À long terme vivre-cellule d’imagerie afin d’évaluer le sort de la cellule en réponse au Paclitaxel

Résumé

Imagerie de cellules vivantes fournit une foule de renseignements sur des cellules individuelles ou des populations entières qui est inaccessible par cellule fixe d’images seul. Ici, les protocoles d’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions de sort de cellule après un traitement par le paclitaxel drogue anti mitotique sont décrits.

Résumé

Imagerie de cellules vivantes est une technique puissante qui permet de visualiser directement des phénomènes biologiques dans des cellules individuelles sur de longues périodes de temps. Ces dix dernières années, les technologies nouvelles et novatrices ont grandement amélioré l’aspect pratique de l’imagerie de cellules vivantes. Les cellules peuvent désormais être conservés en bref et imagé en continu sur plusieurs jours tout en entretien dans 37 °C et 5 % CO₂ conditions de culture cellulaire. En outre, plusieurs champs de vision représentant les différentes conditions expérimentales peuvent être acquises en même temps, fournissant ainsi des données expérimentales de haut débit. Imagerie de cellules vivantes fournit un avantage significatif sur l’imagerie de cellules fixes en permettant la visualisation directe et au dosage temporelle des événements cellulaires dynamiques. Imagerie de cellules vivantes peut également identifier des variations dans le comportement des cellules simples qui aurait autrement été raté à l’aide de tests basés sur la population. Nous décrivons ici les protocoles d’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions de sort de cellule après un traitement par le paclitaxel drogue anti mitotique. Nous démontrons que des méthodes pour visualiser si mitotiquement arrêté cellules meurent directement à partir de la mitose ou retomber dans interphase. On décrit aussi comment le système d’indicateurs (FUCCI) axée sur l’ubiquitination fluorescent de cycle de cellules permet d’évaluer la fraction des cellules en interphase né de glissement mitotique qui sont capables de rentrer dans le cycle cellulaire. Enfin, les auteurs décrivent une méthode d’imagerie de cellules vivantes pour identifier des événements de rupture de membrane nucléaire.

Introduction

Les médicaments anti-mitotiques ont longtemps été utilisés dans les schémas de chimiothérapie de divers types de tumeurs solides et font souvent preuve d’efficacité grande^1,2,3. Mécaniquement, ces médicaments perturbent la progression mitotique normale et promouvoir l’arrêt mitotique en prolifération rapide des cellules de cancer. Toutefois, le sort de la cellule en réponse à l’arrêt mitotique est très variable : alors qu’une fraction des cellules subit une mort cellulaire directement à partir de la mitose, d’autres quitter mitose et reprendre l’interphase comme cellules tétr....

Protocole

Ce protocole porte sur l’utilisation de la non transformées et stable sur le plan chromosomique rétine pigmentée épithéliales (pre-1) lignée cellulaire pour des expériences d’imagerie de cellules vivantes. Toutefois, le présent protocole peut être adapté à n’importe quelle ligne de cellules adhérentes tant que les conditions de culture cellulaire sont ajustées selon les besoins. Institutionnel sur la biosécurité et les directives éthiques et les règlements doivent respecter toutes les procédures.

1. préparation des cellules pour l’imagerie de cellules vivantes

1. Utiliser les cellules de pre-1 passage fraîchement décongelées....

Résultats

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, pre-1 cellules exprimant H2B-GFP ont été traités avec un contrôle anti mitotique ou véhicule (DMSO) et analysées par imagerie de cellules vivantes. L’analyse a révélé que 100 % des cellules mitotiques de pre-1 contrôle initié l’anaphase en moyenne 22 min après être entré dans la mitose (Figure 1 a, 1D). En revanche, pre-1 cellules traitées par paclitaxel ont montré un profond arrêt mitotique durant .......

Discussion

L’aspect le plus important de l’imagerie de cellules vivantes à long terme est d’assurer la santé des cellules étant imagé. Il est essentiel que les cellules soient exposés à minimales stresseurs environnementaux extérieurs, tels que des conditions non conformes aux normes concernant l’humidité, de température et/ou de CO₂ niveaux. Il est également important de limiter le photovieillissement d’éclairage fluorescent d’excitation, comme l’imagerie stress est connu pour affecter la cellule comportement

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
sans rouge de phénol, milieu DMEM :F12	Hyclone	SH3027202
10 % de sérum de veau fœtal (FBS)	Gibco	10438026
100 UI/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine.	Gibco	15070063
PBS	Gibco	10010049
0,25 % Trypsine/EDTA	Gemini	50-753-3104
Antenne d’imagerie à fond de verre à 12 puits	Cellvis	P12-1.5H-N
Paclitaxel	TSZ Chem	RS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	NC0215085
Environmental Chambre	In Vivo Scientific
5 % CO2	Airgas	Z03NI7432000201
15 mL Tubes coniques	Fisherbrand	05-539-12
10 cm Plaques de culture tissulaire en polystyrène	Falcon	08772E
10 mL Pipette sérologique jetable	Fisherbrand	4488
5804R 15 ampères Centrifugeuse	Eppendorf	97007-370
1000 microlitres Pipette	Gilson	Pipetman Classic
20 microlitres Pipette	Gilson	Pipetman Classic
p1000 Pointes de pipette	Sharp	p1126
p20 Pointes de pipette	Sharp	P1121
RPE-1 Cellules	ATCC	CRL-4000
Incubateur Galaxy 170S	Eppendorf	CO17011005
Pipette Boy Integra		156401
Hémacytomètre	Fisher Scientific	0267110
Nikon Ti-E-PFS Microscope inversé pour l’imagerie de cellules vivantes	Micro Video Instruments, Inc.
système de scène X-Y Prior et illuminateur LED à lumière blanche	Micro Video Instruments, Inc.	500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Contrôleur XYZ avec encodeurs	Micro Video Instruments, Inc.	500-H31XYZE
Andor Appareil photo numérique	Micro Video Instruments, Inc.	D10NLC
Nikon NIS Elements AR Software	Micro Video Instruments, Inc.
Illuminateur LED SOLA pour Fluorescence	Micro Video Instruments, Inc.	SOLA-E
InVivo avec contrôle du débit de CO2	Micro Video Instruments, Inc.	Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Porte-objectifs motorisés Perfect Focus	Micro Video Instruments, Inc.
système Ti-C Condensateur Tourelle	Micro Video Instruments, Inc.
Ti-C LWD LWD Unité d’objectif pour système de condenseur tourelle	Micro Video Instruments, Inc.
Te-C LWD Ph1 Module	Micro Video Instruments, Inc.
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm	Micro Video Instruments, Inc.
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective	Micro Video Instruments, Inc.

MEA53100MQS31000Chambre environnementale MEP59391MEL51000MEL56200MEH41100MRH10101MRH48230