Haute sensibilité détection des micrométastases générés par GFP Lentivirus-transduites organoïdes cultivé à partir d’une tumeur du côlon dérivé de Patient

Résumé

Pour permettre une détection très sensible de la diffusion du cancer colorectal humain cellules (CRC) qui colonisent les tissus, nous montrons ici un protocole pour la transduction efficace des Particules Lentivirales protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules organoïde CRC PDX-dérivés avant leur injection à des souris bénéficiaires, avec l’observation au microscope stéréo-fluorescence.

Résumé

Malgré les progrès actuels dans le traitement du cancer colorectal humain (CRC), quelques traitements radicaux sont appliquent aux derniers stades du CRC. Pour surmonter ce défi clinique, les modèles de souris de xénogreffes tumorales utilisant longtemps lignées de cellules de carcinome humain et de nombreux modèles de souris transgéniques présentant des tumeurs ont été développés dans des modèles précliniques. Partiellement imiter les caractéristiques des carcinomes humaines, ils omettent souvent de récapituler les principaux aspects des malignités humaines y compris l’invasion et la métastase. Ainsi, des modèles alternatifs qui représentent mieux la progression maligne dans CRC humaine ont longtemps été attendus.

Nous montrons dans la présente génération de xénogreffes tumorales dérivées de patient (PDXs) par l’implantation sous-cutanée de petits fragments CRC chirurgicalement découpé d’un patient. Le colon PDXs développer et examen histopathologique ressemblent à la CDE chez le patient. Cependant, quelques micrométastases spontanées sont détectables dans les coupes classiques des organes éloignés touchés dans le modèle PDX. Afin de faciliter la détection d’une dissémination métastatique dans des organes éloignés, nous organoïde cellules tumorales extraites des PDXs du côlon en culture et infectés par le lentivirus GFP avant injection dans fortement immunodéprimé Shi-NOD/scid IL2Rγ null Souris (NOG). Orthotopically injecté PDX-dérivé CRC organoïde cellules constamment forme tumeurs primaires positifs pour GFP chez les bénéficiaires. En outre, spontanément au point micrometastatic colonies exprimant GFP sont notamment détectés dans les poumons de ces souris par microscopie de fluorescence. Par ailleurs, l’injection intra-splénique de CRC organoïdes produit fréquemment colonisation hépatique. Pris ensemble, ces résultats indiquent GFP-étiqueté des cellules dérivées de PDX CRC organoïde d’être visuellement détectable au cours d’un processus multipas appelle la cascade d’invasion-métastase. Les protocoles décrits incluent l’établissement de PDXs de CDE humaine et de la culture 3D des correspondants CRC organoïde cellules transduites par Particules Lentivirales GFP.

Introduction

Cancer colorectal (CCR) est la deuxième cause de cancer décès dans le monde¹. Une réponse insuffisante à des thérapies conventionnelles des patients atteints de la maladie de stade avancé indique l’inefficacité des tentatives pour guérir radicalement Croix-Rouge canadienne. Pour développer des approches thérapeutiques plus efficaces, divers modèles de souris préclinique du cancer qui imitent les caractéristiques du CRC ont été établis. Diverses lignées cellulaires CRC ont été largement utilisées pour générer des xénogreffes tumorales en raison de leur commodité et facilité de manipulation. Culture à long terme des lignées de cellules cancéreuse....

Protocole

Le patient fourni le consentement éclairé et le projet a été approuvé par le Comité d’éthique de recherche de la faculté de médecine de l’Université Juntendo. Les expériences de souris ont également été approuvées par le Comité d’éthique de recherche animale de la faculté de Juntendo de médecine.

1. création de PDXs CRC dans des souris immunodéficientes

Les procédures expérimentales pour établir la CRC PDXs (étape 1) sont décrites dans la Figure 1 a.

1. Préparer le tissu CRC primaire immédiatement après résection chirurgicale de la tumeur du patient.
2. Laver le tissu p....

Résultats

Un primaire adénocarcinome colorectal diagnostiqué comme modérément différencié avait été réséqué chirurgicalement d’une femme de 76 ans avec classification TNM, stade IIIa, suivie d’une chimiothérapie post-opératoire. L’immunohistochimique de cellules primaire CRC teinté positif pour l’antigène carcino-embryonnaire, Ki-67, pan-cytokératine et E-cadhérine. Pièces de la tumeur réséquée étaient également par voie sous-cutanée implantés dans souris NOG pour générer le modèle PDX de côlon. Le.......

Discussion

Bien que le modèle CRC PDX a été largement utilisé pour étudier la croissance de la tumeur primitive, si ce modèle s’applique également à une enquête sur les métastases tumorales n'a pas encore été complètement élucidé. Métastases spontanées étaient également à peine détectables dans le foie et les poumons des divers rapportés du côlon PDX modèles^4,10. Pour détecter les micrométastases à haute sensibilité, nous avons développé un protocole pour la transduction de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris NOD/Shi-scid IL2R&gamma ; null (NOG)	Institut central pour les animaux expérimentaux, Kanagawa, Japon		Race Souris mâles de 6 semaines dans des conditions exemptes de germes et exemptes d’agents pathogènes spécifiques
clips de plaie 2&fois ; 10mm	Natsume fabrication, Japon	#C-21-S	Autoclave avant utilisation
Hamilton seringue taille de l’aiguille : calibre 22	Tokyo Science, Japon		Désinfecter avec 70 % d’alcool et PBS stérile.
Plaque 6 puits	BMBio	#92006
Plaque 12 puits	BMBio	#92412
Tube conique 15ml	Sumitono Bakelite	MS-57150
Tube conique 50ml	Sumitomo Bakélite	MS-57500
microtube	Eppendorf	#0030120086	Autoclave avant utilisation
Hémocytomètre	Erma	#03-202-1
40&mu ; Matrice
Stocker			les aliqupts à -20° ;C. Placer sur de la glace jusqu’à utilisation
Collagénase type 1	Sigma	#C1030	150 mg/ml de collagénase type1 en 1&fois ; PBS. Stocker les aliqupts à -20° ; C pour une durée maximale de 1 an
Accutase	Innovate Cell Technologies	#5V2623A	Magasin à 4° ;C.
DMEM/F-12 avec GlutaMAX&trade ;	Gibco	#10565018	Magasin à 4°C. Chaud à 37°C C avant l’utilisation
Cell banker 1plus	ZENOAQ	#628	Conserver à 4° ;C. Utiliser dans un délai de 1 mois
Pénicilline	Gibco	#15140122	Conserver à 4° ;C. Utiliser dans un délai de 1 mois
Streptomycine	Gibco	#15140122	Conserver à 4° ;C. Utiliser dans un délai de 1 mois
hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	Conserver à -20° ;C. Ajouter au moyen le même jour que l’utilisation
Y27632, un inhibiteur de ROCK	Wako	#253-00591	Conserver à -20° ;C. Ajouter au milieu le le même jour que l’utilisation
Milieu de culture	Gibco		DMEM/F-12 avec GlutaMAX&trade ; supplément complété par 5 % FBS, 100 U/ml de pénicilline et 100 µ ; g/ml streptomycin. Conserver à 4° ;C. Utiliser dans un délai de 1 mois.
Milieu de culture organoïde CRC avec 1 % ou 5 % de FCS			DMEM/F-12 avec supplément GlutaMAX&trade ; (Gibco #10565018) complété par 1 % ou 5 % de FCS, 100 U/ml de pénicilline, 100 µ ; g/ml de streptomycine, 2 ng/ml hEGF et 10 & micro ; M Y27632, un inhibiteur de ROCK. Magasinez à 4° ;C. Utilisation dans un délai de 1 mois.
le régent de transfection FuGENE 6	Roche	11814 443001
Minisart 0.45 & micro ; Filtre m	Sartorius stedim	17598-K
5 ml Tubes à centrifuger en polypropylène	Beckman Coulter	326819
PRRL-GFP vecteur	Don du Dr Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G	Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr	Cadeau de l’Ofs
oscillant SW55Ti rotor	Beckman Coulter
un microscope à stéréofluorescence Zeiss Axioplan 2	Zeiss

de membrane basale Matrigel Corning#354234 D’emblée