RNA liste déroulante procédure pour identifier les cibles ARN d’un ARN Long Non codantes

Résumé

Cette méthode de menu déroulant RNA permet d’identifier les cibles de RNA d’un ARN long non codantes (lncRNA). Basé sur l’hybridation du fait maison, conçues anti-sens ADN sondes oligonucléotidiques spécifiques à cette lncRNA dans un tissu convenablement fixe ou une lignée cellulaire, elle permet efficacement la capture de toutes les cibles de RNA de la lncRNA.

Résumé

Longtemps non codantes RNA (lncRNA), qui sont des séquences de plus de 200 nucléotides sans un cadre de lecture définie, appartiennent à la famille de l’ARN non codants-réglementation. Leurs fonctions biologiques sont encore largement inconnues, le nombre de ces lncRNAs a cessé d’augmenter et on estime aujourd'hui que les humains peuvent avoir plus de 10 000 ces transcriptions. Certains d'entre eux sont connus pour être impliqués dans les voies réglementaires importantes de l’expression génique qui se déroulent au niveau transcriptionnel, mais aussi aux différentes étapes d’ARN co - et de maturation post-transcriptionnelle. Dans ces derniers cas, ARN qui est ciblés par le lncRNA doit être identifiés. C’est pourquoi il est utile d’élaborer une méthode permettant l’identification d’ARN liés directement ou indirectement avec un lncRNA d’intérêt.

Ce protocole, qui a été inspiré par des protocoles précédemment publiés permettant l’isolement d’un lncRNA avec ses séquences de chromatine associées, a été adapté pour permettre l’isolement des ARN associé. Nous avons déterminé que les deux étapes sont essentielles pour le bon fonctionnement du présent protocole. Le premier est la conception de spécifiques anti-sens ADN sondes oligonucléotidiques capables de s’hybrider à le lncRNA d’intérêt. À cette fin, la structure secondaire de lncRNA a été prédite par la bio-informatique et sondes oligonucléotides anti-sens ont été conçus avec une forte affinité pour les régions qui présentent une faible probabilité d’appariements de base interne. La seconde étape cruciale de la procédure s’appuie sur les conditions de fixateur des tissus ou des cellules qui ont pour préserver le réseau entre tous les partenaires moléculaires. Couplé avec le séquençage à haut débit RNA, ce protocole de menu déroulant d’ARN peut fournir l’interactome RNA entier d’un lncRNA d’intérêt.

Introduction

L’objectif global de la méthode décrite ici est d’identifier des partenaires moléculaires RNA d’un ARN long non codant (lncRNA). LncRNA correspondent à des séquences de plus de 200 nucléotides sans un cadre défini de lecture. Certains d'entre eux ont démontré d’être impliqués dans la régulation de l’expression génique, non seulement au niveau transcriptionnel, mais aussi aux différentes étapes d’ARN co - et de maturation post-transcriptionnelle. Dans ces derniers cas, partenaires moléculaires de la lncRNA sont des ARN qui doivent être identifiés. Une méthode permettant l’identification d’ARN liés directement ou indirectement avec un lncRNA d’intérêt serait alors essentielle de développer.

Déjà publié des méthodes, telles que la chromatine Isolation par Purification d’ARN (ChIRP)^1,2 et capturer l’hybridation analyse d’ARN cibles (graphique)^3,4, permettent découverte haut débit de RNA lié aux protéines et accepteurs génomique d’une lncRNA spécifique. Dans ces deux méthodes, la lncRNA d’intérêt a été d’abord hybridé biotinylé oligonucléotides complémentaires, et le complexe a ensuite été isolé à l’aide de perles de streptavidine. La principale différence entre ces deux techniques est liée à la conception des sondes qui ciblent des lncRNAs. ChIRP, la stratégie inspirée par ARN poisson, se composait de la conception d’un bassin de sondes ADN d’oligonucléotides complémentaires courts pour revêtir toute la longueur de la lncRNA. En revanche, graphique, les auteurs ont adapté un essai de cartographie de RNase H sur lncRNAs pour sonder les sites disponibles à l’hybridation.

La procédure proposée ici pour concevoir l’oligonucléotide anti-sens de biotinylé ADN utilise des sondes bio-informatique, modélisation de lncRNA structure secondaire⁵ pour sélectionner des sondes avec une forte affinité pour les régions qui présentent une faible probabilité d’interne l’appariement des bases. Cette procédure a l’avantage d’être moins cher que ceux basés sur les pools de carrelage de sondes oligonucléotidiques² et moins de temps que ceux basés sur la sensibilité de RNAse-H⁴.

Comme il y a un corps croissant d’évidence pour la régulation des gènes post-transcriptionnels de lncRNAs⁶, il est très utile d’élaborer une approche permettant du capturer des ARN qui sont la cible d’un lncRNA. En outre, pour être utilisable pour la plupart des applications, l’approche a été optimisée en cellules cultivées et des extraits de tissus.

Protocole

Toutes les procédures ont été réalisées en stricte conformité avec la Communauté économique européenne pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (86/609/CEE et 63/2010/UE) et sous une licence accordée à D. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, autorisation n° 13-002).

1. conception de la sonde

1. À l’aide de la séquence primaire de la lncRNA d’intérêt, générer sa structure secondaire sur le « RNAstructure Webserver »⁵.
   Remarque : Sur ce site différents algorithmes peuvent être utilisés. Les outils de trois prédiction qui donnent les meilleurs résultats pour les conceptions de la sonde sont : « Fold » (structure de plus basse énergie libre), « MaxExpect » (paires de bases hautement probables) et « Probnot » (probable des paires de base comprenant pseudoknots). Ces trois analyses peuvent être effectuées et comparés. Autres serveurs web, tels que la Vienne RNA websuite⁷, peuvent également être utilisés.
   1. Sélectionnez les régions qui affichent une faible probabilité d’appariements de base interne et conçoivent des sondes oligonucléotides anti-sens de 25 bases avec une forte affinité pour ces régions.
      NOTE : Le contenu en GC de ces sondes devrait être compris entre 40 et 60 %. À l’aide d’un outil de recherche de l’alignement (Blast), assurez-vous que les sondes sélectionnés des oligonucléotides anti-sens ne reconnaissent pas des séquences de nucléotides dans autre ARN exprimées selon le système de cellule choisie.
2. Concevoir également une non-spécifiques oligonucléotide sonde d’ADN de 25 bases qui affiche aucune affinité pour le lncRNA d’intérêt, ni pour les autres séquences de l’ARN du génome d’intérêt.
3. Commander les sondes avec de la biotine à l’extrémité 3'.
   Remarque : Afin de réduire l’encombrement stérique, la distance entre les oligonucléotides et biotine doit être augmentée avec une entretoise de triethyleneglycerol. Pour un résultat optimal et d’être en mesure d’évaluer la spécificité des résultats de la liste déroulante, il est recommandé de conception 3 différentes sondes oligonucléotides anti-sens, puis de comparer expérimentalement leur efficacité.

2. mise en réseau

1. Les cellules cultivées de réticulation
   1. La culture du GH4C1 sommatolactotroph cellules hypophysaires dans F10 additionné du jambon de sérum de cheval 15 % et 2 % de sérum de veau foetal. Développer les cellules jusqu’au confluent en plaques de culture 78,5 cm² . Cela correspond environ à 1 x 10⁷ cellules.
   2. Enlever le milieu de culture cellulaire d’une plaque de culture GH4C1 78,5 cm² confluente, puis rinçage avec 1 x le volume moyen de phosphate solution saline tamponnée (PBS)
   3. Fixer les cellules avec une solution de paraformaldéhyde à 1 % dans du PBS (10 mL pour une vaisselle de² 78,5 cm) ; Cette solution doit être fraîchement préparée à partir d’une solution stock de paraformaldéhyde de 4 %. Réticuler sous agitation pendant 10 min à température ambiante (RT).
      ATTENTION : Paraformaldéhyde (PFA) est toxique et doit être manipulé avec précaution.
   4. Étancher l’action de paraformaldéhyde en ajoutant 1/10 volume de glycine 1,25 M (1 mL / 10 mL de solution de paraformaldéhyde) ; Agiter à 5 min à température ambiante.
   5. Jetez les médias par aspiration et rincer deux fois (5 min) avec 1 X le volume moyen de PBS.
   6. Ajouter un volume de PBS correspondant à 1/10ème du volume des médias, recueillir des cellules avec un grattoir de cellules et puis transférer dans un tube à centrifuger.
   7. Tourner à 510 g à 4 ° C pendant 5 min.
   8. Eliminez autant surnageant que possible.
   9. Stocker les granulés indéfiniment en fonction des besoins à-80 ° C.
2. Tissu de réticulation
   1. Mettre 5 mg de tissu de la glande pituitaire souris fraîchement obtenu dans une solution de paraformaldéhyde à 1 % dilué dans du PBS (environ 10 x le volume du tissu), agiter durant 10 min à température ambiante.
   2. Étancher l’action de paraformaldéhyde en ajoutant une solution de glycine de 1,25 M (1 mL / 10 mL de solution de paraformaldéhyde) et agiter à 5 min à température ambiante.
   3. Jetez les médias par aspiration et rincer deux fois avec du PBS (environ 10 x le volume du tissu). Eliminez autant surnageant que possible.
   4. Stocker le tissu réticulé indéfiniment à-80 ° C.

3. les cellules ou tissus lyse

1. Préparer le tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 7.0, 10 mM EDTA, 1 % SDS, additionné de 200 U/mL d’une solution d’inhibiteur de RNAse et un cocktail de protéases inhibiteur 5 µL/mL).
2. Pour obtenir les échantillons lysés sans décongélation préalable, remettre en suspension les granules des cellules ou des tissus réticulés avec ce tampon (environ 1 mL par 100 mg de culot cellulaire ou tissulaire). Un culot cellulaire provenant de cellules de 1 x 10⁷ donnent lieu à un échantillon lysé contenant environ 20 mg de protéine.
   Remarque : Selon le tissu utilisé, une étape de rupture mécanique doit être ajoutée. Dans ce cas, il est important d’éviter l’échauffement des échantillons au cours de cette étape supplémentaire.

4. sonication

1. Optimisation des conditions sonication
   1. Programmer le sonicateur avec 2 à 5 séries de 30 ON s et 30 s OFF.
   2. Effectuer des tests pour optimiser les conditions de la sonication sur échantillons lysés dilués (facteur de dilution ½ ou ¼ correspondant à environ 10 ou 5 mg de protéine). Diluer les échantillons lysés dans le bain d’eau de 4 ° C et commencer la série de sonication.
   3. Purifier le RNAs avec un réactif d’isolement ARN (p. ex., Trizol) soit avec un kit de purification d’ARN.
   4. Charger la totalité de l’ARN purifié sur une électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % dans un tampon TBE, vérifier la longueur des fragments d’ARN. Cette durée devrait se situer entre 200 et 800 bp.
      Remarque : Selon la taille de fragment de RNA, efficacité des sondes oligonucléotides anti-sens peut varier. Il est alors recommandé de vérifier l’efficacité des sondes dans des conditions différentes de la sonication.
2. Sonication des échantillons lysés
   1. Échantillons place lysée correspondant à 20 mg de protéines (obtenu après l’étape 3.2) dans les 4 ° C, bain d’eau et commencent la série de sonication qu’optimisé au point 4.1.
   2. Immédiatement après la sonication, centrifuger pendant 5 min à 12 000 g à 4 ° C. Transfert de surnageants dans nouveaux tubes de centrifugeuse.
      NOTE : Afin d’assurer l’homogénéité, les surnageants répétées peuvent être mis en commun et redistribués à cette étape.

5. ARN Pull-down

1. Jour 1 – étape hybridation
   1. Ajouter les 2 volumes de tampon d’hybridation (50 mM Tris-HCl pH 7.0, 750 mM NaCl, 1 mM EDTA, SDS de 1 %, 15 % Formamide ajouté extemporanément) de surnageants recueillis après l’étape de la sonication. Vortex.
   2. Transférer 20 µL de chaque échantillon dans un tube à centrifuger (échantillons d’entrée) et conserver à-20 ° C.
   3. Ajouter 100 pmol des sondes oligonucléotidiques de biotinylé (spécifique ou non spécifique ; voir tableau 1) pour chaque échantillon. Incuber pendant 4 à 6 heures sous agitation modérée sur un rotateur de tube à température ambiante.
   4. Ajouter 50 µL de perles magnétiques streptavidine additionné de 200 U/mL d’une solution d’inhibiteur de RNAse et un cocktail de protéases inhibiteur 5 µL/mL.
   5. Incuber pendant la nuit sous agitation modérée sur le rotateur de tube à température ambiante.
2. Jour 2 – étape d’isolement RNA
   1. Support magnétique permet de séparer les perles du lysat cellulaire, éliminer le surnageant et laver les billes avec 900 µL de tampon de lavage (SDS 0,5 %, SSC 2 x). Répétez 5 fois entrecoupées de l’agitation de 5 min sur le rotateur à température ambiante.
   2. Après le dernier lavage, décanter une dernière fois et ajouter 95 µL de tampon de Proteinease K (10 mM Tris-HCl pH 7.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, SDS de 0,5 %) et 5 µL de protéinase K (20 mg/mL) pour les échantillons.
   3. Sur la glace, décongeler les échantillons d’entrée (20 μL) et ajouter 5 µL de protéinase-K (20 mg/mL) et de 75 µL de tampon de Proteinease K.
   4. Incuber les échantillons avec la protéinase K pendant 45 min à 50 ° C puis 10 min à 95 ° C.
   5. Réfrigérer l’échantillon sur la glace pendant 3 min avant de séparer les perles de RNAs avec le support magnétique. Conserver le liquide surnageant et d’ignorer les perles.
   6. Purifier les ARN avec un kit de purification d’ARN, qui devrait inclure une étape de digestion de l’ADN. Stocker les ARN à-80 ° C.
   7. Effectuer qPCR de transcription inverse (RT-qPCR) en utilisant un kit RT suivi de qPCR en utilisant des amorces spécifiques (tableau 1).
   8. Construire deux bibliothèques d’ADN correspondant aux deux piscines RNA obtenus avec chacune des sondes spécifiques Neat1 (tableau 1). Effectuer le séquençage sur un système séquentiel de prochaine génération.

Résultats

Plusieurs études récentes ont montré que les lncRNAs jouent un rôle essentiel dans presque tous les processus biologiques importants et que ce rôle est assurée par le contrôle de l’expression génique, se produisant tant aux niveaux post-transcriptionnelle et la transcription dans ce dernier cas, montrant que les ARN peut être la cible de lncRNAs⁶.

La lncRNA nucléaire enrichi abondante transcription 1 (Neat1) est impliquée dans différents neuropathologies comme la démence frontotemporale, la sclérose latérale amyotrophique ou épilepsie^8,9,10et est également faite dans différents cancers^11,12.

Ce lncRNA est également connu pour être l’élément structurel du corps nucléaires spécifiques, le paraspeckles et d’être impliqués dans le rythme circadien post-transcriptionnelle de l' expression de gène¹³. Paraspeckles qui se trouvent dans le noyau de chaque cellule et sont formées autour non seulement des Neat1, qui est nécessaire pour leur formation, mais aussi autour de plusieurs ARN contraignantes protéines (RBP)¹⁴, sont en effet connus pour être en mesure de conserver les objectifs du RNA dans le noyau¹⁵ . La formation de paraspeckles est réalisée par l’association des différentes composantes. Cette formation a été montrée pour afficher un motif rythmique circadiens, conduire une rétention nucléaire rythmique de RNA cibles¹³. La rétention nucléaire des cibles de RNA par paraspeckles peut se produire par la liaison à la RBP ou directement par l’intermédiaire de liaison ARN/ARN, mais l’ampleur des ARN ciblé par paraspeckles devait être tranchée. Pour identifier l’ARN cible directement ou indirectement par Neat1, un protocole de menu déroulant d’ARN a été conçu qui permet l’isolement et l’identification de toutes les cibles de Neat1 ARN dans des cellules cultivées ainsi que dans des échantillons de tissus (voir la Figure 1 pour un graphique présentation de la technique).

Le protocole a été appliqué avec succès à l’identification des cibles de RNA d’une lncRNA un autre métastase associés poumon adénocarcinome transcription 1 (Malat1). Malat1 est un lncRNA hautement conservée et exprimé dans des taches nucléaires ainsi que de la RNA plusieurs facteurs d’épissage. Malat1 est connu pour être impliqué dans la régulation de l’épissage de plusieurs pré-ARNm naissant^16,17.

Spécifiques (SO) et sondes oligonucléotidiques non-spécifiques (NSO) ont été générés à l’aide de la stratégie de conception de sonde décrite ici. Cette stratégie repose sur la sélection des régions qui affichent une faible probabilité de base interne de jumelage tel que prédit par la structure secondaire de la lncRNA et la conception des sondes spécifiques ayant une forte affinité pour ces régions. Comme un résultat représentatif de ces prédictions de bioinformatique, une image de la structure secondaire prédite d’une séquence de Neat1 (1 480 à 2 000 nucléotides) ainsi que la position de deux conçu pour que les sondes sont donnés à la Figure 2.

Les sondes conçues ont été dirigés vers le rat Neat1 ou Malat1 pour les cellules GH4C1 cultivées et à la souris Neat1 pour des extraits de tissu hypophysaire (tableau 1). L’enrichissement relatif au Neat1 ou Malat1 a été calculé pour les sondes non spécifique et spécifiques par rapport à des échantillons d’entrée. La figure 3 montre l’efficacité des sondes spécifiques de menu déroulant Neat1 chez le rat GH4C1 ligne de cellules hypophysaires (Figure 3 a) et en souris tissu hypophysaire extraits (Figure 3 b). Lorsque vous utilisez le protocole de conception de sonde pour générer des oligonucléotides spécifiques (SO) sondes dirigées vers Malat1, une sonde efficace a été obtenu alors que l’autre n’était pas assez efficace et a été mis au rebut (Figure 4 a).

Après un ARN déroulant procédure suivie par la RT-qPCR expériences, certains ARN évalués avec des amorces spécifiques (tableau 1) se sont avérés être associé à Neat1 ou Malat1 dans les extraits de GH4C1. RNAs associé à Neat1 dans les extraits cellulaires GH4C1 apparaissaient également à associer à Neat1 dans les extraits de tissu hypophysaire. En effet, après Neat1 RNA déroulant, Malat1 s’est avéré être la cible de Neat1 dans la lignée de cellules GH4C1 et dans les extraits de tissus de souris hypophysaire (Figure 5 a). Réciproquement, Neat1 a été considérablement enrichi après qu’ARN Malat1 déroulant réalisé avec une sonde spécifique dans les cellules GH4C1 (Figure 4 b). En mettant en évidence la relation étroite entre les deux lncRNAs, ces résultats sont compatibles avec le rôle potentiel de corégulation des Neat1 et Malat1 suggérée par Malat1 chez des souris knockout qui affichent des variations dans l' expression de l’ARN Neat1^{18, 19}. les transcriptions des deux principales hormones hypophysaires, hormone de croissance (Gh) (Figure 5 b) et de la prolactine (Prl) (Figure 5) ont été significativement enrichies suite RNA Neat1 menu déroulant avec des sondes spécifiques dans les cellules GH4C1 et hypophyse extraits, ce qui suggère une réglementation possible des deux hormones de Neat1. Si l'on compare les deux sondes spécifiques utilisés, il est apparu que leur efficacité pouvait varier selon l’objectif de RNA considéré (Figure 5 b et Figure 5). Ces résultats mettent en évidence la nécessité de concevoir plusieurs sondes spécifiques afin de sélectionner ceux affichant non seulement le meilleur rendement dans l’enrichissement de la lncRNA de la liste déroulante, mais aussi la meilleure efficacité dans l’enrichissement de ses cibles de RNA.

La méthode de menu déroulant RNA peut également être suivie par séquençage haut débit RNA pour obtenir la liste complète des cibles de RNA d’une lncRNA d’intérêt¹³. Une analyse de RNA-seq sur les cellules hypophysaires GH4C1 après que Neat1 RNA liste déroulante à l’aide de deux sondes spécifiques décrits ci-dessus a été réalisée. Il est à noter qu’un contrôle négatif à l’aide d’un ONS pourrait également être soumis à RNA-seq analyse, si le niveau de l’ARN récupéré après que le RNA menu déroulant avec ons est suffisant pour permettre la construction de bibliothèques. Ce n’était pas le cas dans l’expérience précédente¹³. Les bibliothèques qui ont été générés après l’utilisation de sondes spécifiques ont été analysées à l’aide de boutons de manchettes/Tophat pipeline²⁰ et relevés de notes uniquement avec les valeurs du fragment par kilobases par millions mappé se lit comme suit (FPKM) plus élevé que 1 ont été prises en compte. Les listes obtenues avec les deux sondes spécifiques adressées à Neat1 (tableau 1) ont été croisées afin d’évaluer la spécificité des résultats. 4 268 gènes ont été trouvés associé à paraspeckles, qui représente 28 % des transcriptions exprimées dans les cellules de GH4C1¹³. Cohérente avec les résultats obtenus en utilisant l’analyse qPCR (Figure 5 a-C), les transcriptions de Gh, Prl et Malat1 ont été trouvées à associer à Neat1. La méthode de menu déroulant RNA est donc prouvée d’être un outil efficace pour étudier l’interaction entre lncRNAs et leurs cibles de RNA.

Figure 1 : représentation graphique de l’ARN déroulant procédure. Le premier jour, des cellules ou des tissus ont été réticulés avec du paraformaldéhyde, lysées et sonication avant l’étape d’hybridation qui s’est déroulée en ajoutant des sondes spécifiques biotinylé. Perles magnétiques streptavidine s’ajoutèrent ensuite à séparer du reste de la cellule de lysat de matériel spécifique. Le deuxième jour, les perles ont été isolés par un aimant et lavés plusieurs fois. Une étape de-réticulation permis une reprise d’ARN qui ont été purifiées et utilisées pour la RT-qPCR ou analyse de RNA-seq. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : structure secondaire d’une séquence de Neat1 (1 480 à 2 000 nucléotides) comme l’avait prédit de bioinformatique (le webserver RNAstructure ; le plus faible d’énergie libre structure). La structure est colorée selon le degré de probabilité d’appariements de base. Les deux sondes oligonucléotides (SO1 et SO2) en rouge sont positionnés le long de la structure de l’ARN Neat1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : validation de qPCR d’enrichissement Neat1 versus entrée. validation de qPCR d’enrichissement Neat1 versus entrée après ARN Neat1 tirer vers le bas par deux différentes sondes spécifiques (SO1-rn et SO2-rn pour cellules GH4C1 et SO1-mm et SO2-mm pour tissu hypophysaire) par rapport à un non spécifique (NSO-rn pour cellules GH4C1 et ons-mm pour tissu hypophysaire) dans les cellules GH4C1 (A) et dans la glande pituitaire souris extraits tissulaires (B). Les résultats sont moyenne ± SEM obtenu dans les expériences 3 et 10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : validation de qPCR d’enrichissement Malat1 et Neat1 contre entrée après Malat1 RNA tirer vers le bas. validation de qPCR de Malat1 (A) et Neat1 (B) enrichissement versus entrée après ARN Malat1 tirer vers le bas par deux différentes sondes spécifiques (SO3-rn et SO4-rn) par rapport à un non spécifique un (NSO-rn) dans les cellules GH4C1. Les résultats sont moyenne ± SEM dans 3 expériences. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : validation de qPCR de Malat1, Gh, Prl enrichissement versus entrée après ARN Neat1 tirer vers le bas. validation de qPCR de Malat1 (A), Gh (B), Prl (C) enrichissement versus entrée après ARN Neat1 tirer vers le bas à l’aide de différentes sondes spécifiques par rapport à un non spécifique dans les cellules GH4C1 et extraits tissulaires hypophysaire de souris. Les résultats sont moyenne ± SEM obtenu dans les expériences de 3 à 8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

NOMS DE SONDE	Séquences
ONS-Rn	TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT
SO1-Rn	CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC
SO2-Rn	GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC
SO3-Rn	AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA
SO4-Rn	AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC
ONS-mm	GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC
SO1-mm	GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC
SO2-mm	CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA
qPCR amorces :
Rattus norvegicus
Neat1	AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT
	TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC
Malat1	GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT
	TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA
GH1	CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA
	GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT
PRL	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA
Mus musculus
Neat1	TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA
	CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT
GH1	CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA
	TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC
PRL	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA

Tableau 1 : Séquences de sondes oligonucléotides d’ADN et des amorces de qPCR

Discussion

Longtemps non codantes RNAs (lncRNAs), par leur nombre et leur diversité représentent un grand champ de la recherche et la plupart de leurs rôles sont encore à découvrir. Beaucoup de ces lncRNAs ont une localisation nucléaire et parmi eux, certains sont impliqués dans les voies de régulation de l’expression génique au moyen de mécanismes transcriptionnels ou post-transcriptionnel. Un des défis actuels dans ce domaine est de comprendre la pertinence de ces lncRNAs dans le traitement post-transcriptionnelle des ARN. À cette fin, ARN ciblé par lncRNAs doit être identifiés. Inspiré par les précédentes études axées sur la liaison de lncRNAs avec la chromatine, nous avons développé un procédé qui permet l’identification d’ARN associé à une lncRNA. Le succès de ce protocole, nommé RNA déroulant, dépend principalement de deux étapes cruciales, à savoir la conception d’anti-sens des sondes oligonucléotides d’ADN qui dois spécifiquement et exclusivement s’hybrider avec le lncRNA d’intérêt, ainsi que les conditions du tissu ou fixation de la cellule qui doivent préserver l’intégrité du réseau entre tous les partenaires moléculaires.

Précédemment publié protocoles fournis des procédures pour isoler une lncRNA avec ses séquences de chromatine associées (ChIRP^1,2, graphique^3,4). Dans ces protocoles, différentes stratégies ont été utilisées pour la conception de que l’oligonucléotide anti-sens de biotinylé ADN sondes. Dans la procédure de ChIRP, les auteurs ont utilisé un pool d’ADN biotinylé sondes oligonucléotidiques englobant toute la longueur de la lncRNA d’intérêt après l’exclusion de toutes les sondes redondants et non-spécifique^1,2. Dans le protocole de graphique, les auteurs identifiés les régions de le lncRNA qui sont plus accessibles pour l’hybridation et conçu des oligonucléotides de capture qui ciblent ces régions. Ces régions ont été choisies pour leur sensibilité RNase H. En effet, les oligonucléotides qui s’hybrident aux sites accessibles dans le lncRNA utilisant la propriété de RNAse H d’hydrolyser l’ARN dans les sites de liaison de l’ARN-ADN, ARN-ADN hybrides et entraîner clivage enzymatique de la lncRNA. Les auteurs sélectionnés trois de ces oligonucléotides de capture de candidat et utilisaient dans un cocktail^3,4.

La procédure que nous avons utilisé pour concevoir les sondes d’oligonucléotides anti-sens ADN biotinylé était proche de celle utilisée dans le protocole de graphique, mais les régions hybridation-disponible de la lncRNA souhaitée n’ont pas été retenues sur la base de leur sensibilité RNAse H, mais selon leur probabilité faible d’appariement base interne tel que déterminé par la bio-informatique modélisation de structure secondaire lncRNA. Il doit être remarqué que différentes structures secondaires vont être prédite à l’aide de différents algorithmes et sondes à retenir sont celles qui s’hybrident aux séquences disponibles de la lncRNA dans le plus grand nombre de structures secondaires prédit. Les mêmes résultats ont été obtenus en utilisant un cocktail de trois sont conçus, sondes spécifiques ou une seule sonde individuellement. Cela a incité l’utilisation de deux sondes séparées, spécifiques et l’examen des résultats positifs, comme celles qui sont communes à ces deux sondes. Enfin, il est donc recommandé au début du développement de la méthode, pour un résultat optimal et de pouvoir évaluer la spécificité des résultats de la liste déroulante, de concevoir différents de d’oligonucléotide anti-sens 3 sondes et de comparer ensuite expérimentalement leur efficacité, surtout depuis la sonde efficacité peut-être être modifiée par la préparation de lysat cellulaire. Néanmoins, la procédure de conception de sonde basé sur la modélisation de la bio-informatique de lncRNA secondaire structure que nous avons utilisé reste moins onéreux que celui issu des piscines de carrelage de sondes oligonucléotidiques², et c’était beaucoup moins de temps que la méthode basée sensibilité de RNAse-H⁴.

Un contrôle négatif doit également être effectué en utilisant comme sondes oligonucléotidiques capture négatif soit le sens ADN biotinylé d’oligonucléotide ou brouiller les sondes oligonucléotidiques ou oligonucléotides dirigés contre un ARN non apparenté. En raison de l’existence de transcriptions naturel lncRNAs, utilisation de sondes oligonucléotidiques sens peut parfois être insuffisante. Indépendamment de la sonde d’oligonucléotides sélectionnée pour le contrôle négatif, il est nécessaire de vérifier par souffle qu’il ne pas s’hybrider avec un ARN connu et de garder à l’esprit que cet oligonucléotide peut être hybridé à un lncRNA encore non annoté.

Les lysats de cellules utilisées dans ces expériences de menu déroulant RNA proviennent de 10⁶ 10⁷ cellules lorsque vous travaillez avec des cellules cultivées et de 1 à 10 mg lorsque vous travaillez avec des tissus. La préparation des lysats cellulaires doit être adaptée en fonction du type de tissus ou de cellules utilisé avec deux étapes principales qui doivent être optimisés : à savoir, l’étape de réticulation qui permet la formation de liaisons covalentes entre le lncRNA et ses partenaires moléculaires et les étape de sonication qui réduit la viscosité en déchiquetant la chromatine.

La réticulation étape vise à s’assurer que toutes les cibles de RNA restent fermés à la lncRNA en induisant la formation d’un réseau entre tous les partenaires moléculaires. Une étape de traitement de paraformaldéhyde qui forme des liaisons covalentes entre le lncRNA et ses partenaires permet au réseau d’être réticulé. Dans le protocole de graphique, il a été suggéré si travailler avec lncRNA nucléaire, afin d’effectuer un premier traitement avec du paraformaldéhyde dans l’ensemble cellule lysat et un second traitement sur la fraction nucléiques isolé^3,4. Nous avons observé que cette étape supplémentaire a diminué l’efficacité des sondes, probablement en réduisant l’accessibilité lncRNA dans les cellules. Par conséquent, le degré de réticulation par paraformaldéhyde doit être adapté en tenant compte de la cellule, ou le type de tissu utilisé, la localisation de la lncRNA d’intérêt et l’efficacité des sondes conçues.

Tandis que la lyse des cellules, la chromatine est libérée dans le lysat et augmente sa viscosité ; Il est alors nécessaire de broyer la chromatine par sonication pour augmenter la fluidité des échantillons et donc faciliter l’accessibilité de l’oligonucléotide sondes à la lncRNA d’intérêt. Toutefois, la sonication déchiquette aussi l’ARN extrait avec le lncRNA d’intérêt. Il est alors important de minimiser le temps de sonication de telle manière que même si elle réduit efficacement le lysat de la viscosité, il permet également que l’obtention de l’ARN des fragments d’une longueur comprise entre 200 et 800 BP. Notez que le temps de sonication sera très dépendant de la quantité et le type de tissu ou des cellules utilisées.

En conclusion, la procédure décrite ici permet en 2 ou 3 jours la capture des cibles RNA d’une lncRNA désirée. Couplé avec la RT-qPCR, ces méthodes permettra à la recherche d’une association spécifique et la réglementation de l’ARNm par le lncRNA désiré comme une approche de candidat. Pour une approche à l’échelle du génome, expériences de RNA déroulants peuvent être analysés par RNA séquençage haut-débit permettant la récupération de tous les ARN associée à la lncRNA souhaitée. Quelle que soit la stratégie analytique choisie, la procédure de menu déroulant RNA devrait fournir des nouvelles connaissances importantes sur règlement de RNA en lncRNAs.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Perles magnétiques de streptavidine
Formamide	Thermo-Fisher	15515-026
Appareil d’électrophorèse sur gel	Advance	Mupid-One	Appareil d’électrophorèse sur gel
Protéinase K	Sigma	P2308
Kit de purification de l’ARN XS	Macherey-Nagel	740902	Kit de purification de l’ARN
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	Inhibiteur de l’ARN
Trizol	Thermo-Fisher	15596018	Purification de l’ARN
Rotateur de tube Stuart		SB2	Eppendorf Rotateur
ARN vers ADN	Thermo-Fisher	4387405	Reverse kit de transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	réactif qPCR
Applied 7500 Fast	Thermo-Fisher	4351107	appareil
Illumina TruSeq Kit de préparation d’échantillons d’ARNm briné	Illumina	20020594	kit de construction de bibliothèque d’ADN
Illumina NextSeq 500	Système	NGS	SY-415-1002