co-expression de protéines dans les végétaux destinés tant l’expression transitoire et transformation stable de manière séculaire. Il emploie un vecteur unique qui contient plusieurs cassettes d’expression de protéines fonctionnellement indépendants pour la co-expression de protéine et ainsi permet de surmonter les inconvénients des méthodes conventionnelles. En outre, c’est un système très polyvalent dans laquelle l’ADN les manipulations et l’Assemblée sont atteints par une réaction en une étape simple optimisée sans étapes additionnelles de digestion de l’ADN et la ligature. Le principe de fonctionnement est illustré à la Figure 2. En outre, il est entièrement compatible avec les approches cellulaires, moléculaires et biochimiques actuelles qui reposent sur des protéines de fusion fluorescent chimérique.

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Protocole

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1. stratégie de conception amorce et Amplification de l’ADN

  1. Concevoir les amorces pour le clonage de fragments d’ADN. Les amorces comprennent 20 séquences de liaison spécifique de gène de bp et de 20 à 25 bp 5'-porte-à-faux séquences terminales, qui sont la séquence complémentaire qui se chevauchent des molécules d’ADN adjacentes (voir le tableau 1 par exemple).
    NOTE : L’assemblage subséquent de chaque ADN fragments, assemblage des cassettes d’expression de protéines différentes, et l’intégration avec le vecteur de l’expression finale tous dépendent de la reconnaissance des séquences adjacentes qui se chevauchent.
  2. Amplifier les fragments d’ADN, y compris le promoteur, reporter fluorescent, gène cible et terminator, qui sont nécessaires pour la construction des cassettes d’expression de protéine semi-indépendant par des réactions de PCR standards avec leurs correspondants des amorces et haute polymérase de fidélité.
    Remarque : Les modèles utilisés dans cette étude pour l’amplification de l’ADN sont dérivés de précédentes études15,22,23. La température de recuit et de prorogation de délai des réactions PCR sont ABC et gènes dépendants.

2. DNA Fragment assemblage et Construction des Cassettes d’Expression de protéine

  1. Analyser la qualité des première ronde des produits PCR par électrophorèse d’ADN et quantifier par le spectrophotomètre. Vérifier si la dégradation de l’ADN et de la contamination ont été de 1 % gel d’agarose. Le OD260/OD280 des produits PCR doit être entre 1.6 et 1.8.
  2. Mélanger les différents fragments d’ADN (0,05 - 0,1 pmol pour chaque fragment) dans un nouveau tube PCR pour un volume final de 5 µL.
    Remarque : Des molécules d’ADN de mélange conçu pour la même cassette d’expression de protéine ensemble dans un tube PCR. Éviter le mélange des ADN de cassette d’expression différents ensemble, car il permettra de réduire l’efficacité de l’Assemblée d’ADN en raison du nombre croissant de molécules d’ADN qui doivent être liés.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
  3. Préparer 5 x ISO stock tampon : 500 mM Tris-HCl, pH 7.5 ; 50 mM MgCl2; 1 mM désoxyribonucléosides (dNTP) ; 50 mM dithiothréitol ; 25 % de polyéthylène glycol (PEG) 8000 ; et 5 mM nicotinamide adénine dinucléotide (NAD).
  4. Faire 1 mL 2 x mélange maître de 400 µL 5 x les stock tampon ISO, 7,5 unités de T5 exonucléase, 62,5 unités de haute fidélité ADN polymérase, 5 000 unités de la Taq polymérase (voir Table des matières), et double stérile distillée H2O.
    NOTE : Ceci est une adaptation d’études précédentes24,25,26; ces volumes doivent être optimisées.
  5. Aliquotes de 100 µL de 2 x mélange maître par tube et conserver à-20 ° C.
    ATTENTION : Fréquents de gel et de dégel du 2 mélange maître x peuvent entraîner une faible efficacité de l’Assemblée de l’ADN.
  6. Ajouter 15 µL du mélange maître de 2 x dans le mélange de l’ADN 5 µL et incuber à 50 ° C pendant 60 min.

3. construction du vecteur pour la co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion chez les plantes

  1. Amplifier la cassette d’expression de protéine semi-indépendant entière par une PCR de second tour avec le produit (0,5 - 1,0 µL) de la réaction de l’Assemblée isotherme de premier tour comme le modèle et les amorces ultrapériphériques (p. ex., 1-FP35S et 1-RNOS pour l’expression cassette 1).
    1. Utilisation 1 unité de haute fidélité polymérase dans un volume réactionnel de 50 µL suivie de 30 cycles (94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 2 min), suivie d’une extension finale à 68 ° C pendant 5 min.
  2. Linéariser la protéine finale expression épine dorsale vecteurs pUC18 et pCAMBIA1300, qui sont conçus pour l’expression transitoire de la protéine et de transformation génétique, respectivement, en ajoutant 4 unités Sma I dans un volume final de réaction 10 µL et incubation pour 1 - 2 h à 25 ° C. Inactiver les enzymes de restriction en incubation à 65 ° C pendant 20 min.
  3. Mélange équimolaires molécules d’ADN des cassettes d’expression de protéine et vecteur final linéarisé dans un volume de réaction finale de 5 µL. Ensuite, effectuer la recombinaison de l’ADN secondaires en mélangeant avec 15 µL 2 x tampon maître et incubation à 50 ° C pendant 60 min.
  4. Utiliser les produits finaux de la réaction de recombinaison isotherme de deuxième ronde pour transformer compétentes d' e. coli cellules (par exemple, DH5α) selon les procédures standard27. Vérifiez les colonies positives par séquençage de l’ADN et la PCR colonie. Extrait les plasmides positives de l' e. coli à l’aide d’un kit d’extraction de plasmide mini et conserver à-80 ° C.
    ATTENTION : Pour le stockage à long terme, plasmides dissoute dans un tampon TE ou double distillée H2O sont plus stables que les garde dans des souches d’e. coli .

4. biolistique-bombardement médiée par co-expression transitoire de plusieurs protéines chimériques fluorescentes Fusion chez les plantes

  1. Préparer du tabac BY-2 cellules en suspension et les jeunes plantes Arabidopsis bombardement.
    1. Culture BY-2 cellules dans un milieu de Murashige et Skoog (MS) par repiquage deux fois par semaine à 25 ° C dans un agitateur fixé à 130 tr/min. D collecter 30 mL 3 filtre cultivées BY-2 cellules sur un morceau de papier filtre stérilisés à l’autoclave de 70 mm via une pompe à vide en affectant à la pression de vide 40 mbar.
    2. Afin d’éviter que les cellules ne se dessèchent pas aux étapes suivantes, ajouter quelques gouttes de milieu de culture liquide de BY-2 cellules dans une boîte de Pétri avant de placer le papier filtre (étape suivante).
    3. Transférer le papier-filtre avec les cellules de BY-2 à ce sujet à une nouvelle boîte de Pétri (85 x 15 mm).
    4. Surface de stériliser les graines d' Arabidopsis thaliana (Col-0) au vortex un mélange avec de l’éthanol 70 % (v/v) contenant 0,05 % Tween 20 pendant 10 min.
    5. Tournez en bas les graines à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse supérieure à vitesse max pour 2 s, éliminer le surnageant et lavez les graines avec l’éthanol à 100 % une fois pendant 30 s. Pipette les graines sur un nouveau papier filtre stérile sous une hotte stérile. Ensuite, sécher les graines et les répartir sur plaques de gélose MS ½.
    6. Stocker les plaques à 4 ° C pendant 48 heures avant de les transférer dans une chambre de culture de plantes avec les paramètres suivants : 16 h de lumière 8 h d’obscurité avec 120 à 150 µm m-2 s-1 intensité, 22 ° C.
    7. Transférer 7 - jour vieilles centrales de l’échantillon dans un cercle de diamètre de 30 mm dans le centre d’une nouvelle plaque moyenne ½ MS pour accroître l’efficacité des bombardements.
      ATTENTION : Éviter le chevauchement des plantes en transférant et en les plaçant sur la nouvelle plaque de ½ MS.
    8. Ajouter quelques gouttes de ½ MS milieu liquide sur la surface des végétaux ou des tissus afin de préserver l’humidité et éviter de dessécher les plantes dehors aux étapes suivantes.
  2. Enrober les particules d’or avec l’ADN de plasmide.
    1. Solution avec des microporteurs or Vortex soigneusement, pendant 3 min. préparer un nouveau tube de 1,5 mL.
    2. Ajouter successivement les solutions suivantes dans le tube et le vortex : 25 µL (1,5 mg) or particules, vortex 10 s ; 10 µL de 25,46 mg/L la spermidine, vortex 10 s ; 5 µL d’ADN plasmidique 1µg/µL, vortex 3 min ; 25 µL de CaCl2 solution 277,5 mg/L, vortex 1 min.
      ATTENTION : Gardez l’agitation au cours de cette étape.
    3. Tournez en bas des microporteurs or en utilisant une centrifugeuse de paillasse supérieure à vitesse max pour 5 s et soigneusement la pipette sur le surnageant sans déranger le culot. Laver avec 200 µL d’éthanol absolu et Resuspendre le culot de vortex pour 5-10 s. vitesse de rotation vers le bas à la vitesse max pendant 5 s et supprimer l’éthanol.
    4. Remettre en suspension les particules d’or dans 18 µL d’éthanol absolu et suspension 6 aliquotes de particules µL au milieu de trois macrocarriers. Laissez-les sécher à l’air.
  3. Transférer ADN dans les plantes par bombardement par des particules.
    1. Définir le système de largage de particules comme suit : 1 100 lb/po2, 28 mm Hg de pression, distance d’écart de 1 cm et la distance de vol particule de 9 cm.
    2. Bombarder les cellules/plantes sur la gélose au moyen de trois fois à trois positions différentes et ensuite maintenir les cellules/plantes dans ignorance immédiatement après le bombardement.
      ATTENTION : Porter des lunettes de protection lorsque vous utilisez le système de largage de particules en raison de l’association des gaz à haute pression et de particules à grande vitesse avec le système.
  4. Gardez bombardés cellules/plantes dans l’obscurité dans la chambre de croissance végétale pour 6 à 72 heures avant l’observation des signaux fluorescents. La valeur de la chambre de croissance des végétaux à 24 h d’obscurité et de 22 ° C.
    ATTENTION : L’efficacité de l’expression et l’intensité du signal fluorescent sont promoteur - gène- et alimenté par la plante/tissu.

5. génération de Stable Arabidopsis transgénique exprimant conjointement plusieurs protéines fluorescentes chimériques par Agrobacterium-Mediated Transformation.

  1. Décongeler les cellules compétentes Agrobacterium (PMP90) sur la glace et attendre 30 min, puis ajouter 2 vecteur binaire µL (100-200 ng) (préparé ci-dessus) dans les cellules compétentes. Reposer le mélange sur la glace pendant 10 min.
  2. Transférer le mélange dans une cupule d’électroporation préalablement réfrigérées 0,1 cm. Insérez la cuve dans le système de l’électroporation et effectuer électroporation avec les paramètres suivants : 1.6 kV, 600 ohms, 25 µF.
  3. Ajouter 1 mL de milieu liquide SOC dans la cupule immédiatement après l’électroporation, Pipetter les cellules dans un nouveau tube de 1,5 mL et incuber à 28 ° C dans un agitateur orbital horizontal à 200 tr/min à 120 min.
  4. Centrifuger les cellules à 2 348 x g à température ambiante pendant 5 min, jeter la majorité du liquide surnageant, doucement remettre en suspension les cellules granulés avec un embout de la pipette, étalez-les sur un plat de livre contenant 50 mg/L hygromycine B et incuber à 28 ° C pendant 2-3 jours.
  5. Transformer les plantes Col-0 Arabidopsis thaliana avec l' Agrobacterium, qui contient le vecteur binaire pCAMBIA1300 intégré avec plusieurs cassettes d’expression de protéine, par la méthode de28 floral trempette comme décrit précédemment pour générer des plantes transgéniques stables.
  6. Stériliser la surface des graines transgéniques Arabidopsis en les mélangeant avec de l’éthanol 70 % (v/v) contenant 0,05 % Tween 20. Vortexer pendant 10 min. Spin down les graines à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse supérieure à vitesse max pour 2 s, éliminer le surnageant et lavez les graines avec l’éthanol à 100 % une fois pour 30 s.
  7. Distribuer les graines sur un papier filtre stérile sous une hotte stérile. Par la suite, sécher à l’air et les répartir sur des plaques de gélose ½ MS contenant l’hygromycine B pour le dépistage positifs descendances.
  8. Incuber les boîtes à 4 ° C pendant 2 jours. Ensuite, transférer dans la chambre de croissance des plantes et de la culture pendant 7 jours.
  9. Sélectionnez 7 - jour vieilles centrales de juvéniles de survie en recherchant des signaux fluorescents sous le microscope à fluorescence, puis transférer les plantes dans le sol pour plus de dépistage des plantes homozygotes.

6. pharmaceutiques traitements

  1. Pour les traitements pharmaceutiques, diluer chaque médicament dans un milieu liquide MS à ses concentrations appropriées de travail avant l’incubation avec des piles ou des plantes.
    1. Wortmannin traitement : préparer les solutions de wortmannin 1 mM en dissolvant la poudre de wortmannin dans le DMSO et stocker les stocks à-20 ° C. Transfert de cellules végétales ou plantes juvéniles dans le milieu liquide de MS contenant 16,5 wortmammin µM et incuber pendant 30-45 min avant l’imagerie.
    2. Traitement de la bréfeldine A (BFA) : préparer les solutions de BFA 1 mM en dissolvant la poudre BFA dans le DMSO et stocker les stocks à-20 ° C. Transfert de cellules végétales ou plantes juvéniles dans le milieu liquide de MS contenant 10 µg/mL BFA pendant 30-45 min avant l’imagerie.

7. confocal Microscope Imaging et protéine subcellulaire co-localisation analyse

  1. Transférer les juvéniles ou les cellules en suspension sur une lame de verre classique et mettre doucement une diapositive de couverture sur le dessus pour imagerie par standard laser confocal, microscopie à balayage. Utilisez les paramètres suivants : 63 X eau objectif (N.A 1.4), 0 fond, gain 700, taille de pixel de 0,168 mm et détecteur de tube photomultiplicateur. Exciter les protéines GFP-étiquetée à 485 nm et détecter la fluorescence à 525 nm. Pour les protéines marquées DP, exciter au 514 nm et détecter à 575 nm.
  2. Calculer le ratio de co-localisation des signaux fluorescents à l’aide du logiciel Image J (https://imagej.nih.gov/ij/) avec la Pearson-Spearman corrélation (CFP) co-localisation plug-in comme décrit précédemment8. Les coefficients de corrélation de Pearson ou coefficients de corrélation de Spearman rang apparaissent dans les résultats (Figure 4). Les valeurs r produite sera de -1 à 1. 0 ne montre aucun détectable de la corrélation de deux signaux, alors que les + 1 et -1 montrent une corrélation complète positive et négative, respectivement, de deux signaux.

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Résultats

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Nous avons développé une méthode robuste et très efficace pour la co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes. Il brise les barrières de la conventionnelle approches utilisent plusieurs plasmides séparés pour la co-expression de protéine, comme le montre la Figure 1 a, B, via l’expression transitoire ou transformation génétique stable. Dans cette nouvelle méthode, nous allons générer un vect...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous avons démontré une méthode inédite pour robustement co expriment des protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes. Il peut être utilisé pour l’expression transitoire et transformation génétique et est compatible avec l’actuel fluorescent basées sur les protéines bio-imagerie, moléculaires et biochimiques des applications et technologies9,10,13 . En outre, elle surmonte les difficultés des méthodes classi...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions les membres du laboratoire Wang des discussions utiles et commentaires. Ce travail est soutenu par la Fondation National sciences naturelles de Chine (NSFC, grant no 31570001) et la Fondation sciences naturelles de la Province de Guangdong et la ville de Guangzhou (Don 201707010024 et no 2016A030313401) à H.W.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
KOD-FX PolyméraseTOYOBOKFX-101
Sma INEBR0141L/S/V
Tris-HCl BBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
DTTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
Exonucléase T5EpicentreT5E4111K
Phusion ADN polymérase haute fidélitéNEBM0530S
Taq ADN polyméraseNEBB9022S
Murashige et Skoog Mélange de sels de base (MS)SigmaM5524
ÉthanolBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
SpermidineBBIA614270-0001
Particules de microvecteurs d’orBio-Rad165-22631.0 µ ; m
CaCl2BBICD0050-500
MacrotransporteursBio-Rad165-2335
Disque de ruptureBio-Rad165-2329
Dégrilleur d’arrêtBio-Rad165-2336
TryptoneOXOIDLP0042
Extrait de levureOXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
GlucoseBBIA600219-0001
Hygromycine BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Diméthylsulfoxyde (DMSO)BBIA600163-0500
T100 ThermocycleurBio-Rad1861096
Chambre de croissancePanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/He Système de distribution de particulesBio-Rad165-2257
Pulseur de gènesBio-Rad1652660
CuvetteBio-Rad1652083
Centrifugeuse de paillasseEppendorf5427000097
Microscope confocalZeissLSM 7 DUO (780& 7Live)
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotomètresThermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 AlimentationTanonEPS 300
Microscope fluorescentMshotMF30
AgroseBBIA600234
AmpicillineBBIA100339
Ethylène Diamine Tétraacétie AcideBBIB300599

Références

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