Method Article

Un test multipuits Format Polyacrylamide pour étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’Infection bactérienne de cellules adhérentes

DOI:

10.3791/57361

⸱

July 5th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons développé un test multipuits format polyacrylamide pour sonder l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur une infection bactérienne de cellules adhérentes. Ce dosage est compatible avec la cytométrie en flux, immuno-coloration et microscopie de force de traction, ce qui permet des mesures quantitatives des biomécaniques interactions entre cellules, leur matrice extracellulaire et des bactéries pathogènes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rigidité de la matrice extracellulaire comprend l’une des multiples stimuli mécaniques environnementales qui sont bien connues pour influencer le comportement cellulaire, la fonction et sort en général. Bien que les réponses des types de cellules adhérentes plus en plus à la rigidité de la matrice ont été caractérisés, comment adhérentes la sensibilité des cellules à une infection bactérienne dépend de la rigidité de la matrice est largement inconnue, comme c’est l’effet d’une infection bactérienne sur la biomécanique des cellules hôtes. Nous émettons l’hypothèse que la sensibilité des cellules endothéliales de l’hôte à une infection bactérienne dépend de la rigidité de la matrice où se trouvent ces cellules, et que les cellules de l’infection de l’hôte avec des bactéries va changer leur biomécanique. Pour tester ces deux hypothèses, les cellules endothéliales ont été utilisés comme hôtes de modèle et de Listeria monocytogenes comme un pathogène de modèle. En mettant au point un test de nouveaux puits multiples format, nous montrons que l’effet de la rigidité de la matrice sur l’infection des cellules endothéliales par L. monocytogenes peut être évaluée quantitativement par cytométrie en flux et immunostaining suivie par microscopie. En outre, à l’aide de la microscopie de force de traction, l’effet de L. monocytogenes infection sur la biomécanique de cellules endothéliales hôte peut être étudié. La méthode proposée permet l’analyse de l’effet de la mécanique des tissus sur une infection bactérienne de cellules adhérentes, qui est une étape cruciale vers la compréhension des interactions entre les cellules, leur matrice extracellulaire, biomécaniques et bactéries pathogènes. Cette méthode est également applicable à une grande variété d’autres types d’études sur la biomécanique de la cellule et la réponse à la rigidité du substrat où il est important d’être capable d’effectuer de nombreuses répétitions en parallèle dans chaque expérience.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules dans les tissus animaux plus sont généralement adhérentes, attachant une fois aux cellules voisines et à leur matrice extracellulaire (ECM). L’ancrage des cellules à leur ECM est critique pour de nombreux processus cellulaires, allant de la motilité cellulaire à la cellule de survie et la prolifération de1,2. Ancrage cellulaire à l’ECM dépend de la composition de l’ECM et la rigidité. Les cellules répondent à l’évolution de ce dernier par dynamiquement réorganisant leur cytosquelette, adhérences ECM-cellule et cellule-cellule, qui à son tour gravement altérer cellule biomécanique et fonctions3,4,5,6 . Rigidité de l’ECM peut varier dans l’espace (p. ex., localisation anatomique), dans le temps (i.e., vieillissement) et dans les processus physiopathologiques (p. ex., artériosclérose, cancer, infections, etc.). Par exemple, il est largement admis qu’endothélial cellules résidant sur plus rigide-par rapport aux plus doux-matrices exercer des efforts accrus pour leur ECM et les uns aux autres et pièce accrue la motilité et la prolifération7,8. De même, fibroblastes résidant sur des matrices plus rigides donnent des forces contractiles à leur ECM et montrent une augmentation de la prolifération, la motilité et ECM production9,10,11. Bien que la mécanique cellulaire et réponse à la rigidité de l’ECM ont été largement étudiés pour divers types de cellules, la relation entre les cellules de l’hôte adhérentes, la rigidité de leur ECM et infections bactériennes est encore largement inconnue.

Afin d’étudier le rôle de la rigidité de la ECM en interactions entre cellules de bactérie-hôte, L. monocytogenes (Lm) a été choisi comme l’agent pathogène de modèle. LM est une bactérie ubiquiste de toxi-infection alimentaire qui peut provoquer une infection systémique dans une grande variété d’hôtes mammifères. Ce pathogène intracellulaire facultatif peut se déplacer de l’épithélium intestinal, à des organes éloignés, en parcourant les différents types d’endothelia vasculaire. S’il viole la barrière hémato - encéphalique, Lm peut causer la méningite, et lorsqu’il traverse la barrière placentaire, il peut provoquer un avortement spontané12,13. LM peut infecter les types de cellules hôtes différentes et peut le faire en utilisant des stratégies distinctes de pathogènes. Infection de LM a été étudiée principalement dans le cadre des cellules épithéliales, bien que beaucoup moins sait-on comment Lm peut infecter et dérivation de cellules endothéliales tapissant la lumière des vaisseaux sanguins14,15,16. En outre, il est encore largement inconnu comment la rigidité de l’ECM où résident les cellules endothéliales module capacité de Lm à envahir ces cellules de l’hôte et à ensuite propagée. LM et plusieurs espèces bactériennes supplémentaires (c.-à-d., Rickettsia parkeri) Profitez de l’accueil des cellules qu’ils infectent à la fois envahissent dans leur cytoplasme et facilitent la diffusion de cellule-à17 , le cytosquelette d’actine , 18 , 19. ils y parvenir par le biais de l’expression des protéines qui leur permettent d’intervenir avec les voies de polymérisation de l’actine hôte et à produire les queues de comète d’actine qui facilitent leur propulsion avant16,20. À la suite de l’infection, cytosquelette d’actine de la cellule de l’hôte a besoin de réorganiser dynamiquement dans une manière qui n’est pas encore complètement caractérisée, susceptibles d’influer sur la biomécanique des cellules hôtes y compris les forces physiques qu’elles exercent sur leur ECM et sur chaque autres. Afin d’examiner ces processus, les cellules endothéliales microvasculaires humaines (CEMH-1) ont été choisis comme cellules hôtes modèle pour trois raisons : 1. les cellules endothéliales sont connus pour être très mécanosensibles car ils sont constamment exposés à divers indices physiques21; 2. les stratégies que LM emploie pour infecter les cellules endothéliales sont encore largement inconnus22; et 3. HMEC-1 sont une lignée de cellules immortalisées et peuvent, par conséquent, être facilement cultivées et soumis à des manipulations génétiques.

Infection bactérienne de cellules de l’hôte a surtout été étudiée in vitro en ensemençant des cellules sur verre ou polystyrène substrats qui sont nettement plus rigides que l’ECM physiologique de la plupart de cellules12,14,23. D’examiner l’infection de cellules ensemencées sur une matrice dont la raideur est physiologiquement pertinente et d’élucider le rôle de rigidité ECM sur l’infection des cellules de bactéries pathogènes, nous avons suivi une approche innovante fondée sur la fabrication maigre polyacrylamide incorporé faisant hydrogels de rigidité accordable sur plaques multipuits. La nouveauté de l’approche proposée est qu’il permet de contrôler plusieurs conditions en même temps en raison de son format multipuit et qu’elle est compatible avec des techniques multiples en raison de la manière particulière que les substrats sont construits. Cellules HMEC-1 ont été ensemencées sur ces protéines-enduit hydrogels et puis infectés par différentes souches de Lm qui deviennent fluorescents après internalisation ou sont constitutivement fluorescent. Le rôle de rigidité ECM sur la susceptibilité de l’infection des cellules-hôtes HMEC-1 a été évalué par cytométrie en flux. En outre, immunocoloration et fluorescence microscopy servaient à faire la différence entre bactéries adhérentes et intériorisées. Enfin, la microscopie de Force de Traction (TFM) a été effectué avec succès pour caractériser l’effet de l’infection de Lm sur les contraintes de traction que les cellules endothéliales hôte exercent sur leurs matrices au cours de l’infection. L’essai présenté peut être facilement modifié pour permettre plus amples études sur l’effet de la rigidité de l’ECM sur la susceptibilité de l’infection des cellules adhérentes à l’aide de différentes lignées cellulaires ou agents pathogènes.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. fabrication des Hydrogels de Polyacrylamide de deux couches minces (PA) sur plaques multipuits

  1. Dissoudre le persulfate d’ammonium (APS) dans l’eau ultrapure distillée pour obtenir une concentration finale de 10 g/mL. Aliquote et store la solution à 4 ° C pour une utilisation à court terme (3 semaines).
    Remarque : La solution ci-dessus peut être préparée avant fabrication d’hydrogel.
  2. Activation de verre de 24 paraboloïdes
    1. Incuber 24 puits verre bas avec 13 puits de mm de diamètre (voir Table des matières) pendant 1 h avec 500 µL de 2 M de NaOH / puits à température ambiante.
    2. Rincer les puits 1 x avec de l’eau ultrapure et puis ajouter 500 µL de triéthoxysilane 2 % (3-Aminopropyl) (voir la Table des matières) dans l’éthanol à 95 % à chacun bien pendant 5 min.
    3. Rincez les puits 1 x à nouveau avec de l’eau et ajouter 500 µL de glutaraldéhyde à 0,5 % pour chaque puits pour 30 min. Rincer les puits 1 x avec de l’eau et séchez-les à 60 ° c avec le couvercle au large.

figure-protocol-1
Figure 1 : Dosage d’une infection bactérienne des cellules hôtes résidant sur mince deux couches fluorescent incorporé perle polyacrylamide (PA) hydrogels de raideur variable. A. lamelles de verre sont chimiquement modifiés pour permettre un accrochage d’hydrogel. B. 3,6 µL de mélanges de PA sont déposés sur le fond du verre. C. le mélange est recouvert d’une lamelle de verre circulaire 12 mm pour permettre la polymérisation. D. la lamelle est enlevée avec une aiguille de seringue. E. 2.4 µL d’une solution de sonorisation avec microbilles est ajouté sur le dessus de la couche de fond et recouvert d’une lamelle de verre circulaire. F. une mémoire tampon est ajoutée dans le puits et le couvre-objet est supprimé. G. irradiation UV pendant 1 h assure la stérilisation. H. une solution contenant du Sulfo-SANPAH est ajoutée sur les gels, qui sont ensuite placées sous exposition aux UV pour 10 min. j’ai. Les hydrogels sont lavés avec un tampon et ensuite incubés durant une nuit avec collagène I. J. L’hydrogel est équilibrée avec les milieux cellulaires. K. les cellules de l’hôte sont ensemencées. L. Bactéries de LM sont ajoutés à la solution et l’infection est synchronisée par centrifugation. M. 1 h après l’infection bactéries présentes dans la solution sont emportées et milieux supplémentés avec un antibiotique est ajouté. N. infection après 4 h, Lm (JAT985) commence réagissant. O. cellules HMEC-1 sont détachées de leur matrice et les solutions sont transférées aux tubes pour effectuer des mesures de cytométrie en flux. Notez que les jours et les heures approximatives pour chaque étape de l’analyse sont également indiqués. Ce chiffre a été modifié par Bastounis et Theriot59. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Fabrication de polyacrylamide hydrogel
    Remarque : Consultez la section la Figure 1.
    1. Préparer des solutions aqueuses contenant de 3 à 10 % de la solution mère d’acrylamide 40 % (voir la Table des matières) et 0,06 - 0,6 %, 2 % stock solution bis-acrylamide (voir Table des matières) pour fabriquer des hydrogels de rigidité réglable allant de 0,6 kPa à 70 kPa. Voir le tableau 1.
      1. Pour 0,6 kPa hydrogels, mélanger 3 % d’acrylamide à 0,045 % bis-acrylamide. Pour 3 kPa hydrogels, mélanger 5 % d’acrylamide avec 0,074 % bis-acrylamide. Pour 10 kPa hydrogels, mélanger 10 % d’acrylamide avec 0,075 % bis-acrylamide. Pour 20 kPa hydrogels, côtoient 0,195 % bis-acrylamide 8 % d’acrylamide. Pour 70 kPa hydrogels, mélanger 10 % d’acrylamide avec 0,45 % bis-acrylamide.
        Remarque : Des précisions sur la réalisation de la rigidité d’hydrogel PA souhaitable se trouvent ailleurs24,25,26,27.
    2. Préparer deux solutions aqueuses pour chaque raideur hydrogel souhaitable. Préparer la Solution 1 à être exempt de perle et 2 Solution contenant 0,03 % 0,1 µm de diamètre fluorescent micro-billes (voir Table des matières).
    3. Degas Solutions 1 et 2 par le vide pendant 15 minutes pour éliminer l’oxygène qui est connu pour inhiber la polymérisation des solutions.
    4. 0,6 % du stock de 10 g/mL solution APS et 0,43 % tétraméthyléthylènediamine (TEMED) s’ajoute 1 Solution pour permettre une initiation de la polymérisation. Agir vite.
    5. Ajouter 3,6 µL de Solution 1 au centre de chaque alvéole du godet 24 puits (Voir l' étape 1.2 pour sa préparation).
    6. Immédiatement couvrir les puits avec lamelles circulaires non traitées de 12 mm et laisser des Solution 1 pendant 20 min afin qu’il polymérise complètement.
    7. Tapotez doucement une aiguille de seringue sur une surface pour créer un petit crochet à son extrémité pour faciliter le retrait des lamelles. Soulevez les lamelles à l’aide de l’aiguille de la seringue.
    8. Ajouter 0,6 % de la solution APS 10 g/mL et 0,43 % TEMED à la Solution 2. 2.4 µL du mélange sur le dessus de la première couche de dépôt dans chaque alvéole du godet 24 puits.
    9. Couvrir les 2 Solution avec lamelles de verre circulaire 12 mm, doucement pressant vers le bas à l’aide d’une paire de pinces pour s’assurer de l’épaisseur de la deuxième couche est minime. Laisser 2 Solution polymériser pendant 20 min.
    10. Ajouter 500 µL de 50 millimètres HEPES pH 7.5 à chaque puits et ensuite enlever le couvre-objet en verre avec l’aiguille de la seringue et le forceps.
  2. Stérilisation, collagène-revêtement et équilibration des hydrogels de polyacrylamide
    1. UV-exposer les hydrogels pendant 1 h dans la hotte de vitroplants afin de permettre la stérilisation.
    2. Préparer un mélange de 0,5 % poids/volume sulfosuccinimidyl 6-(4′-azido-2′-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, voir la Table des matières) dans 1 % DMSO 50 mM HEPES pH = 7,5.
    3. Ajouter 200 µL de cette solution à l’extrados de l’hydrogel. Agir vite, les exposer aux UV (302 nm) pendant 10 min pour les activer.
    4. Laver les hydrogels deux fois avec 1 mL de 50 mM HEPES pH = 7,5. Répéter si nécessaire pour faire en sorte que tout excès RETICULATION est supprimé.
    5. Protéine-manteau les hydrogels avec 200 µL de rat de 0,25 mg/mL de collagène queue j’ai (voir Table des matières) à 50 mM de HEPES. Incuber les hydrogels, avec la solution de collagène sur le dessus, une nuit à température ambiante.
      Remarque : Pour éviter la déshydratation/évaporation, placer les plaques multipuits dans une enceinte de confinement secondaire et ajouter laboratoire nettoyage tissus imbibés d’eau dans la périphérie intérieure de l’enceinte de confinement.
    6. Utilisez un épifluorescence ou un microscope confocal avec un objectif X 40 pour mesurer l’épaisseur de l’hydrogel. Faire en localisant la position z du bas (correspondant à la surface du verre) et garnir les avions de l’hydrogel (où l’intensité des perles fluorescentes est maximale). Déduisez les positions z afin de déterminer la hauteur.
      NOTE : Nous avons utilisé un microscope à épifluorescence inversé et un objectif X 40 avec ouverture numérique 0,65 pour mesurer l’épaisseur de l’hydrogel. Les mesures de la microscopie à Force atomiques (AFM) peuvent également être effectuées à ce stade pour confirmer la rigidité exacte de l’hydrogel (voir Figure 2).
    7. Avant d’ensemencer les cellules d’intérêt sur les hydrogels, ajouter 1 mL de médias sur les hydrogels et les incuber à 37 ° c pendant 30 min à 1 h pour s’assurer de l’équilibration.
      NOTE : Nous avons ajouté CMPD-131 pleins médias parce que c’est les médias où les cellules hôtes de modèle (CEMH-1) ont été cultivés en (Voir l' étape 2.1 pour plus de détails).

figure-protocol-2
Figure 2: mesures AFM PA hydrogel rigidité et distribution des perles. A. données montrent les attendus d’Young (mesure de rigidité) de l’autorité palestinienne hydrogels, compte tenus de la quantité d’acrylamide et bis-acrylamide utilisé contre le module de Young mesuré par l’AFM (N = 5-6). Les barres horizontales représentent la moyenne. La rigidité des 0,6 hydrogels kPa n’a pas pu être mesurée, car les hydrogels étaient très doux et collés à la pointe de l’AFM. B. il s’agit d’une image de phase de cellules confluentes HMEC-1 et l’image correspondante des perles embarqué sur la surface supérieure d’un hydrogel souple 3 kPa-PA. Le HMEC-1 ont été ensemencées pendant 24 h à une concentration de 4 x 105 cellules par puits. C. cette image est la même que la Figure 2B mais pour cellules résidant sur un hydrogel de PA rigide 70-kPa. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. Culture de cellules endothéliales microvasculaires humaines et ensemencement sur Hydrogels

  1. La culture HMEC-1 (humain, microvasculaire endothéliale) cellules CMPD-131 plein milieux contenant du CMPD-131 médias additionné de sérum de veau fœtal 10 %, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique, 1 µg/mL d’hydrocortisone et de 2 mM de L-glutamine (voir Table des matières ).
  2. Diviser les cultures confluentes 1,6 tous les 3-4 jours et de garder les cellules jusqu’au passage 40.
  3. Un jour avant l’expérience, détacher les cellules de leur récipient de culture à l’aide de 0,25 % de trypsine/EDTA. Tout d’abord laver les cellules et leur récipient de culture 1 x avec phosphate stérile solution saline tamponnée (PBS) et puis ajouter la quantité appropriée de 0,25 % de trypsine/EDTA (2 mL / 100 mm plat ou une fiole de 75 cm, 1 mL par plat 60 mm ou un flacon de 25 cm), en incubant le ballon à 37 ° C pendant 5-10 min pour permettre le détachement des cellules de leur substrat.
  4. Neutraliser la trypsine en ajoutant le volume souhaité de pleins médias CMPD-131, pipette doucement pour briser les agrégats de cellules et placez ensuite la solution dans un tube à centrifuger conique.
  5. Doucement agiter la solution de cellules pour s’assurer que les cellules sont réparties uniformément et puis sortent 20 µL de la solution et très doucement remplir deux chambres sous la lamelle d’un hémocytomètre de verre.
  6. Pellets vers le bas de la solution de cellules contenues dans le tube à centrifuger conique par centrifugation pendant 10 min à 500 x g.
  7. Au cours de la période d’attente de 10 min, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Utiliser un microscope, se concentrer sur les lignes de la grille de l’hémocytomètre avec un objectif X 10 et ensuite utiliser un compteur de contrôle de main pour compter le nombre de cellules dans un 1 mm x 1 mm carré.
  8. Déplacer l’hémocytomètre vers un autre carré de 1 x 1 mm, compter les cellules il et puis répétez l’opération deux fois. Calculer la moyenne des quatre mesures et puis multiplier la moyenne de 104. La valeur finale est le nombre de cellules viables/mL dans la suspension cellulaire qui est être centrifugée.
  9. Retirer le liquide hors du tube à centrifuger conique tout en veillant à ce que le culot cellulaire n’est pas perturbé. Remettre en suspension les cellules dans les médias complets CMPD-131 à une concentration de 4 x 105 cellules/mL.
  10. Les cellules en suspension sur les hydrogels en retirant tout d’abord les médias avec lesquels on a incubé les hydrogels, puis en ajoutant 1 mL de suspension cellulaire sur chaque hydrogel aux semences.

3. l’infection de cellules endothéliales microvasculaires humaines par L. monocytogenes

  1. Préparation préalable
    Remarque : Préparer les solutions suivantes à l’avance.
    1. Stocks de streptomycine, le chloramphénicol et gentamicine
      1. Préparer les solutions de 50 mg/mL de streptomycine en pesant 0,5 g de sulfate de streptomycine et dissoudre complètement dans 10 mL d’eau ultrapure.
      2. Préparer les solutions de 7,5 mg/mL de chloramphénicol pesant 75 mg de chloramphénicol et dissoudre complètement dans 10 mL d’éthanol à 100 %.
      3. Préparer les solutions de 20 mg/mL de gentamicine par 0,2 grammes de sulfate de gentamicine et dissoudre complètement dans 10 mL d’eau ultrapure.
      4. Filtre-stériliser toutes les solutions mères avec un filtre de seringue 0,2 µm et stockez-les à-20 ° C pour une utilisation à long terme (1 à 2 mois).
    2. Cerveau coeur infusion (BHI) médias et agar plaques
      1. Localisez les deux flacons de 1 L et ajouter un magnétique à l’intérieur de chaque flacon.
      2. Pour les médias BHI, ajouter 37 g de poudre BHI dans un ballon et ajouter eau ultrapure jusqu'à 1 L. mélanger la solution vigoureusement en plaçant le ballon sur une plaque magnétique remuer jusqu'à ce que la poudre se dissout.
      3. Pour les plaques de gélose BHI, ajouter 37 g de poudre BHI et 15 g d’agar granulé (voir Table des matières) dans le deuxième flacon et ajouter l’eau ultrapure jusqu'à 1 L. mélanger la solution vigoureusement en plaçant le ballon sur une plaque magnétique remuer jusqu'à ce que la poudre se dissout.
      4. Visser les couvercles des flacons sans trop serrer et stériliser les solutions utilisant le liquide définissant ou selon les spécifications de l’autoclave.
      5. Supprimer la solution de l’autoclave, puis refroidir la solution d’agar-BHI à 55 ° C. Si les médias BHI dans le flacon de 1 L sont maintenue stérile, il peut être utilisé pour jusqu'à un mois.
      6. Pour préparer les bactéries plaques d’agar-BHI, tout d’abord ajouter des antibiotiques, le cas échéant, à la fiole contenant le BHI et agar (selon les souches bactériennes à cultiver). Brièvement mis le ballon sur une plaque d’agitation magnétique pour permettre un mélange rapide.
        Remarque : Les antibiotiques utilisés ici sont spécifiques aux souches de Lm utilisés, mais des antibiotiques nécessaires peuvent être utilisés dans les boîtes de gélose BHI. Nous avons ajouté la streptomycine à une concentration de 200 µg/mL et le chloramphénicol à une concentration de 7,5 µg/mL car 10403S Lm souches sont résistantes à la streptomycine. Ces souches ont été conjugués avec un plasmide contenant la chloramphénicol acétyltransférase trame de lecture ouverte, d'où la résistance au chloramphénicol.
      7. Versez le mélange dans les bactéries en polystyrène 10 cm plaques de culture (environ 20 mL par plaque). Pour se débarrasser des bulles, la flamme brièvement la surface supérieure des plaques. Plaques cool du jour au lendemain à la température ambiante.
      8. Le lendemain, sceller les plaques sèches et les stocker à 4 ° C.
  2. Infection des cellules endothéliales microvasculaires humaines par L. monocytogenes
    1. Trois jours avant l’infection, la strie sur la Lm souche pour servir d’un stock de glycérol (conservé à-80 ° C) sur une gélose BHI contenant 7,5 µg/mL de chloramphénicol et 200 µg/mL de streptomycine, le cas échéant.
      Remarque : La souche à être strié dehors peut être un type sauvage ou mutant, exprimant constitutivement fluorescence (par immunomarquage que jat1045 a été utilisé) ou exprimant la fluorescence par un promoteur de l’ActA (pour écoulement cytometry ou traction microscopie à force JAT983 ou JAT985 ont été utilisés)22.
    2. Incuber les plaques à 37 ° C jusqu'à ce que des colonies isolées sont formés (1 à 2 jours).
    3. La veille de l’infection, cultiver la souche désirée pendant la nuit, secouant à 150 tr/min à 30 ° C en milieu BHI 7,5 µg/ml de chloramphénicol (le cas échéant).
      1. Déposer 5 mL des médias BHI dans un tube à centrifuger conique de 15 mL, ajouter 7,5 µg/mL de chloramphénicol (le cas échéant) et puis ensemencer une seule colonie de la gélose à l’aide d’une pointe µL 10 stérile.
    4. Le lendemain, juste avant l’infection, mesurer la densité optique de la solution de bactéries à 600 nm (DO600) par dilution de l’échantillon 1:5 ; utiliser une cuvette contenant BHI seul pour servir comme un blanc.
    5. Diluer la culture au jour le jour à un DO600 de 0,1 et incuber, secousses pendant 2 h à 30 ° C, dans les médias BHI 7,5 µg/ml de chloramphénicol (le cas échéant) afin de permettre aux bactéries d’atteindre la croissance phase logarithmique.
    6. Mesurer la DO600 de la solution bactérienne, ce qui devrait se situer autour de 0,2 - 0,3. Si la DO600 est plus élevé, le diluer à 0,2 - 0,3 avec BHI seul.
    7. Prélever 1 mL de solution bactérienne dans un tube de microcentrifuge. Le tourner vers le bas pendant 4 min à 2 000 g par centrifugation à température ambiante. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot bactérien dans 1 mL de PBS de culture de tissus de qualité, dans le capot de la culture de tissus. Laver les bactéries deux fois plus en les faisant tourner pendant 4 min à 2 000 x g à la température ambiante. Retirez le surnageant et remettre en suspension les bactéries dans 1 mL de PBS.
    8. Préparer le mélange de l’infection en mélangeant 10 ou 50 µL de la bactérie remis en suspension dans du PBS 1 ml de médias complet CMPD-131 pour une multiplicité d’infection (MOI ; c'est-à-dire, le nombre de bactéries par cellule hôte) d’environ 50 bactéries par cellule hôte ou 10 bactéries par la cellule hôte.
    9. Retirez le support par les puits des plaques 24 puits, attention à ne pas perturber les hydrogels ou les cellules. Laver les cellules 1 x 1 ml du CMPD-131 plein de médias et puis ajouter 1 mL de la bactérie dans chaque puits.
    10. Garder quelques mix d’infection (au moins 100 µL) pour la détermination du MOI (voir étape 3.3).
    11. Couvrir la plaque avec son couvercle et envelopper les plaques d’une pellicule de polyéthylène alimentaire pour éviter les fuites. Placer les plaques dans la centrifugeuse et essorer les échantillons pendant 10 min à 200 x g pour synchroniser l’invasion. Déplacer les plaques dans l’incubateur de culture de tissus et les incuber 30 min à 37 ° C.
    12. Laver les échantillons 4 x avec CMPD-131 plein de médias et déplacez-les dans l’incubateur de culture de tissus. Après un 30 min supplémentaire, remplacer les médias médias additionné de 20 µg/mL de gentamicine.
  3. Détermination de la multiplicité d’infection (MOI)
    1. Au cours de l’incubation de 30 min initiale des cellules hôte avec les bactéries, préparer 10 fois des dilutions successives du mix infection afin de déterminer la MOI. Préparer des dilutions 10 fois en mélangeant 100 µL du mélange infection avec 900 µL de PBS 1 x (dilution 10-1 ). Ensuite, mélanger 100 µL de la dilution 10-1 900 µl de PBS (dilution 10-2 ).
    2. Continuer jusqu'à l’obtention d’une dilution de 10-5 .
      Remarque : Toutes les solutions doivent être mélangés bien avant de diluer, et pointes de pipette propre frais doivent être utilisés à chaque étape.
    3. Une fois les dilutions sont faites, placer 100 µL de la 10-2 - 10-5 dilutions sur le Centre des plaques BHI/agar/chloramphénicol/streptomycine (le cas échéant).
    4. Faire un épandeur d’une pipette de verre à l’aide de feu pour plier la pipette pour créer un crochet. Trempez la pipette dans l’éthanol à 100 % pour la stérilisation et puis brûler à l’éthanol avec une flamme.
    5. Lorsque le séparateur est refroidi, étaler les dilutions bactériennes homogène sur les plaques à partir de la dilution 10-5 et se déplaçant pour les mélanges plus concentrées. Incuber les boîtes à l’envers à 37 ° C pendant 2 jours.
    6. En fonction de la densité de la colonie, déterminer le nombre de colonies de la 10-3 et 10-4 ou les 10-4 et 10-5 plaques de dilution. Calculer la MOI comme suit :
      nombre de colonies × dilution facteur ÷ volume initial ajouté = nombre d’UFC par µL
      nombre d’UFC par volume × µL du mélange de bactéries / puits = nombre d’UFC / puits
      nombre d’UFC par puits × volume de cellules / puits = nombre de bactéries par cellule
      Remarque : L’UFC est synonyme de formatrices unités.
    7. Moyenne du MOIs de deux plaques pour obtenir les MOIs dernier.

4. cytométrie à quantifier la matrice extracellulaire-rigidité sensibilité dépendante des cellules de l’hôte à l’Infection

  1. Peser 5 mg de collagénase et le placer dans un tube à centrifuger conique de 15 mL. Ajouter 10 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA et mélangez-les bien.
  2. 8 h après infection, enlevez le média du puits de la plaque 24 puits et laver les puits 1 x avec tissue culture PBS. Retirez les PBS des puits et ajouter 200 µL du mélange trypsine-EDTA/collagénase dans chaque puits. Placez-la dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 10 min permettre le détachement complet des cellules.
  3. Utiliser une pipette de frais pour chaque puits et ajouter le mélange de haut en bas de 8 x. Soyez doux afin de ne pas endommager les cellules. Ajouter 200 µL de médias complet dans chaque puits pour neutraliser la trypsine.
  4. Transvaser la solution de cellules de 400 µL de chaque puits dans un tube de 5 mL en polystyrène avec un bouchon de crépine de cellule 35 µm (voir Table des matières).
  5. Analyser les 10 000-20 000 cellules par échantillon par cytométrie en flux. Effectuer l’acquisition de données par le biais de cytométrie en flux et détermine le pourcentage de cellules infectées par les puits à l’aide d’un logiciel approprié disponible dans le commerce. Utiliser la dispersion vers l’avant par rapport aux diagrammes de dispersion latérale pour porte la plus grande partie de la distribution du nombre de cellules.
    Remarque : Cela s’assurer que l’analyse des cellules individuelles et éliminer des débris ou des doublets de la cellule ou des triplés.
    1. Mesurer le signal de fluorescence des cellules non infectées contrôle et porte la population des cellules infectées à l’exclusion d’autofluorescence.

5. Immunostaining des bactéries extracellulaires, microscopie et traitement d’Image

Remarque : Cette approche est suivie pour faire la différence entre l’adhésion bactérienne dépendante de ECM-rigidité sur la surface des cellules hôte contre bactérienne internalisation (invasion) dans les hôtes.

figure-protocol-3
Figure 4 : Immunomarquage de Lm infecté HMEC-1 cellules résidant sur hydrogels de raideur variable pour différencier l’adhésion bactérienne contre invasion. Ces images montrent un exemple représentatif de différentiel immunomarquage montrant A. les noyaux cellulaires (DAPI), B. toutes les bactéries (GFP) et C. les bactéries à l’extérieur (Alexa-546). Les cellules HMEC-1 résidaient sur un hydrogel souple 3-kPa. Les flèches pointent à bactéries qui ont été intériorisés, donc sont montrés sur le canal vert uniquement. Données en D-F CF N = 20 images capturées pour les cellules infectées de HMEC-1 résidant sur doux 3-kPa et d’hydrogels rigide 70-kPa et demontrer D. bactéries totales par noyaux ; E. les bactéries intériorisés par les noyaux ; et F. l’efficacité de l’invasion (le ratio de bactéries intériorisées de bactéries totales). Les barres horizontales représentent la moyenne de données. La P-valeur est calculée avec le test de Wilcoxon grade somme non paramétrique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. 30 min après l’infection, lavez les HMEC-1 les cellules infectées par le JAT1045 (Lm constitutivement exprimant la protéine fluorescente verte (GFP)) x 4 avec les médias.
  2. Après le quatrième lavage, mélanger 1 µL de 1 mg/mL colorant Hoechst avec 1 mL de médias complet CMPD-131 et l’ajouter à chaque puits pour colorer les noyaux des cellules. Placer les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 10 min.
  3. Laver les cellules 1 x avec du PBS. Fixez-les avec un fixatif non-perméabiliser pour différentiel immunostaining pendant 20 min à température ambiante de28.
    Remarque : Le fixatif contient 0,32 M saccharose, 10 mM MES pH 6.1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mM EGTA et 4 % de formaldéhyde (grade de microscopie électronique).
  4. Laver les cellules 1 x avec du PBS. Bloquer les échantillons pendant 30 min avec 5 % d’albumine sérique bovine (voir Table des matières) dans du PBS.
  5. Incuber les échantillons pendant 1 h avec un anti-Lmanticorps primaire (voir Table des matières) dilué au 1/100 dans du PBS contenant 2 % de BSA.
  6. Les échantillons de lavage en PBS 3 x et puis les incuber pendant 1 heure avec un AlexaFluor-546 chèvre-anti-lapin anticorps secondaire (voir Table des matières) dilué à 1/250 dans du PBS contenant 2 % de BSA. Laver les échantillons 3 x dans du PBS. Stocker les échantillons dans 1 mL de PBS pour l’imagerie.
  7. Image et analyser plus de 1 000 cellules par État.
    1. Pour l’imagerie, utiliser un microscope à épifluorescence inversé avec une caméra CCD (voir Table des matières) et a 40 X objectif d’air air plan fluorite avec 0,6 ouverture numérique (NA).
      Remarque : La puissance est réglée à 25 % et la durée d’exposition à 100 m les filtres de microscope utilisés pour mCherry sont 470/525 nm, GFP 530/645 nm et DAPI 395/460 nm, pour l’excitation et d’émission respectivement. Le microscope que nous avons utilisé était contrôlé par un opensource microscopie logiciel paquet29.
    2. Pour différentiel immunostaining, compter toutes les bactéries « verts », associés à des cellules individuelles comme adhérent. Compter les bactéries qui sont « vert » et « rouge » (due à la liaison de l’anticorps) comme non-internalisés.
      NOTE : Nous avons identifié le nombre de noyaux en exécutant un script sur mesure et le logiciel de CellC (voir Table des matières) pour le dénombrement des bactéries30.

6. microscopie à Force Traction multipuits et microscopie de Stress monocouche

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Figure 5: cellules infectées par Lm HMEC-1 diminuer l’ampleur des forces de traction qu’elles exercent sur leur ECM lors de l’infection. Paroi A montre l’image de phase, B montre le champ de déformation, C montre le champ de contraintes de traction et D décrit le champ de tension intracellulaire des cellules non infectées HMEC-1 résidant sur un hydrogel 20-kPa. Les barres de couleur de la déformation des cartes (µm), de la traction stress cartes (Pa) et de la tension intracellulaire cartes (nNµm-1) sont indiqués sur la partie supérieure des cartes de chaleur. Les colonnes indiquent trois moments représentatifs : 3, 8 et 18 h après l’infection. E-H. Identique à panneaux A-D sauf pour les cellules infectées par Lm à un MOI de 300. Les images de la bactérie (canal rouge) sont superposent sur les images de phase des cellules. Enregistrements de la TFM ont été réalisées par imagerie puits multiples simultanément. La taille de la fenêtre pour PIV a été 32 pixels avec un chevauchement de 16. La barre d’échelle est 32 µm. Ce chiffre a été modifié par Bastounis et Theriot59. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Préparer les hydrogels PA sur une plaque de 24 puits (voir étape 1). Graines HMEC-1 (voir étape 2) les cellules et les infecter avec JAT983 comme décrit ci-dessus (voir étape 3).
  2. Préparer un support live-microscopie en complétant L-15 de Leibovitz avec 10 % sérum de veau fœtal, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique et 1 hydrocortisone μg/mL.
    Remarque : Le L-15 contient déjà les 2 mM de L-glutamine, n’est pas nécessaire d’ajouter extra comme dans le cas des médias CMPD-131.
  3. 4 h après l’infection (démarrage de la JAT983 intériorisée fluorescence), mélanger 1 μL de 1 mg/mL colorant Hoechst avec 1 mL de médias complet L-15 et l’ajouter à chaque puits pour colorer les noyaux des cellules. Placer les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 10 min et replacez-les dans chaque puits le support complet de L-15 avec 1 mL de médias complet L-15 additionné de 20 µg/mL de gentamicine.
  4. Couverture de la plaque avec son couvercle et sa place dans l’enceinte du microscope (voir Table des matières) équilibré à 37 ° c.
    Remarque : Pour l’imagerie, utiliser un microscope à épifluorescence inversé avec une caméra CCD (voir Table des matières) et a 40 X objectif air air plan fluorite avec 0,6 na
  5. Acquérir des images Time-lapse multi-canal des perles fluorescentes et les bactéries fluorescentes et images de contraste de phase des cellules de l’hôte, toutes les 10 min pendant 4 à 12 h.
    Remarque : Pour l’imagerie, la puissance a été fixée à 25 % et la durée d’exposition à 100 m les filtres de microscope (excitation/émission) utilisés pour mCherry et GFP sont 470/525 nm et 530/645 nm respectivement.
  6. À la fin de l’enregistrement, ajouter 500 µL de 10 % dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l’eau dans chacun des puits.
    Remarque : Les cellules seront détachées de l’hydrogel et l’hydrogel retournera à son état initial, non déformée car elle est élastique.
  7. Prendre une image de l’hydrogel et l’utiliser comme image de référence non déformée.
  8. Déterminer la déformation bidimensionnelle de l’hydrogel à chaque instant du temps à l’aide de particle image velocimetry (PIV)31, comparant chaque image de la série Time-lapse avec l’image de référence de l’hydrogel non déformée. Utiliser les tailles de fenêtre appropriée et se superposent selon l’expérience.
    NOTE : Nous avons utilisé windows de 32 pixels avec un chevauchement de 16 pixels.
  9. Calculer les contraintes de traction 2D que cellules exercent sur l’hydrogel comme décrit ailleurs32,33.
  10. Calculer la tension de la monocouche des contraintes de traction comme décrit plus haut34 en résolvant les équations d’équilibre mécanique pour une plaque mince élastique sous réserve des forces de réaction créée par l’hydrogel PA sur la monocouche, qui sont d’une en face de signe pour les contraintes de traction mesurées.
    Remarque : Voir matériel supplémentaire 1.

7. quantitative Microscopy Time-lapse pour évaluer Extracellular matrix-rigidité dépendant de L. monocytogenes diffusion à travers les cellules endothéliales

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Figure 6: données de Time-lapse microscopie quantitative de diffusion Lm par HMEC-1 monocouches ensemencés sur des substrats avec raideur 3-kPa et 70-kPa. A. ce panneau montre encore des images de deux foyers d’infection représentant à 0, 200, 400 et 600 min. Le canal de phase représente les monocouches de cellules HMEC-1, et le canal rouge représente Lm intracellulaire (voir étape 7 du protocole). B. ce panneau montre la zone de l’enveloppe convexe qui englobe la mise au point d’infection tracée en fonction du temps. Le domaine d’intervention de l’État 3-kPa (rouge) croît plus rapidement que celle de la 70-kPa (vert). C. ce tableau montre que la distance radiale du centre jusqu’au bord de la mise au point d’infection tracées en fonction du temps pour représentant des foyers d’infection de plus en plus les monocouches HMEC-1 ensemencés sur des substrats de PA 3-kPa (rouge) et de la rigidité de la 70-kPa (vert). La vitesse radiale (dr/dt) est constante pour la condition 3-kPa, mais biphasique de la condition de 70-kPa. D. ces données montrent la vitesse radiale pour les 200 premières min de dix foyers d’infection indépendant. Le rouge (3-kPa) et vert (70-kPa) points de données représentent les pentes des deux foyers décrits dans les tableaux précédents. Les barres horizontales représentent la moyenne de données. La P-valeur est calculée avec le test de Wilcoxon grade somme non paramétrique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. Préparer les hydrogels PA sur une plaque de 24 puits (voir étape 1), semences cellules HMEC-1 (voir étape 2) et se développer pendant la nuit JAT983 cultures comme décrit plus haut (voir étape 3).
  2. Le jour de l’infection, préparer le mélange de l’infection en mélangeant 10 µL de pellet bactérienne par mL de médias complet CMPD-131. Retirez délicatement les médias des puits des plaques 24 puits et ajouter 1,9 mL des médias complets CMPD-131 et 0,1 mL du mélange bactérien dans chaque puits.
    Remarque : Le MOI inférieur utilisé dans cet essai est nécessaire pour analyser les événements de diffusion qui commencent à partir d’une seule bactérie envahir une cellule hôte.
  3. Couvrir la plaque avec son couvercle et sceller avec une pellicule de plastique pour éviter les fuites. Placer les plaques dans la centrifugeuse et essorer les échantillons pendant 10 min à 200 x g pour synchroniser l’invasion.
  4. Déplacer les plaques dans l’incubateur de culture de tissus et les incuber pendant 5 min.
  5. Laver les échantillons 4 x avec les médias et les déplacer dans l’incubateur de culture de tissus. Après un 5-7 min supplémentaire, remplacez les médias médias additionné de 20 µg/mL de gentamicine.
  6. Incuber la plaque dans l’incubateur pour un supplément de 5 h pour permettre au promoteur de l’actA d’allumez et conduire l’expression de la mTagRFP open reading frame35.
  7. Préparer un support live-microscopie en complétant L-15 de Leibovitz avec 10 % sérum de veau fœtal, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique et 1 hydrocortisone µg/mL.
    Remarque : Le L-15 contient déjà les 2 mM de L-glutamine, n’est pas nécessaire d’ajouter extra comme dans le cas des médias CMPD-131.
  8. Mélanger 1 μL de 1 mg/mL Hoechst teindre avec 1 mL de médias complet L-15 et l’ajouter à chaque puits pour colorer les noyaux des cellules. Placer les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 10 min et replacez-les dans chaque puits le support complet de L-15 avec 1 mL de médias complet L-15 additionné de 20 µg/mL de gentamicine. Couverture de la plaque avec son couvercle et sa place dans l’enceinte du microscope (voir Table des matières) équilibré à 37 ° c.
    Remarque : Pour l’imagerie, un microscope à épifluorescence inversé a été utilisé avec une caméra CCD (voir Table des matières) et un 20 X objectif air air plan fluorite avec 0,75 na La puissance a été fixée à 50 % et la durée d’exposition à 50 m les filtres de microscope utilisés pour mCherry sont 470/525 nm pour l’excitation et d’émission respectivement.
  9. Image de postes multiples à l’aide d’une fonction autofocus pour surveiller comment Lm se propage par les monocouches HMEC-1 toutes les 5 min ensemencés sur des hydrogels de rigidité.
    Remarque : L-15 est tamponnée avec HEPES, n’est pas nécessaire d’utiliser le CO2 au cours de l’imagerie.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sensibilité de raideur dépendante de ECM des cellules HMEC-1 à l’infection de Lm :
PA hydrogels de raideur variable, tout revêtu de collagène I, ont été construits sur les plaques de fond verre multipuits comme décrit dans l’étape 1 du protocole (voir Figure 1). AFM mesures ont été effectuées pour confirmer la rigidité exacte de l’hydrogel, comme décrit plus haut26,27 (voir Figure 2). Des études antérieures ont montré que la conformité locale de la membrane basale des cellules endothéliales peut varier de 1 kPa (par exemple, le tissu cérébral) à 70 kPa (p. ex., aorte)36,37,38, 39 , 40. par conséquent, nous avons choisi de tester l’infection de cellules HMEC-1 résidant sur des matrices avec la rigidité suivante : 0,6 kPa kPa 3, 20 kPa et 70 kPa. Pour chaque raideur hydrogel, six hydrogels ont été fabriqués afin d’évaluer la reproductibilité des résultats.

Cytométrie en flux a été utilisée pour évaluer la vulnérabilité de la raideur dépendante ECM de cellules HMEC-1 à l’infection de Lm (voir Figure 3). Cellules HMEC-1 ont été infectés par une souche de Lm (JAT985) qui exprime un marqueur fluorescent après internalisation (actAp::mTagRFP), ce qui permet la détection des bactéries intracellulaires uniquement (voir Figures 1 L - 1N). JAT985 manque également d’ActA, désactiver les bactéries de se propager de cellule en cellule, ActA étant nécessaire pour la formation de queues de comète d’actine et de la diffusion bactérienne ultérieure. 7 - post-infection 8 h, l’infection des cellules HMEC-1 a été évaluée à l’aide de cytométrie en flux. Afin d’assurer l’analyse des cellules individuelles, la majeure partie de la distribution du nombre de cellules a été contrôlée à l’aide de l’attaquant contre le nuage de points côté, et puis une deuxième étape de blocage a été effectuée pour exclure les cellules qui présentent l’autofluorescence (voir Figures 3 a - 3C ). Les résultats préliminaires, représentés à la Figure 3 montrent que l’infection HMEC-1 LM est environ deux fois plus élevé pour les cellules HMEC-1 résidant sur les hydrogels de kPa 70 raide par rapport aux cellules résidant sur les hydrogels de kPa 0,6 soft (voir Figures 3 b - 3D). la susceptibilité d’infection Lm accrue des cellules HMEC-1 résidant sur raide par rapport aux matrices douces pourrait être dû à : 1. augmenté l’adhérence Lm HMEC-1 ; 2. une invasion de Lm dans HMEC-1 ; ou 3. ces deux la ci-dessus qui se. Pour tester qui détient de l’hypothèse, cellules HMEC-1 ont été ensemencées sur soft (3 kPa) et raide (70 kPa) hydrogels et infectés par constitutivement GFP exprimant Lm (voir Figures 4 a - 4C). Les échantillons ont été fixés en peu de temps après l’infection et les bactéries (adhérentes) externes ont été colorées avec les anticorps. À l’aide de la microscopie quantitative, nous avons constaté qu’il y a beaucoup plus de bactéries adhérant au CEMH-1 lorsque les cellules hôtes résident sur raide par rapport aux gels douces (voir Figure 4D). Compatible avec les données de cytométrie de flux, il y a beaucoup plus de bactéries internalisés par HMEC-1 lorsque les cellules hôtes résident sur raide par rapport aux gels douces (voir Figure 4E). Cependant, l’efficacité d’invasion (bactéries intériorisé/nombre total de bactéries) de Lm en cellules HMEC-1 est similaire, quelle que soit la rigidité de substrat (voir Figure 4F).

Microscopie de force de traction des cellules infectées par Lm HMEC-1 :
L’infection des cellules HMEC-1 LM pourrait altérer la biomécanique des cellules de l’hôte infecté, y compris la force de l’attachement entre elles, ou à leur ECM qui affectent l’intégrité de la barrière. Nous avons cherché à déterminer si cela pourrait être le cas à l’aide de la microscopie à Force Traction32 pour calculer les forces de traction de cellule-ECM et monocouche Stress microscopie41 pour calculer les forces de tension intracellulaires. Figure 5 illustre les cartes de la champ de déformation, champ de contraintes de traction et champ de tension intracellulaire des cellules HMEC-1 résidant sur 20-kPa hydrogels à des temps différents points suivant l’infection. Figures 5 a - 5D faire référence aux cellules non infectées contrôle HMEC-1 tout en chiffres 5E - 5 H Voir le HMEC-1 cellules infectées avec Lm à une multiplicité d’infection égale à 300 bactéries/cellule. Ce travail préliminaire suggère que les cellules infectées HMEC-1 réduisent l’ampleur de leur cellule-ECM et contraintes intracellulaires au cours d’une infection avec Lm, alors que n’est pas observée pour les cellules contrôles sains.

ECM raideur dépendante Lm diffusion à travers les monocouches HMEC-1 :
Time-lapse microscopie a été utilisée pour étudier l’effet de la rigidité de la matrice a sur la diffusion de Lm à travers les monocouches HMEC-1. Comme Lm se répand par le biais de la monocouche, les bactéries créent un foyer d’infection qui se développe en fonction du temps (voir Figure 6A et vidéo Figures 1 et 2). Le domaine de la mise au point d’infection a été mesuré en dessinant une forme convexe, le plus petit polygone convexe qui englobe un ensemble de points, autour de la bactérie42. Il n’y a aucun standard métrique dans le champ pour mesurer l’efficacité de la propagation de cellule à cellule de L. monocytogenes à travers une monocouche de cellules de l’hôte. Afin d’évaluer l’efficacité de la propagation, certains ont compté le nombre de cellules de l’hôte dans une infection mise au point41, et d’autres ont des limites dessinées manuellement autour du groupe de l’infection de cellules hôtes43. Nous avons choisi dessiner un polygone convexe autour de la bactérie, car c’est un processus automatisé, cohérent et par le calcul peu coûteux pour mesurer l’efficacité de la propagation de L. monocytogenes . Ce faisant, nous avons trouvé une légère baisse dans la zone de mise au point d’infection dans les HMEC-1 cellules ensemencées sur 70 kPa hydrogels comparativement à ceux ensemencés sur 3 matrices kPa (voir Figure 6B et vidéo Figures 1 et 2). Pour déterminer le taux de croissance de la mise au point d’infection, la distance radiale a été tracée en fonction du temps en prenant la racine carrée de la superficie de la mise au point d’infection et en divisant le résultat par pi. Cette transformation mathématique suppose que la forme de la mise au point d’infection est à peu près circulaire44. Pour mesurer la vitesse de la croissance de la mise au point, on a mesuré la vitesse du changement (c'est-à-dire, la pente) de la distance radiale pour les deux matrices 3 - et 70-kPa. Cette approche élucidé que le foyer d’infection a augmenté plus rapidement et de façon monotone dans HMEC-1 cellules ensemencées sur matrices 3-kPa. Toutefois, l’accent a augmenté significativement plus lent (premier 200 min) et un peu plus lent (200 à 600 min) dans les cellules ensemencées sur matrices 70-kPa (voir Figure 6C). En effet, l’analyse des données complémentaires ont confirmé que le foyer d’infection a augmenté en moyenne, deux fois plus lentement dans les 70 kPa matrices, surtout durant les premières min 200 (voir la Figure 6D).

figure-results-1
Figure 3 : Sensibilité de raideur dépendante ECM des cellules HMEC-1 à l’invasion de Lm mesurée par cytométrie .  Cellules HMEC-1 étaient infectés par Lm (JAT985) et l’infection a été analysée par cytométrie en flux. A. ce panneau montre un côté contre le nuage vers l’avant pour représentant HMEC-1 cellules provenant d’un puits unique. La distribution en vrac de cellules a été sélectionnée par déclenchement pour pallier les débris (à gauche) et de cellules doublets ou triplets (à droite). B. ce graphique montre un histogramme du logarithme de l’intensité de fluorescence Lm par cellule pour HMEC-1 plaqué sur doux 0,6 kPa. C. ce graphique montre un histogramme du logarithme de l’intensité de fluorescence Lm par cellule pour HMEC-1 plaqué sur rigide 70 kPa hydrogels. Les histogrammes pour N = 4-6 répétitions apparaissent en différentes couleurs. Histogramme des cellules témoins non infectés est violet. La porte permettant de définir ce qui est infecté est indiquée en rouge. Ministère de l’intérieur est de 100, et l’infection a été évaluée à 8 h après l’infection. D. données indiquent le pourcentage de cellules infectées de HMEC-1 contre la rigidité de l’hydrogel (N = 5). Les barres horizontales représentent la moyenne de données. La P-valeur est calculée avec le test de Wilcoxon grade somme non paramétrique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 1de la vidéo : diffusion intracellulaire LM (canal rouge) à travers une monocouche de cellules HMEC-1 (phase) ensemencées sur un substrat kPa-3. Les cellules ont été photographiés dans les médias L-15 de Leibovitz (10 % FBS, 20 µg/mL de gentamicine) à l’intérieur une chambre environnementale équilibrée à 37 ° c. Les images ont été recueillies toutes les 5 min. La vitesse de film est de 15 images/s. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

figure-results-3
Vidéo Figure 2: diffusion de Lm intracellulaire (canal rouge) à travers une monocouche de cellules HMEC-1 (phase) ensemencées sur un substrat de 70-kPa. Les cellules ont été photographiés dans les médias L-15 de Leibovitz (10 % FBS, 20 µg/mL de gentamicine) à l’intérieur une chambre environnementale équilibrée à 37 ° C. Les images ont été recueillies toutes les 5 min. La vitesse de film est de 15 images/s. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Module de Young (E, kPa)% D’acrylamide (de 40 % stock)Bisacrylamide % (à partir de 2 % stock)
0,630,045
350,075
10100,075
2080,195
70100,45

Tableau 1. Composition des hydrogels de polyacrylamide (PA) de rigidité variable. Dans ce tableau, le pourcentage de solution mère d’acrylamide 40 % et le pourcentage de stock de bis-acrylamide solution à 2 % pour atteindre une raideur donnée (module de Young, E) sont indiqués dans les différentes colonnes.

figure-results-4
Matériel supplémentaire 1. Calcul de la tension intracellulaire de contraintes de traction calculée. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules peuvent détecter une variété de signaux environnementaux physiques, ce qui peut affecter non seulement la morphologie des cellules, mais aussi leur expression et protéine activité génétique, affectant ainsi la cellule critique des fonctions et des comportements de45,46. La rigidité de l’ECM de cellules est plus en plus appréciée comme modulateur important de motilité cellulaire, différenciation, prolifération et finalement cellule sort47,48,49. Bien qu’il y a eu beaucoup de progrès récents dans la compréhension de l’interaction biomécanique complexe entre les cellules et leur ECM, peu est connu sur la rigidité environnementale affecte la sensibilité des cellules aux infections bactériennes. Pour faciliter ces études, nous avons développé ce nouveau dosage multipuit basé sur la fabrication bien établie de polyacrylamide hydrogels de rigidité ajustable qui est compatible avec une infection dosages50. Traditionnellement, une infection bactérienne de cellules en culture de tissus a été étudiée sur verre ou polystyrène qui sont environ 1 à 3 ordres de grandeur plus rigides que l’ECM naturel des plus adhérentes cellules8,51. L’essai décrit ici ouvre des nouvelles routes en permettant l’étude des interactions hôte-bactéries dans un régime de rigidité environnement physiologiquement pertinents.

Pour preuve de concept de l’analyse présentée, cellules HMEC-1 ont été choisis comme modèle hôte adhérentes cellules et Lm comme un pathogène bactérien de modèle. Cependant, l’essai peut être prolongée pour d’autres études si réduites en conséquence. Ces études peuvent impliquer infection de types cellulaires différents mammifère hôte adhérentes par des agents pathogènes supplémentaires, y compris les bactéries et les virus. Pour ce test particulier, gels étaient protéine-enduit avec collagène I, mais selon le type de cellule hôte, il est possible d’utiliser un revêtement-différent ECM protéines, telles que la fibronectine, laminine ou de faciliter la fixation des cellules hôte d’intérêt sur l’hydrogel 52. une autre considération qui dépend du type de cellule hôte est la gamme de rigidité d’hydrogel à étudier. La gamme de rigidité devrait dépendre de ce qui est physiologiquement approprié pour le type de cellule hôte spécifique et comment bien cet hôte s’attache à former une monocouche à un hydrogel de raideur donnée. De même, selon l’agent pathogène modèle désiré pour être examiné, légères modifications pouvez être amené à mettre en œuvre pour le dosage d’infection décrit ci-après.

L’innovation du dosage par rapport aux méthodes précédentes pour fabrication de polyacrylamide hydrogels24,50,53 réside dans certaines caractéristiques uniques intégrés dans l’analyse proposée de l’infection. Tout d’abord, les hydrogels sont construites sur des plaques de fond verre multipuits, qui permet la projection de plusieurs conditions en même temps ainsi que l’automatisation de certaines procédures. Surveillance des conditions multiples au même moment ou examen multiple replications est cruciale étant donné que le résultat d’une telle approche peut être influencé par des facteurs tels que le passage de cellule hôte et le nombre exact de bactéries ajoutées à infecter des hôtes, qui changent souvent entre expériences indépendantes. Une fonction supplémentaire unique de ce test est que les hydrogels ont une hauteur d’environ 40 µm, qui est suffisamment mince pour l’image à l’aide de la microscopie conventionnelle. Nous avons montré que nous pouvons effectuer avec succès tant microscopie des cellules vivantes et la fixation cellulaire et immunostaining suivie d’imagerie, sans introduire de fluorescence de fond élevé. Enfin, les hydrogels sont faites de deux couches, avec celle du haut ayant incorporé des microsphères fluorescentes, confinés dans un seul plan focal. Cet attribut fait en sorte qu’il n’y aura aucune lumière d’out-of-focus interférer en imagerie. La présence des perles permet les deux l’examen de la topographie de surface des gels pour s’assurer qu’ils sont uniformes et améliore les performances des TFM et MSM24,32,41. Avec TFM et MSM, il est possible de calculer les forces ECM-cellule et cellule-cellule respectivement des cellules résidant sur des matrices de rigidité. En utilisant ce nouveau dosage, il est possible de faire ces mesures de forces physiques en comparant les deux la contribution de rigidité environnementale et de l’infection en même temps. Suite à une telle approche, l’infection de l’effet a sur la cellule-hôte mécanique tout au long de son parcours peut être déterminée. En outre, l’évolution des contraintes intracellulaires des cellules peut être calculée à l’aide de MSM et peut être utilisée comme une mesure de l’intégrité de la barrière de la monocouche. Enfin, étant donné la nature multipuite du dosage, il est possible d’introduire en même temps des perturbations génétiques et pharmacologiques avec une infection bactérienne, d’étudier plus en profondeur les interactions complexes entre la mécanique de cellule hôte et l’infection.

Une limitation inhérente de la technique réside dans la rigidité de substrat effet pourrait avoir sur le taux de prolifération des cellules. En général, lors d’essais de l’infection, il faut veiller à ce que la densité cellulaire de l’hôte dans des conditions différentes est le même. C’est parce que la densité des cellules en soi peut avoir un effet sur la susceptibilité des hôtes à l’infection. Les cellules HMEC-1 qui ont été utilisées comme cellules de l’hôte ne présentent pas une différence significative de leur nombre, lorsque les graines pendant 24 h sur les hydrogels. Cependant, différents types de cellules peuvent présenter la prolifération différentielle, en fonction de la rigidité de l’hydrogel, qui peut biaiser les études d’infection. De même, partialité de l’infection peut survenir lorsque les cellules ne forment pas de monocouches ou n’attachent pas bien sur les hydrogels, comme cela se produit lorsque certains types de cellules sont ensemencées sur des matrices très douces (par exemple, les cellules endothéliales humaines du cordon ombilical ou Madin-Darby canine kidney cellules épithéliales boutonnée sur 0,6-kPa hydrogels54,55). Comme agents pathogènes sont concernés, certaines bactéries (p. ex., Borrelia burdgorferi) peuvent fixer sur cellules hôtes et envahir leur mais peut également transmigrer à travers eux56. Nous n’avons pas encore testé si ce dosage fonctionnerait pour les études de transmigration pathogène, mais il semble possible, étant donné que les études antérieures sur les neutrophiles transmigrant cellules endothéliales ensemencées sur hydrogels de PA ont été documentés pour travailler avec succès57. Il y a eu beaucoup d’études menées en montrant comment fabriquer des hydrogels de polyacrylamide d’une donnée d’Young en mélangeant les concentrations appropriées d’acrylamide et bis-acrylamide24,25,26 ,,27. Cependant, surtout lorsqu’on désire réaliser des expériences TFM sur cellules résidant sur hydrogels de raideur variable, il est essentiel de confirmer la rigidité attendue des hydrogels par AFM ou autres techniques de mise en retrait58. Légères déviations par rapport à la valeur attendue peuvent découler d’un autre solvant utilisé ou une solution mère d’acrylamide âgés, ou par les voies AFM, les mesures sont effectuées (par exemple, la forme de la pointe de l’AFM). Enfin, l’approche présentée dans la présente est issu des cellules hôtes sur matrices 2D, qui peuvent différer d’un scénario 3D plus réaliste et physiologiquement pertinent de l’ensemencement. Toutefois, fabrication gels 3D avec rigidité ajustable, les semis avec les cellules hôtes et puis les infecter par des agents pathogènes, toujours comprend certaines difficultés techniques. Néanmoins, nous prévoyons que dans un avenir proche, nous serons en mesure d’étendre le dosage en cours pour l’étude de l’infection dans un cadre 3D.

Pour résumer, le protocole décrit ainsi que les résultats préliminaires démontrent que ce nouveau dosage peut devenir un outil extrêmement utile pour l’étude de l’infection des cellules-hôtes adhérentes avec les bactéries pathogènes de façon quantitative et beaucoup plus physiologiquement pertinent environnement que précédemment examinés. La puissance de fabrication de polyacrylamide hydrogels dans la configuration proposée réside en ce que le dosage est compatible avec l’exécution de plusieurs techniques comme la cytométrie en flux, immunomarquage suivie par microscopie optique et microscopie à force traction. Le test peut être utilisé pour les études concernant l’infection de types cellulaires différents hôtes adhérentes par des agents pathogènes, que nous prévoyons aura un impact significatif dans les deux démêler les stratégies par lesquelles pathogènes infectent des hôtes et en facilitant le développement de interventions thérapeutiques contre les infections.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos remerciements à M. pied de page, R. Lamason, M. Rengaranjan et les membres du laboratoire Theriot pour leurs discussions et la prise en charge expérimentale. Ce travail a été soutenu par les NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), la bourse de Gilliam HHMI pour Advanced Study (F.E.O.), le Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) et l’Association américaine de coeur (E.E.B.). Cytométrie en flux a été effectuée à l’installation de FACS partagé de Stanford.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
s forts
Pastilles d’hydroxyde de sodiumFisherS318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilaneSigmaA3648
25 % gluteraldéhydeSigmaG6257-100ML
40 % acrylamideSigmaA4058-100ML
Solution de bis-acrylamide (2 % p/v)Fisher ScientificBP1404-250
Fluorosphères microsphères modifiées au carboxylate, 0,1 &mu ; m, jaune-vert fluorescent (505/515)InvitrogenF8803
Persulfate d’ammoniumFisherBP17925
TEMEDSigmaT9281-25ML
Sulfo-SANPAHProteochemc1111-100mg
Collagène, Type I Solution de ratSigmaC3867-1VL
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)J.T. Baker9224-01
HEPES, Acide libreJ.T. Baker4018-04
Milieu Leibovitz’s L-15, sans rouge de phénolThermofischer21083027
Milieu MCDB 131, sans glutamineLife technologies10372019
Foundation Sérum de veau fœtal, Lot : A37C48AGemini Bio-Prod900108 500ml
Facteur de croissance épidermique, EGFSigmaE9644
HydrocortisoneSigmaH0888
L-Glutamine 200mMFisherSH3003401
DPBS 1XFisherSH30028FS
Gentamicinsulfate MP biomedicals194530
CloramphénicolSigmaC0378-5G
DifcoTM Agar, GranuléBD214530
BBL TM Perfusion cerveau-cœurBD211059
Hoechst 33342, chlorhydrate trihydraté - solution à 10 mg/ul dans l’eauInvitrogenH3570
Formaldéhyde 16 % EM gradeMicroscopie électronique15710-S
Anticorps anti-Listeria monocytogenesAbcamab35132
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, Alexa Fluor® ; 546 conjuguéThermofischerA-11035
0,25 % trypsine-EDTA , rouge de phénolThermofischer25200056
COLLAGÉNASE DE CLOSTRIDIUM HISTOLYTIQUESigmaC8051
Sulfate de streptomycineFisher Scientific3810-74-0
SaccharoseCalbiochem8510
Dodécylsulfatede sodiumThermofischer28364
MES poudreSigmaM3885
KClJ.T. Baker3040-05
MgCl2J.T. Baker2444-1
EGTAAcros40991
Matériel de laboratoire jetableverre circulaire 12
mm lamellesFisherbrand12-545-81n° 1.5 Lamelles | 10 mm Diamètre du verre | Fond en verre non revêtu
24 plaques àMattekP24G-1.5-13-F
Tubes en polystyrène de 5 ml avec un 35 &mu ; Capuchon de crépine à cellules M  ;Falcon352235
T-25 FlaconsFalcon353118
50 ml Tubes coniquesFalcon352070
15 ml Falcon352196
Pipettes sérologiques jetables (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)Falcon357551
Pasteur Pipettes en verreVWR14672-380
Pointes de pipette (1-200 &mu ; l, 101-1000 &mu ; l)DenvilleP1122, P1126
Gants d’examen non poudrésMicroflexXC-310
Cuvettes bactériesSarstedt67.746
RasoirsVWR55411-050
Aiguille à seringueBD305167
0.2um bouteilles de stérilisationThermo Scientific566-0020
20 ml seringuesBD302830
0.2um filtresThermo Scientific723-2520
bâtonnets en boisGrainger42181501
Saran wrapSanta Cruz Biotechnologiessc-3687
Plaques bactériesFalcon351029
Matériel de laboratoire grand/non jetable
Hotte de culture tissulaireBakerSG504
HémacytomètreSigmaZ359629
Incubateur de bactériesThermo ScientificIGS180
Incubateur de culture tissulaireNuAireNU-8700
Microscope à épifluorescence inversé Nikon Diaphot 200NikonNIKON-DIAPHOT-200
Incubateurà cage HaisonCustom
Scanford FACIScan analyzer  ;Stanford et Cytek ont mis à niveau FACScanCustom
Pipette AidDrummond4-000-110
Pipettors (10 &mu ; l, 200 &mu ; l, 1000ul)GilsonF144802, F123601, F123602
pH-mètreMettler Toledo30019028
pinceFST11000-12
1 L flaconFisherbrandFB5011000  ;
AutoclaveAmsco3021
Plaque magnétique d’agitationBellco7760-06000
Barres d’agitation magnétiquesBellco1975-00100
SpectrophotomètreBeckmanDU 640
Analyseur FACScan ScanfordCytek BiosciencesPersonnalisé Stanford et Cytek FACScan
< Logiciel > fort
Logiciel de microscope (&mu ; Gestionnaire)Open Imaging
MatlabMatlab Inc
FlowjoFlowJo, LLC
Logiciel d’analyse d’images automatisé, CellChttps://sites.google.com/site/cellcsoftware/Le logiciel est disponible gratuitement. Les fichiers exécutables et les codes sources MATLAB peuvent être obtenus à l’adresse https://sites.google.com/site/cellcsoftware/
puits amélioré

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