Micromanipulation des Chromosomes dans les Spermatocytes insectes

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons la sélection et la préparation de cellules appropriées pour micromanipulation et l’utilisation d’un micromanipulateur piézoélectrique à repositionner des chromosomes dans les cellules.

Résumé

La micromanipulation des chromosomes est une méthode essentielle pour éclairer le mécanisme de chromosome congression, la broche checkpoint et mouvements de chromosome de l’anaphase et a joué un rôle clé pour comprendre ce qui contrôle les mouvements du chromosome au cours d’une division cellulaire. Un biologiste qualifié peut utiliser un micromanipulateur pour détacher les chromosomes de la broche, de repositionner des chromosomes dans les cellules et d’appliquer des forces aux chromosomes à l’aide d’une aiguille de petit verre avec une pointe très fine. Tandis que des perturbations sont possibles aux chromosomes à l’aide d’autres méthodes comme le piégeage optique et autres utilisations d’un laser, à ce jour, aucune autre méthode ne permet le repositionnement des composants cellulaires à l’échelle de quelques dizaines à plusieurs centaines de microns avec peu ou pas de dommages à la cellule .

La sélection et la préparation des cellules appropriées pour la micromanipulation des chromosomes, décrivant spécifiquement la préparation des cultures primaires de sauterelle et le cricket spermatocyte pour l’imagerie de cellules vivantes et micromanipulation, sont décrit ici. En outre, nous montrons la construction d’une aiguille à utiliser pour le déplacement des chromosomes au sein de la cellule et l’utilisation d’un micromanipulateur piézoélectrique contrôlées par joystick avec une aiguille de verre attachée à elle pour repositionner des chromosomes dans les cellules en division. Un résultat de l’échantillon montre l’utilisation d’un micromanipulateur pour détacher un chromosome d’un axe dans un spermatocyte primaire et de repositionner ce chromosome au sein de la cellule.

Introduction

Micromanipulation a révélé des pièces du mécanisme pour une chromosome congression, la broche checkpoint et mouvements de chromosome de l’anaphase. La première publication décrivant les résultats des expériences de micromanipulation était par Robert Chambers¹. Chambers a utilisé un micromanipulateur mécanique avec une aiguille de verre ci-joint pour sonder le cytoplasme d’un certain nombre de différents types cellulaires. Malheureusement, les méthodes de contraste permettant la visualisation des chromosomes et de nombreux autres composants cellulaires dans les cellules vivantes n’étaient pas disponibles dans le temps, donc expériences Chambers'....

Protocole

1. préparation de la Culture de cellules primaires Spermatocyte insectes Micromanipulation

1. Préparation des lames
   1. Obtenir une lame de verre de 75 mm x 25 mm avec un trou circulaire de 20 mm de diamètre, découper au centre de la diapositive.
      NOTE : Elles ont été coupées d’une seule feuille de verre à vitre à la taille d’une lame de verre avec un trou au centre.
   2. Une lamelle de 25 x 25 mm #1.5 faire executer une flamme de bec Bunsen pour 2 s.
   3. Appliquez de la graisse sous vide sur le pourtour du trou dans la lame de verre
   4. Placer la lamelle sur le trou comme dans la Figure 1. Appuyez dessus ....

Résultats

La figure 6 montre une micromanipulation échantillon de 2 spermatocytes primaires adjacentes sauterelle dans plusieurs exemples des utilisations possibles de micromanipulation. Cette expérience a été faite à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée,. 0:00 (les heures indiquées sont en min:s) image montre les deux cellules avant la manipulation. Un chromosome dans la cellule inférieure apparaît plus sous tension appliquée par l’aiguille de microman.......

Discussion

Avec la pratique, de déplacer des chromosomes dans la cellule peut devenir une seconde nature. Les aiguilles qui sont suffisamment rigides et suffisamment mince pointe sont difficiles à « obtenir le don de » fabriquer, mais cette capacité est également livré avec la pratique. Les aiguilles qui sont si fines qu’elles déforment quand ils sont déplacés dans le Huilehalocarbone ne sera pas utiles pour pousser les chromosomes de la cellule. Les aiguilles qui sont tellement brutal que leurs conseils sont visibles et aussi gran.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
VWR micro verre de protection	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning Graisse sous vide poussé	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Ciseaux de microdissection, acier inoxydable	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 foreceps fins	Outils scientifiques	fins 11254-20
Diamètre extérieur de 0,85 mm, diamètre intérieur de 0,65 mm Tube en verre Pyrex.	Drummond Scientific	Commande personnalisée - appelez pour demander
Microscope inversé, à contraste de phase avec objectif à faible grossissement 10X ou 16X et objectif à fort grossissement 60X ou 100X	N’importe quelle marque
microforge	soit construite sur mesure ou micromanipulateur Narashige	MF-900
	construit sur mesure ou Burleigh PCS-6000 avec joystick de contrôle piézoélectrique	personnalisé PCS-6300

soit