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Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression dans les neurones de la moelle épinière génétiquement définies

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DOI :

10.3791/57382

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12 mai 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Zurich, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Swiss Federal Institute (ETH) Zurich

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Intrarachidienne de recombinase dépendant adeno-associated virus recombinant (rAAV) peut être utilisée pour manipuler n’importe quel type de cellules génétiquement marquées dans la moelle épinière. Ici, nous décrivons comment transmettre des neurones de la corne dorsale de la moelle épinière lombaire. Cette technique permet d’interrogatoire fonctionnelle du sous-type neurone manipulé.

Résumé

Manipulation sélective des sous-populations de neurones spinale réalisée principalement par deux méthodes différentes : 1) génétique intersectionnelle, auquel cas doubles ou triples les souris transgéniques sont générés afin d’obtenir une expression sélective d’un journaliste ou un effecteur gène (par exemple, du locus Rosa26) dans la population souhaitée de la colonne vertébrale. 2) intrarachidienne de virus adeno-associé de recombinante de Cre-dépendante (rAAV) ; ici, des vecteurs d’AAV Cre-dépendante codant pour le gène reporter ou effecteur de choix sont injectées dans la moelle épinière des souris exprimant la recombinase Cre dans la sous-population neuronale désirée. Ce protocole décrit comment générer des vecteurs rAAV Cre-dépendante et comment transmettre les neurones de la corne dorsale de la moelle épinière lombaire segments L3-L5 avec rAAVs. Comme les segments de la colonne vertébrale lombaires L3-L5 sont innervés par ces neurones sensoriels périphériques qui transmettent l’information sensorielle provenant des membres postérieurs, comportement spontané et réponses à des tests sensoriels, appliqués pour le postérieur homolatéral du côté d’injection peuvent être analysées afin d’interroger la fonction des neurones manipulés de traitement sensoriel. Nous fournissons des exemples de comment cette technique peut être utilisée pour analyser génétiquement définies des sous-ensembles des neurones spinaux. Les principaux avantages d’expression du transgène induite par le virus chez les souris transgéniques Cre par rapport à l’expression classique journaliste induite par la souris transgénique sont les suivants : 1) rAAVs Cre-dépendante différents codant des protéines différentes de reporter ou d’effecteur peut être injecté dans une seule lignée transgénique Cre, surmontant ainsi la nécessité de créer plusieurs souris transgénique plusieurs lignes. 2) intrarachidienne limite manipulation de cellules exprimant le Cre au site d’injection et à l’heure après l’injection. Les inconvénients principaux sont : 1) expression du gène rapporteur de rAAVs est plus variable. 2) chirurgie est nécessaire pour transmettre les neurones spinaux d’intérêt. Laquelle des deux méthodes est la plus appropriée dépend de la question de population et de la recherche de neurone à traiter.

Introduction

La moelle épinière dorsale est essentielle pour l’échange d’informations entre la périphérie du corps et le cerveau. Des stimuli sensoriels comme la chaleur, le froid, le toucher, ou des stimuli nociceptifs sont détectés par les neurones périphériques spécialisés, qui transmettent cette information aux neurones de la corne dorsale de la moelle épinière. Ici, un réseau complexe des interneurones inhibiteurs et excitateurs module et finit par relais l’information sensorielle par l’intermédiaire des neurones spinaux projection supraspinales sites1,2. Les calculs effectués par la moelle inter- et neurones de projection porte l’information sensorielle, ainsi déterminer quelle information est supprimée ou relayée à quelle intensité. Changements dans l’intégration des stimuli sensoriels, comme un équilibre altéré entre l’inhibition et excitation, peuvent provoquer des dysfonctionnements sensoriels tels que l’hypersensibilité ou allodynie (sensations douloureuses après une stimulation normalement non douloureuse). Ces changements sont considérés comme la cause sous-jacente de la douleur chronique divers États3,4. Ainsi, les circuits spinaux sont d’une grande importance au traitement sensoriel et par conséquent dans la perception de l’environnement de l’organisme et soi. Avec l’avènement récent et combinaison de moléculaire, génétique et des techniques chirurgicales qui permettent la manipulation précise de sous-populations génétiquement identifiés neurone spinal, les scientifiques commencent à comprendre les circuits de la colonne vertébrale sous-jacente responsable du traitement des différentes modalités sensorielles.

Intrarachidienne de rAAV chez des souris transgéniques ou de type sauvage a grandement contribué à la manipulation, l’analyse et la compréhension de la fonction des sous-ensembles spécifiques de neurones spinaux5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. cette technique permet la livraison de protéines marqueur (tels que GFP / protéines de fusion de GFP), protéines de journaliste (comme GCaMP), ou protéines effectrices (tels que les toxines bactériennes, channelrhodopsin ou récepteurs pharmacogénétiques) dans un spatialement manière limitée aux neurones spinaux. Injection locale de rAAVs Cre-dépendante dans des souris transgéniques exprimant une recombinase Cre dans un sous-ensemble spécifique des neurones spinaux permet l’analyse spécifique de la population neuronale respectif. Nous avons utilisé cette technique pour étiqueter, ablation, inhiber ou activer la colonne vertébrale glycinergic neurones démontrant qu’ils sont une partie essentielle de la porte de la colonne vertébrale contrôler la douleur et démangent transmission7. Dans ces expériences, intrarachidienne de Cre-dépendant du rAAV GlyT2::Cre chez la souris a permis la manipulation sélective des neurones glycinergic dans la moelle lombaire. Ainsi, la manipulation simultanée des circuits supraspinal qui contiennent glycinergic neurones essentiels à la survie de l’animal peut être évitée.

Alors que l’administration intrarachidienne de rAAVs limite infection au site d’injection, transduction virale peut se produire non seulement dans les neurones les, mais aussi dans les neurones qui se connectent au site d’injection via projections axonales. Ce dernier est souvent utilisé pour les zones de CNS trace apport neuronale d’un noyau particulier dans le cerveau. L’infection des projections axonales possible, toutefois, également être un facteur de confusion quand une population définie de neurones doit être étudiée dans un site donné. Pour résoudre ces problèmes, nous avons récemment effectué une analyse complète des sérotypes d’AAV et cassettes d’expression pour identifier des sérotypes et des promoteurs qui peuvent servir à minimiser ou maximiser transduction rétrograde. Dans le cadre de cette recherche spécifique dans les circuits de la colonne vertébrale, nous avons analysé la capacité des promoteurs et des sérotypes différents de transduce marqués des neurones dans le cortex somatosensoriel les ganglions de la racine dorsale (GRD) et la moelle ventro rostrale (RVM) 12. la technique décrite dans le présent protocole peut donc servir à analyser les neurones spinaux au site d’injection ou d’analyser des neurones de projection que formuler des commentaires sur le site d’injection de la moelle épinière. Dans le protocole décrit ici, trois injections du rAAV dans le côté gauche de la colonne vertébrale lombaire sont réalisées pour permettre la transduction des neurones dans les trois segments lombaires (L3-L5). Les segments de L3-L5 reçoivent la majorité de l’information sensorielle du postérieur homolatéral au site d’injection. Nous démontrons que la manipulation fonctionnelle des neurones génétiquement marquées en L3-L5 est suffisante pour susciter des changements de comportement robustes, fournissant ainsi la preuve fonctionnelle pour la fonction de circuit de telle un sous-type de neurone génétiquement marquées.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvés par l’office vétérinaire cantonal Suisse (Zurich) et sont en conformité et le respect de toutes les directives réglementaires et institutionnels.

Remarque : Tous les matériaux ainsi que des fabricants respectifs et/ou vendeurs sont répertoriés dans la Table des matières.

1. génération des vecteurs d’AAV Cre-dépendante

Remarque : Une variété de vecteurs de Cre-dépendante avec des promoteurs différents peut être achetée (voir Table des matières) ou, si la construction de l’expression souhaitée n’est pas disponible, il peut être généré en modifiant des constructions existantes de VAA. À noter, le promoteur et le sérotype peuvent avoir un impact sur la propagation de la transduction virale (voir 12). La première partie du présent protocole décrit brièvement la génération de deux des différents vecteurs d’AAV Cre-dépendante adaptés pour le gain et la perte d’expériences de fonction, respectivement.

  1. Pharmacogénétique Activation (Gain de fonction)
    1. Commander pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (voir la Table des matières) pour designer récepteurs activés exclusivement par designer drugs (DREADD)-médiation activation.
    2. À la réception de la culture bactérienne stab, strie les bactéries sur plaques LB (qualité bactériologique agar dissous dans un milieu liquide Luria-Bertani) additionné de l’antibiotique approprié. Incuber pendant la nuit à 37 ° C et prélever une colonie unique sur le lendemain.
      NOTE : Plasmides contenant AAV vecteur génomes peuvent être instables et recombinaison du génome viral, surtout dans l’aérogare inversé virale répète (RIR), peut se produire au cours de l’amplification chez e. coli. Nous suggérons à l’aide de recA-deficient/étouffées souches telles que MDS42 ou Stbl3 pour éviter de recombinaison dans le plasmide contenant le génome de l’AAV.
    3. Amplifier les bactéries en suivant les instructions fournies par le vendeur de l’Elu ADN-Maxi-Kit et préparer l’ADN de plasmide de haute qualité avec un ADN-Maxi-Kit disponible dans le commerce (par exemple, voir la Table des matières). Effectuer un contrôle de la qualité de la préparation d’ADN plasmidique en vérifiant l’intégrité et l’identité de l’ADN de plasmide par Sommaire de restriction d’une aliquote de l’ADN de plasmide.
      Remarque : Il existe des sites de reconnaissance pour l’endonucléase de restriction SmaI dans le RTI. Inclure un "Digest" SmaI dans le contrôle de la qualité pour vérifier l’intégrité de l’ITRs.
    4. Envoyer l’ADN à une installation de base de vecteur viral afin de produire le rAAV de haute qualité.
      NOTE : Titre élevé, préparations virales de haute qualité sont indispensables pour éviter la confusion causées par des contaminations dans la préparation virale des phénotypes. Nous recommandons donc dont le rAAV de choix produite dans une installation de base vectorielle établie, à moins que la production de l’AAV est bien établie dans le laboratoire.
  2. Ablation (perte de fonction)
    Remarque : Les toxines bactériennes ou des récepteurs de la toxine peuvent servir à médiation ablation cellulaire ou silencieux neuronale. Nous avons généré pAAV.EF1α.flex.DTA fragment de toxine diphtérique express A (CDI) en fonction de la Cre.
    1. Pour générer un vecteur viral Cre-dépendante, choisir un vecteur de Cre-dépendante avec un promoteur approprié (par exemple, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Amplifier la séquence codante de choix (p. ex., DTA) par PCR avec des amorces qui incluent des asques et des NheI ou des sites de reconnaissance de l’endonucléase de restriction compatible dans leur porte-à-faux (voir Foster et al. 7)
    2. En utilisant des techniques standard de biologie moléculaire, effectuer des condensés de restriction de l’ADN du vecteur (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) et de la PCR amplifiés insérer (NheI-DTA-AscI) avec les endonucléases de restriction asques et NheI. Ligaturer les fragments purifiés.
    3. Transformer la réaction de ligature en bactéries appropriés, selon le protocole donné par le fournisseur des bactéries compétentes de choix et blanc sur plaque de bactéries sur des plaques de LB. Utilisez recA-deficient/étouffées souches, comme MDS42 ou Stbl3, pour le clonage et ultérieure amplification de l’ADN de plasmide.
    4. Le jour après transformation, sélectionner les clones et leur inoculer dans LB additionné à la nuit antibiotique appropriée à 37 ° C. Le lendemain, extraire l’ADN de plasmide de bactéries cultivées. Vérifiez le clonage de restriction digestion réussie et le séquençage de l’ADN de plasmide extraite.
    5. Amplifier l’ADN de plasmide bactérien de haute qualité (Voir l’étape 1.1.3). Envoyer de l’ADN amplifié à un laboratoire central de vecteurs viraux pour la production de virus.

2. transduction des cellules de la colonne vertébrale

  1. Préparation de la Solution antivirus
    ATTENTION : Les virus sont infectieuses réactifs et doivent être manipulés conformément aux lignes directrices pertinentes. Dans la plupart des cas, les rAAVs peuvent être gérés au niveau de biosécurité 1 (BSL1).
    1. Le jour de l’injection, une partie aliquote de stocks du virus purifié désiré sur la glace de dégivrage et gardez-le sur la glace jusqu'à ce que juste avant l’injection. Éviter le gel-dégel-cycles répétés, car il réduira le titre efficace du virus.
      NOTE : Si nécessaire, le virus décongelé aliquot peuvent être conservé à 4 ° C jusqu'à 3 jours.
    2. Diluer les particules virales en stérile 0,9 % NaCl ou phosphate buffered saline (PBS).
      NOTE : Le titre approprié dépend des objectifs expérimentaux et doit être déterminé expérimentalement. Une bonne charge virale totale est de commencer avec 3 x 109 copies de génome (3.33x1012 GC/mL, 3 x 300 nL injecté). Prise excessive et quelques pertes pendant le chargement du capillaire en comptent, il faudra environ 2,5 µL de solution antivirus pour chaque souris.
  2. Préparation des Micropipettes pour Injections intramédullaires
    1. « Pull » capillaires en verre à paroi mince (diamètre extérieur 1 mm) sur un de micropipettes pour créer un longueur de ~5.5 mm, tige en eau peu profonde. Utiliser un filament chauffant de 3,0 mm et paramètres de programme 00 avec p adapté comme dans le tableau 1.
      Remarque : Tirant peut s’effectuer à l’avance. Les capillaires élongations doivent être stockés dans un récipient fermé sur modeler pour éviter la poussière qui pourrait obstruer plus tard de la micropipette. Autoclave de micropipettes n’est pas nécessaire.
    2. Couper la tige du capillaire extraite avec une pince de laminectomie à une longueur d’environ 4,5 à 5 mm pour créer une pointe d’ouverture dont le diamètre intérieur de 25 à 35 μm. À l’aide d’un microscope avec une échelle du micromètre, mesurer le diamètre intérieur des micropipettes plusieurs à avoir une idée de quelle taille l’ouverture devrait être, ou mesurer pour chaque micropipette.
      NOTE : Une petite astuce peut conduire à obstruction ; un plus gros pourboire peut entraîner des lésions tissulaires et difficultés à pénétrer dans la moelle épinière.
  3. Préparation d’outils et d’installation chirurgicale
    1. S’assurer que l’équipement soit propre et prêt à être utilisé. Désinfecter la zone de travail en l’essuyant avec l’éthanol à 70 % et stériliser les outils par autoclave ou leur désinfection. Ne laissez pas n’importe quel désinfectant sur la seringue de microlitre qui nuirait à la vecteur viral à utiliser.
  4. Préparation de l’Animal pour la chirurgie et l’anesthésie
    Remarque : La durée totale de la chirurgie est de 60 à 90 min.
    1. Choisir 6 - à 10 - semaine souris âgées pour faciliter la procédure chirurgicale.
      Remarque : Si le protocole expérimental l’exige, l’injection d’animaux plus jeunes ou plus âgés est possible. Toute souche et des deux sexes peuvent être utilisés en principe, mais utilisent la même souche de fond (p. ex., C57BL/6J) pour la comparaison des comportements entre les lignées de souris transgéniques différents. Si les différences entre les sexes sont attendus ou à étudier, analyser des mâles et des femelles dans des groupes séparés.
    2. Induire l’anesthésie à l’isoflurane ~ 5 %. Placer l’animal dans le cadre stéréotaxique sur un tapis de chaleur et de maintenir l’anesthésie à l’isoflurane 1 à 2,5 % (taux de débit d’air 900 mL/min). Surveiller le taux de respiration tout au long de la chirurgie.
    3. Appliquer un onguent lubrifiant pour éviter le dessèchement cornée au cours de la chirurgie.
    4. Raser le dos de l’animal et enlever les cheveux soigneusement avec des tissus humides. Désinfecter la peau rasée avec la solution d’iode et laisser la peau sécher.
    5. Accorder un traitement analgésique (p. ex., 0,1 à 0,2 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée).
  5. Exposition de la colonne vertébrale au niveau de la moelle épinière lombaire
    Remarque : En raison du développement différencié de la moelle épinière et la colonne vertébrale, les niveaux respectifs ne sont pas alignées, mais le segment de la moelle épinière lombaire L4 est au même niveau que la vertèbre thoracique T13.
    1. Trouver la paire de côtes plus caudale en palpant le long de la colonne vertébrale. À l’aide d’un scalpel, faites une coupe longitudinale de 1,5 à 2,5 cm dans la peau à partir de seulement rostrale à la paire de côtes plus caudale.
    2. Soulever la peau avec une pince et retirez-le du muscle sous-jacent avec des ciseaux. Tout au long de l’opération, garder les tissus exposés humide avec stérile 0,9 % NaCl.
    3. À l’aide de pinces fines et des petits ciseaux, faire une incision dans la prochaine couche membraneuse mince juste à côté de la ligne médiane et la couper des apophyses épineuses. Il est séparé du muscle paraspinous sous-jacente, mais attaché aux apophyses épineuses.
  6. Identification des vertèbres au niveau de la moelle épinière lombaire
    Remarque : Une fois que la colonne vertébrale est exposée, les ligaments intertransverse et les apophyses dorsales doivent être visibles. Plusieurs repères anatomiques peuvent aider à identifier la vertèbre correcte de cible (Figure 1 b).
    1. Tirer la peau vers l’arrière pour exposer la crête iliaque. Au même niveau, la paire plus caudale des ligaments intertransverse visibles a rejoint l’apophyse L6. Rebours dans une caudale à direction rostrale d’identifier la vertèbre d’intérêt.
    2. Palper le long de la colonne vertébrale. La paire de côtes plus caudale se trouve juste rostrale à la vertèbre T13 et l’os iliaque au niveau des hanches est au niveau de la vertèbre L6.
    3. Retrouver l’endroit où le tendon le long du côté de la colonne vertébrale est plus blanc et plus médiale. La vertèbre T13 se trouve juste rostrale. Le segment de la moelle épinière lombaire L4 est situé au sein de cette vertèbre.
  7. Fixation de la colonne vertébrale et l’exposition de la moelle épinière lombaire
    1. Placez l’animal sur un coussin de tissus enroulés à élever sur les bornes de la colonne vertébrale du cadre stéréotaxique.
    2. Difficulté la vertèbre cible pour éviter les mouvements de la colonne vertébrale en raison de la respiration. Pour cet objectif, aligner les attaches adjacentes à la vertèbre de cible, fixer un collier en position et maintenir la colonne vertébrale avec une pince Adson tandis que la deuxième pince de fixation.
      Remarque : La colonne doit être perpendiculaire au plan de l’injection et solidement fixé afin qu’il ne se déplace pas à la pression par le haut. Si nécessaire, une deuxième paire de pinces peut être fixée à la colonne vertébrale. Dans ce cas, il est utile de fixer les deux paires de pinces sur les deux vertèbres adjacentes à la vertèbre de cible.
    3. Enlever le muscle paraspinous au-dessus de la vertèbre d’intérêt. À l’aide d’un scalpel, faire une incision parallèle seulement médiale pour les tendons qui sont parallèles à la colonne vertébrale, ainsi que des incisions perpendiculaires rostral et caudale de la vertèbre de cible. Veillez à ne pas couper trop profondément. Larme/cut away le muscle à l’aide de pinces-gouges. Utiliser la pince au besoin pour enlever les tissus restant sur la vertèbre ou au-dessus de la dure-mère dans l’espace intervertébral.
    4. Dans l’espace intervertébral, le vaisseau dorsal doit être visible de marquage de la ligne médiane de la moelle épinière. Pour les injections unilatérales, effectuer une laminectomie partielle en forant un trou dans le milieu du côté de la cible de la vertèbre. Utiliser une fine art dentaire appareil avec une fraise sphérique de 0,5 mm de perçage et forage particulièrement prudent lorsque vous approchez de la moelle épinière. Retirer des fragments d’os restant avec une aiguille biseautée de 26G d’exposer la moelle épinière.
    5. À l’aide d’une aiguille biseautée de 26G, perforer la dura dans le trou percé et dans l’espace intervertébral rostral et caudale à la vertèbre de la cible, tout environ 200 µm latérale au vaisseau sanguin dorsal. Le liquide céphalorachidien devrait être fuyant les trous et la moelle épinière devrait être légèrement exorbités.
  8. Préparation de la seringue d’Injection
    Remarque : La seringue d’injection doit être préparée immédiatement avant le début de l’injection pour réduire le risque de colmatage de la micropipette de particules de poussière.
    1. Monter le capillaire de verre sur une seringue de microlitre en utilisant la compression aiguille amovible, kit de fixation. Serrer l’écrou fermement pour assurer un ajustement serré et sûr.
    2. Remplir la seringue de microlitre avec de l’eau distillée stérile et démarrer en appuyant avec le piston.
      Remarque : S’il y a aussi beaucoup de résistance pour que l’eau ne sort pas facilement de la pointe, la micropipette est probablement bloquée et doit être changée.
    3. Montez la seringue sur un micromanipulateur relié à une commande électronique microinjector. Veillez à ne pas toucher quoi que ce soit avec une micropipette.
    4. À l’aide de la microinjector, dresser environ 1 µL d’air pour créer une bulle entre l’eau et le virus.
    5. Placez une goutte de 2,5 µL de solution de virus sur un morceau de pellicule de paraffine, déplacer délicatement l’extrémité de la micropipette dans la goutte en utilisant le cadre stéréotaxique et tirez-le vers le haut. Ensuite soigneusement presse diluer jusqu'à ce qu’un peu de solution antivirus émerge à la pointe.
    6. Retirer la seringue et, à l’aide d’un crayon, marquer la micropipette avec une échelle et noter le niveau de la solution de virus ; Cela facilitera le suivi de la question de savoir si l’infusion se poursuit tel que programmé.
  9. Injections intramédullaires
    1. Déplacer l’extrémité de la micropipette au-dessus d’un des trous de la dure-mère et puis vers le bas jusqu'à ce qu’une légère bosse est notée dans la dure-mère. Pour cibler l’injection de la corne dorsale spinale, déplacer vers le bas de 500 µm par incréments de 100 µm consécutives (vitesse 1 mm/s) et ensuite 200 µm vers le haut permettre une stabilisation mécanique du tissu.
      NOTE : La profondeur finale de la pointe est de 300 µm dans ce cas, mais peut être adaptée en fonction de la zone cible.
      1. Si le tissu est résistant à la pénétration, la micropipette pourrait être la capture sur la dure-mère. Dans ce cas, retirer et passer légèrement à recouvrent le trou, ou réutiliser l’aiguille pour perforer la dure-mère correctement avant de répéter la tentative de pénétration.
    2. Programmer la pompe pour un volume d’injection cible de 300 nL à une vitesse d’injection de 50 nL/min et appuyez sur la touche start pour commencer la perfusion.
    3. Une fois l’injection terminée, vérifier l’échelle pour voir si le niveau de virus a chuté et laissez la micropipette en place pour un 3 min supplémentaire permettre à la pression de s’équilibrer avant de lentement se retirer la seringue.
    4. Répétez l’étape 2.9.1.-2.9.3. pour les autres sites de deux injection.
  10. Suture et récupération
    1. Retirer les pinces de la colonne vertébrale et le coussin sous la souris.
    2. Refermer la plaie en couches avec des points de suture interrompus, suture de la peau et les couches de tissu superficiel avec des sutures résorbables avec sutures non résorbables. Appliquer le désinfectant de l’iode sur la plaie suturée.
    3. Fin de l’anesthésie et laisser l’animal sur le tapis de chaleur jusqu'à ce qu’il récupère avant de retourner à sa cage maison.
  11. Soins post-opératoires
    1. Surveiller la santé de l’animal sur le jour de l’opération, le lendemain et puis tous les 2-3 jours. Veiller à ce que l’animal a une démarche normale, une apparence saine (poids, yeux, fourrure et le comportement), et que la cicatrisation.
    2. Poursuivre le traitement analgésique (p. ex., 0,1 à 0,2 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée) si nécessaire, trois fois par jour.

3. comportementales et morphologiques des Analyses

  1. Analyse du comportement
    NOTE : Permettre aux animaux de s’adapter à la configuration respectif pendant au moins 30 min avant le début des mesures afin de leur permettre de s’adapter au nouvel environnement expérimental.
    1. Test de von Frey
      1. Placez les animaux individuellement dans des compartiments individuels d’environ 10 cm x 10 cm sur un sol de grille métallique.
      2. Stimuler la surface plantaire de la hindpaw homolatéral au site d’injection avec un filament de von Frey dynamique. Noter la force au cours de laquelle l’animal retire sa patte de stimulus.
      3. Répéter cinq fois et calculer le seuil de retrait moyen des six mesures pour chaque animal.
    2. Pin Prick Test
      1. Placer les animaux dans des compartiments individuels d’environ 10 cm x 10 cm sur un sol de grille métallique.
      2. Stimuler la surface plantaire de la hindpaw homolatéral au site d’injection avec une aiguille de 26-G atténuée sans pénétration de la peau. Score de comportement sous zéro (aucune réaction) ou un (réaction).
      3. Répéter 9 fois avec des intervalles de 3 min entre les stimulations et calculer le pourcentage de réponse de 10 mesures pour chaque animal.
    3. Injection de DREADD-ligand clozapine-N-oxyde (ONC)
      1. Dissoudre ONC dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour créer une solution mère de 0,2 mg/µL, qui peut être stocké à température ambiante.
      2. Le jour de l’expérience, diluer la solution mère stérile 0,9 % NaCl à 0,2 µg/µL et injecter 10 µL/g de poids de corps par voie intrapéritonéale. Injecter des animaux témoins avec véhicule (DMSO de 0,2 % à 0,9 % NaCl).
        NOTE : Selon expérience, effets maximaux sur les comportements peuvent être attendu 1-3 h après l’injection, et les effets devraient s’estomper complètement après 24h. Dans le cas de l’activation des neurones glycinergic, observé les comportements incluent les réponses réduits la douleur et la démangeaison. Comportements, évoquées par l’activation induite par la DREADD des neurones dépendra le sous-ensemble ciblé des neurones spinaux.
    4. Injection de Pruritogens pour provoquer des démangeaisons
      1. Dissoudre pruritogens 0,9 % NaCl à des solutions de 8 mg/mL (chloroquine) ou 10 mg/mL (histamine). 2 h après l’administration de l’ONC, injecter 10 µL de solution de pruritogen ou d’un véhicule par voie sous-cutanée dans la surface plantaire de la hindpaw ipsilatéral à la colonne vertébrale point d’injection. Alternativement, injecter la pruritogen par voie intradermique dans le mollet, ce qui a été rasé un jour avant pour réduire le comportement aversif causée par le rasage lui-même.
    5. Enregistrement vidéo pour analyser Nocifensive spontanée ou induite par le Pruritogen Itch comportements
      1. Placer animaux individuellement dans des compartiments transparents (environ 10 cm de diamètre) avec un peu de litière de leur cage maison respectif sur le sol.
      2. Filmer les animaux pendant 5 min à enregistrement spontané et pendant 30 min pour enregistrer les comportements induits par pruritogen. Analyser les vidéos off-line dans les bacs de 5 min.
    6. Douleur par rapport aux comportements des démangeaisons
      1. Observer et noter broncher, lécher et mordre les comportements.
        NOTE : Broncher et lécher du site incriminé sont considérées comme réponses à la douleur, tandis que mordre est associé à démangeaisons.
      2. Analyser des vidéos à une vitesse normale, mesurer le temps que la souris passé lécher ou de mordre le site incriminé ou de mesurer au ralenti pour une distinction plus précise entre lécher et mordre les réflexes. Sinon, comptez le nombre de bouts de léchage/mordre/broncher.
  2. Analyse morphologique
    1. Effectuer des analyses morphologiques d’une à trois semaines après l’injection du virus ou à la fin d’une expérience comportementale.
      NOTE : Nous avons détecté eGFP expression dès que 48 h après l’injection, mais aussi trouvé qu’expression augmente de façon significative dans les prochains jours et même semaines. Pour les cellules avec l’expression du Rapporteur forte, une semaine d’incubation (d’intrarachidienne jusqu’en perfusion) peut être suffisant. Pour les cellules avec faible transgene expression, virus avec faibles promoteurs ou des fluorophores plus faibles, il faudra une expression plus longue afin d’assurer des niveaux détectables.
    2. Fixation du tissu
      1. Perfuse chaque transcardially de souris, tout d’abord avec 20 ml de solution glacée artificielle le liquide céphalorachidien (FSCA) (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, 20 mM, KCl 2,5 mM et CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM de D-glucose), puis avec 100 mL de 4 % le paraformaldéhyde glacée (dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,4).
        ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique et doit être manipulé avec soin.
      2. Disséquer la moelle lombaire et fixer le tissu pendant 2 h avec 4 % de paraformaldéhyde sur la glace. Brièvement de laver le tissu après fixe avec tampon de phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,4) et puis il incuber dans une solution de saccharose de 25 % (dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,4) durant la nuit à 4 ° C.
      3. Couper le tissu cryoprotected à 30 μm sur un cryostat et monter les sections sur lames de microscope.
    3. Immunofluorescence souillant
      1. Après brèves lavages en PBS, appliquer 300 μL de la solution de blocage (10 % de sérum Normal âne dans 0,3 % Triton-PBS) sur les sections pendant 1 h à température ambiante.
      2. Incuber les lames avec 300 μL des combinaisons respectifs des anticorps primaires en bloquant la solution (voir la Table des matières) toute la nuit à 4 ° C. Laver les sections 3 fois pendant 5 min chacun dans du PBS.
      3. Incuber les lames avec les combinaisons respectifs des anticorps secondaires dans la solution de saturation pendant 1 h à température ambiante. Laver les sections 3 fois pendant 5 min chacun dans du PBS.
      4. Brièvement rincer les lames à FD2O, puis fixer les lamelles à l’aide du milieu de montage fluorescent.
      5. Acquisition d’images fluorescentes à l’aide d’un microscope confocal, équipé d’un 20 x et un objectif 40 x.

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Résultats

Afin d’illustrer les niveaux d’expression qui peuvent être obtenues par l’administration intrarachidienne du rAAV codant pour une protéine marqueur, nous avons tout d’abord injecté AAV1. CAG.eGFP dans la moelle épinière lombaire de souris de type sauvage. Trois injections espacées de 1 mm environ produit une infection quasi continue des segments de la colonne vertébrale lombaires L3 à L5 (Figure 1 a-C). Injection de virus à une profondeur de ...

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Discussion

Intrarachidienne de AAVs peut devenir une technique puissante dans un laboratoire de recherche, qui permet l’analyse des cellules de la colonne vertébrale avec une solution spatiale et temporelle élevée. Ce protocole permet la transduction des trois segments spinaux principales innervés par des neurones sensoriels s’étendant leurs axones périphériques aux membres postérieurs. Transduction de trois segments produit des données comportementales robustes et reproductibles. Il permet aussi l’essai d’une plus grande surface s...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Hanns Ulrich Zeilhofer pour soutenir généreusement ce travail. Hendrik Wildner a été soutenu par la Fondation Olga Mayenfisch. Nous remercions l’anticorps Lmx1b Carmen Birchmeier.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Extracteur de micropipettes
 : DMZ-Universal-Electrode-PullerZeitzNA
Unité d’anesthésie : Oxymat3 Concentrateur d’oxygèneWeinmannNA
Unité d’anesthésie : VIP 3000 Vaporisateur vétérinaireMidmarkNA
Tapis chauffant : Mio Star Thermocare 100Migros
Rasoir électriquePhilipsBT9290
microscope chirurgical (OPMI pico)ZeissNA
Appareil stéréotaxique pour petits animauxKopfNA
Neurostar StereoDrive (en option)NeurostarNA
Modèle 51690 Souris Cunningham adaptateur rachidienHarvard Appareil72-4811
Pousse-seringue PHD Ultra avec nanomiteHarvard Apparatus70-3601
Hamilton 701 RN 10 &mu ; l seringue microlitre en verreHamilton7635-01
Hamilton Raccord à compression à aiguille amovible (RN) 1 mmHamilton55750-01
appareil de forage en dentisterie fine : Osada success 40OsadaOS-40
coupe-roche, 0,5 mmBusch12001005B
anesthésiomètre électronique von FreyIITC23905
flexible von Frey hairsIITC#7
LSM710 Microscope confocal PascalZeissNA
0.8 NA & times ; 20 Objectif Plan-apochromatZeissNA
1.3 NA × ; 40 EC Objectif à immersion dans l’huileZeissNA
strong>Nom<>EntrepriseNuméro de catalogueComments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cmFine Science Tools10004-13
Ciseaux Bonn Extra FineScience Tools14084-08
Pince Adson, 1 x 2 dents, 12 cmFine Science Tools11027-12
Rongeurs Friedman-Pearson, courbés, coupelle de 0,7 mmOutils de science fine16121-14
Pince à laminectomie Dumont #2Outils de science fine11223-20
Porte-aiguilles Olsen-Hegar, dentés, longueur de pince de 8,5 mmOutils de science fine12002-12
Pince fine #5Outils de science fine11254-20
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
>Consommables et produits chimiques
Capillaire en verre à paroi mince, diamètre extérieur de 1 mmWorld Precision InstrumentsTW 100-3
Seringues (1, 5 et 20 ml)B. Braun(9166917V, 4606051V, 4606205V)
Aiguille biseautée 26GB. Braun4665457
Lames de scalpel stérilesB. BraunBB523
Sutures chirurgicales Safil Quick+ 4/0, résorbablesB. BraunC1046220
Sutures chirurgicales Premilene 5/0, non résorbablesB. BraunC0932191 PBS
stériles ou salines (0,9 %)NA
Éthanol, 70 % (désinfectant)NA
Solution d’iode (par ex. Braunol)B. Braun18380
Anesthésiques (par ex. Attane isoflurane)Provet2222
AldasorberProvet333526
analgésiques (par ex. buprénorphine : temgesic)IndiviorGTIN : 7680419310018
Ophtalmique pommade (par ex. vita-pos)Pharma medicaGTIN : 4031626710635
Cotons-tiges (p. ex.)IVF Hartmann1628100
Mouchoirs en papier (p. ex.)Uehlinger AG2015.10018
Superfrost plus lames de microscopeThermoScientificJ1800AMNZ
Nom><>Company Numéro de catalogueComments
Mice
C57BL/6J souris (wildtype)The Jackson LaboratoryRRID :IMSR_JAX :000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (ROR&beta ; Cre)The Jackson LaboratoryRRID :IMSR_JAX :023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom)The Jackson LaboratoryRRID : IMSR_JAX :007914
Name>CompanyCatalog NumberComments
Vecteurs viraux
AAV1. CB7. CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1. CAG.eGFP)Penn Vector CoreAV-1-PV1963
AAV1. CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1. CAG.flex.eGFP)Penn Vector CoreAV-1-ALL854
AAV1. CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1. CAG.flex.tdTomato)		Penn Vector CoreAV-1-ALL864
AAV1. EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1. EF1a.flex.DTA)Penn Vector CoreProduction
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))PennVector CoreProduction
NameCompanyNuméro de catalogueComments
Plasmides
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361
pAAV.EF1&alpha ;. flex.hChR2(H134R)-eYFPAddgene20298
NameCompanyNuméro de catalogueComments
>Bacteria
MDS42ScarabGenomics
Stbl3ThermoScientificC737303
NomEntreprise>Numéro de catalogueComments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi KitQuiagen12362
NucleoBond PC 500Machery & Nagel740574
clozapine-N-oxyde (CNO)Enzo Life SciencesBBL-NS105-0025
sel de diphosphate de chloroquineSigmaC6628
histamineSigmaH7125
DapiInvitrogenD3571
NameCompany<strong>Numéro de catalogueComments
Anticorps (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000)Sondes moléculairesRRID :AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000)AbcamRRID :AB_10711153
Chèvre anti-Pax2 (1 : 200)R & D SystemsRRID :AB_10889828
Cobaye anti-Lmx1b (1 : 10 000)Dr Carmen BirchmeierMuller et al. 2002
Lapin anti-GFAP (1 : 1000)DakoCytomationRRID :AB_10013382
Anticorps secondaires élevés chez l’âne (1:800)Jackson ImmunoResearch LaboratoriesNA
717614700000<personnalisée personnalisée

Références

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Vecteurs Cre d pendantsinjection intraspinalecorne dorsalesouris GlyT2 Crechirurgie st r otaxiquetransduction viralesous populations neuronalestraitement sensoriel

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