Synthèse des Nanotubes de carbone Multi modifiés avec des nanoparticules d’argent et de l’évaluation de leurs activités antibactériennes et propriétés cytotoxiques

Résumé

Dans cette étude, les nanomatériaux antimicrobiens ont été synthétisés par oxydation acide de multiwalled nanotubes de carbone et ultérieures dépôts réductrice des nanoparticules d’argent. Des tests de cytotoxicité et une activité antimicrobiennes ont été réalisées avec les nanomatériaux comme préparés.

Résumé

Dans cette étude, les nanotubes de carbone multi (NCPM) ont été traités avec une solution aqueuse d’acide sulfurique pour former un groupe fonctionnel de base d’oxygène. NCPM argent ont été préparés par la déposition réductrice d’orfèvrerie de solution aqueuse d’AgNO₃ sur le NCPM oxydé. Compte tenu de la couleur unique des CNTs, il n’était pas possible de les appliquer à la concentration minimale inhibitrice ou les épreuves de toxicité mitochondriale pour évaluer les propriétés antibactériennes et de toxicité, car il interférerait avec les dosages. La zone d’inhibition et de la concentration bactéricide minimale pour l’Ag-NCPM ont été mesurés et Live/Dead et bleu Trypan dosages ont été utilisés pour mesurer les propriétés antibactériennes et de toxicité sans interférer avec la couleur des CNTs.

Introduction

Le but ultime de cette étude doit faire des nanomatériaux antibactériens respectueuses de l’environnement qui peuvent inhiber la croissance des bactéries qui forme des biofilms. Ces nanomatériaux antibactériens est susceptibles de surmonter les problèmes de résistance antibiotique et la toxicité des produits chimiques couramment utilisés ou composés chimiques aux antibiotiques. Un biofilm est une substance polymérique extracellulaire hydratée (EPS) qui est composée de polysaccharides, protéines, acides nucléiques et lipides^1,2. Les biofilms empêcher l’intrusion des substances étrangères et aider les bactéries à croître vigoureusement^3,4. Biofilms causer des odeurs et des maladies infectieuses chroniques^5,6. Methylobacterium spp., par exemple, pousse en adhérant aux endroits où l’eau est toujours présente ou lorsqu’il est difficile de garantir l’éradication bactérienne sur une base continue, tels que les échangeurs de chaleur à air conditionné, salles de douche et des dispositifs médicaux. Ces types de biofilms causent l’odeur et les maladies infectieuses chroniques^5,6.

En général, produits chimiques ou composés chimiques aux antibiotiques sont utilisés pour inhiber la croissance des bactéries qui forment des biofilms. L’émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques et les préoccupations au sujet de in vivo la sécurité des produits chimiques sont à l’origine la nécessité de développer de nouveaux matériaux afin d’empêcher la formation de biofilms et d’inhiber la croissance des bactéries.

Dans cette étude, nanomatériaux antimicrobiens est synthétisées que sont exempts de toxicité et de la résistance aux antibiotique. L’argent est une substance antimicrobienne bien connue, et les développements récents en nanosciences et nanotechnologies ont conduit à une recherche active sur les effets antimicrobiens de nanoparticules métalliques^7,8. Des études récentes ont rapporté que la petite taille et surface-volume élevé des nanoparticules entraîne l’augmentation de l’activité antibactérienne^9,10,11.

Les nanomatériaux présentées ici combine des nanoparticules d’argent avec une augmentation des propriétés antimicrobiennes et nanotubes de carbone avec un haut rapport d’aspect, ce qui augmente la surface par unité de volume. Composite fabriqué argent NANOPARTICULE-carbone nanotube pièces importantes propriétés antimicrobiennes et toxicité minimale aux cellules humaines et animales. Les procédés de synthèse dans les études précédentes utilisent dangereux agents réducteurs comme NaBH₄, formamide, diméthylformamide et l’hydrazine. Le processus est compliqué, dangereux et beaucoup de temps. Le processus synthétique rapporté ici utilise l’éthanol comme agent réducteur beaucoup moins dangereux.

La zone d’inhibition et les concentration minimale bactéricide (MBC) pour l’Ag-NCPM ont été mesurés ; Live/Dead et le bleu Trypan dosages ont été utilisés pour mesurer la toxicité et des propriétés antibactériennes. Concentration minimale inhibitrice (CMI) et les épreuves de toxicité mitochondriale (MTT) ne étaient pas effectuées en raison de la couleur inhabituelle des nanotubes de carbone qui aurait dû intervenir avec les dosages. Enfin, la concentration minimale pour empêcher la croissance de Methylobacterium spp sans affecter les cellules de mammifères a été déterminée.

Protocole

1. oxydation de le MWCNT

1. Mesurer de 30 à 50 mg de MWCNT dans un flacon de 50 mL. Ajouter lentement 8 mL d’un H₂SO₄: solution HNO₃ (90 % de concentration initiale, 3:1 vol/vol) avec pointes de pipette de 1 mL à l’aide d’une pipette.
   ATTENTION : Cette préparation doit être effectuée sous une hotte chimique.
   1. Laisser 30 min pour la réaction exothermique terminer.
2. Laisser agir la solution à 60-80 ° C et 160 W pendant 1 h jusqu'à ce que MWCNT se dépose au fond du flacon.
   ATTENTION : Le niveau d’eau dans le sonicateur doit être inférieur à la partie supérieure du flacon afin que l’eau ne sera pas introduite dans le flacon.
3. Transvaser la solution dans un tube à centrifuger.
   1. Avec une micropipette, ajouter 30 mL d’eau distillée goutte à goutte la solution de MWCNT-COOH.
      ATTENTION : Une forte réaction exothermique se produit au cours de l’addition d’eau distillée. Ajouter lentement de l’eau distillée et laisser le temps de refroidissement.
4. Centrifuger la solution MWCNT-COOH à 12 000 x g et à température ambiante pendant 15 min.
   ATTENTION : Lorsque vous utilisez une centrifugeuse, assurer que la centrifugeuse reste équilibrée en plaçant un tube avec le même poids en face le tube à essais.
5. Retirez le surnageant avec une pipette et la pointe de pipette de 1 mL. Ajouter 5 mL d’éthanol avec une pipette et la pointe de pipette de 1 mL. Rincer les parois de la cuvette avec de l’éthanol pipeté supplémentaire. Centrifuger la solution à 12 000 x g et à température ambiante pendant 15 min.
   1. Déterminer le pH du liquide surnageant avec du papier pH. Répéter le lavage et centrifugation jusqu'à ce que le surnageant pH est neutre.
6. Retirez tous les surnageant. Ajouter 1 mL d’eau distillée à précipiter et disperser MWCNT-COOH uniformément dans la solution. Freeze-Dry solution à-60 ° C sous vide jusqu’au sec.

2. argent NANOPARTICULAIRE dépôts sur NCPM

1. Placer 10 mg de MWCNT-COOH dans un tube conique de 50 mL et diluer avec 30 mL d’eau distillée. Laisser agir la solution à 60 ° C et 160 W pendant 1 h.
2. Placer 6 mL de 0,1 N AgNO₃ dans un tube conique de 50 mL et diluer avec 18 mL d’eau distillée. Laisser agir la solution à 60 ° C et 160 W pendant 1 h.
   ATTENTION : Ajouter AgNO₃ proportionnellement à la masse totale de NCPM tel que la masse totale des Ag ne dépasse pas 20 %.
3. Ajouter l’AgNO₃ solution goutte à goutte la solution de NCPM avec une pipette et la pointe de pipette 1 mL tout en sonification le mélange à 60 ° C et 160 w. continuer sonification pendant 1 h après avoir ajouté l’AgNO₃.
4. Centrifuger la solution à 12 000 x g et à température ambiante pendant 15 min et retirez le surnageant. Centrifuger la solution et éliminer le surnageant deux fois supplémentaires.
5. Ajouter 1 mL d’eau distillée dans le mélange d’Ag-NCPM et disperser le précipité uniformément dans la solution. Ajouter 5 mL d’éthanol et de permettre la réaction de procéder à la température ambiante pendant 1 h.
6. Centrifuger la solution à 12 000 x g et à température ambiante pendant 15 min et retirez le surnageant.
7. Déterminer le pH du liquide surnageant avec du papier pH. Répéter le lavage et centrifugation jusqu'à ce que le surnageant pH est neutre.
8. Ajouter 1 mL d’eau distillée à Ag-NCPM et disperse uniformément dans la solution. Freeze-Dry de la solution à-70 ° C sous vide pendant 24 h.

3. zone d’Inhibition Test

1. Mélanger 18,12 g d’agar R2A et 1 L d’eau distillée dans une fiole. Stériliser le mélange dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
2. Laisser refroidir à température ambiante. Placer 10 mL de gel en Pétri avant durcissement de préparer le milieu solide.
3. Place 100 µL de bactéries sur le support solid. Transmettre la bactérie sur le milieu solide à l’aide d’un épandeur.
   ATTENTION : Cette procédure doit être effectuée sous une hotte chimique, éclairée par une lampe à alcool.
4. Incuber les boîtes à 30 ° C pendant 48 h.
5. Mélanger 3,12 g de bouillon R2A avec 1 L d’eau distillée dans une fiole. Stériliser le mélange dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
6. Transférer les colonies cultivées dans un milieu liquide à l’aide d’une boucle et une aiguille et incuber dans un incubateur à 180 tr/min et 30 ° C.
7. Enregistrer la valeur do (densité optique) par spectrophotométrie UV à 600 nm sur une base horaire pour mesurer la croissance bactérienne.
   NOTE : Agar R2A a été utilisé dans cet essai, plutôt que la gélose de Mueller-Hinton standard, car R2A est la gélose préférée pour la croissance de Methylobacterium spp.
8. Placer 10 mL de prêt agar R2A dans une boîte de Pétri pour préparer une gélose de fond.
   1. Mélanger 3,12 g de bouillon R2A et 8 g d’agar avec 1 L d’eau distillée. Stériliser le mélange dans un autoclave à 121 ° C pendant 15 min. placer 10 mL de ce gel sur l’agar de fond.
9. Charge 50 µL de solution d’Ag-NCPM sur disque papier stérile avec une micropipette.
   1. Sécher et stériliser Ag-NCPM d’échantillon dans une chambre à vide sous ultraviolets pendant 30 min.
10. Échantillon place Ag-NCPM sur agar.
11. Incuber la gélose à 30 ° C pendant 48 h.
12. Zone de mesure de l’inhibition¹².
    Remarque : Les Instructions pour les logiciels utilisés sont incluses dans les références.

4. antibactérien Test

1. Répétez les étapes 3.1 à 3.7 pour préparer la culture bactérienne.
2. Au maximum OD, ensemencer 100 µL de bactéries dans 3 mL de milieu liquid frais avec une pointe de pipette micro pipette et 100 µL.
3. Préparer cinq 50 échantillons µL de la solution de contrôle dans les tubes coniques 15 mL. Ajoutez le code suivant dans chaque tube : 1) méthanol ; 2) 1000 µg/mL MWCNT-COOH ; 3) 50 µg/mL Ag-NCPM ; 4) 40 µg/mL Ag-MWMWCNTs ; 5) 30 µg/mL Ag-NCPM.
4. Incuber à 180 tr/min et 30 ° C jusqu'à ce que le contrôle soit au maximum actif telle que déterminée par spectrophotométrie UV comme décrit ci-dessus.
5. Mesurer la valeur de la D.O. de chaque échantillon et calculer la concentration de MIC. La valeur de l’OD est directement liée au nombre de cellules bactériennes dans le bouillon de l’échantillon.
6. Propager les bactéries cultivées sur un milieu solide avec un épandeur.
7. Incuber le plat à 30 ° C pendant 48 h.
8. Compter les colonies bactériennes et les valeurs d’UFC de mesure pour déterminer l’activité antibactérienne¹².
   Remarque : Les Instructions pour les logiciels utilisés sont incluses dans les références.

5. analyse de viabilité

1. Après avoir enlevé les cellules de la culture de l’incubateur, le milieu de succion et laver trois fois avec un goutte à goutte lavage de 5 mL de PBS.
2. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA dans du PBS aux cellules lavées et aspiration après 1 min.
   1. Taper la plaque pour déloger les cellules coincés.
3. Ajouter 5 mL de DMEM (de l’aigle de la modification de Dulbecco moyen) et ensuite enlever les cellules. Centrifuger les échantillons à 200 x g pendant 3 min et retirez le surnageant.
   1. Ajouter 1 mL de SPD et mélanger.
   2. Compter les cellules dans 10 µL de la solution avec une machine de comptage cellulaire automatisée.
      NOTE : Instructions pour les machines de comptage cellulaire utilisé sont incluses dans les références¹³.
4. Placez 1 × 10⁵ de AML12 cellules / puits dans une plaque de six puits contenant une solution DMEM. Le milieu contient 1 % antibiotique stérile et sérum de veau fœtal 10 % (v/v).
5. Incuber les plaques pendant 8-12 h à 37 ° C dans un environnement d’air 95 % 5 % CO₂.
6. Aspirer le surnageant des puits avec un aspirateur.
   1. Ajouter chaque échantillon composé de contrôle, NMS-DMSO (diméthyl sulfoxyde) et 30 à 40 µg/mL Ag-MWCNT à 1 mL de DMEM.
   2. Incuber à 37 ° C dans un environnement d’air 95 % 5 % CO₂pendant 8 h.
7. Prélèvement d’échantillons de surnageants et laver avec 5 mL de PBS.
8. Ajouter 1 mL de prêt direct/dé kit (20 µL de 2 mM EthD-1 5 µl de 4 mM de calcéine AM dans le DMSO dans 10 mL de PBS) goutte à goutte à la cellule.
9. Incuber à ambiant pendant 30-45 min ou 37 ° C pendant 10 min. fluorescence mesure avec la microscopie en fluorescence standard 100 X ou 300 X.

6. dosage de bleu Trypan

1. Préparer les échantillons selon des mesures 5.1 et 5.6.2 ci-dessus.
2. Retirez le surnageant.
3. Laver la plaque avec 1 mL de 1 x DPBS et décanter.
4. Ajouter 1 mL de trypsine à plaque et incuber pendant 3 min détacher les cellules de culture. Milieu de culture cellulaire permet de laver la plaque et de prélever des cellules. Placer les cellules recueillies dans un tube de 15 mL.
5. Centrifuger le tube à 200 x g et 4 ° C pendant 3 min.
6. Jeter le surnageant. Ajouter 1 mL de milieu frais à culot cellulaire et re-disperser les cellules.
7. Ajouter 10 µL du bleu trypan avec 10 µL de cellules dispersées et compter les cellules avec une machine de comptage cellulaire automatisée.
   NOTE : Les Instructions pour machine de comptage cellulaire utilisé sont incluses dans les références.

Résultats

Images de microscopie électronique (met) de transmission confirment la formation d’Ag-NCPM (Figure 1 a et 1 b). Leur synthèse réussie a été confirmée par la variation de charge superficielle. La taille des particules déposées sur la NCPM Ag a été calculée (Figure 1). La taille moyenne des particules était environ 3,83 nm. Le modèle XRD de l’Ag-NCPM synthétisés comme est montré dans la Figure...

Discussion

Nous rapportons ici une méthode simple pour la préparation des NCPM avec des nanoparticules Ag déposés. Ce nanomatériau contenant de l’argent montre une activité antibactérienne importante et un potentiel minimal pour l’absorption non contrôlée de nanoparticules d’argent dans le corps. Nous démontrons que 30 µg/mL de synthèse Ag-NCPM est un niveau effectif d’une activité antibactérienne contre Methylobacterium spp avec négligeable cytotoxicité pour les cellules du foie chez les mammifères. Bien que des améliorat...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,1 N nitrate d’argent	SIGMA-ALDRICH	1090811000
Nanotube de carbone, multi-parois	Tokyo Chemical Industry Co., LTD	308068-56-6
Gélose R2A	MBcell	MB-R1129
R2A bouillon	MBcell	MB-R2230
Methylobacterium spp.	KCTC	12618	de Corée Collection pour Cultures de Type Daejeon Corée 12618, Daejon, Corée
Kit d’imagerie cellulaire LIVE/DEAD	ThermoFisher SCIENTIFIC	R37601
AML12			de l’Université de Chungnam, Dajeon, Corée
humain PBMC	ATCC	PCS-800-011
TEM	JEOL	JEM-2100F
XRD	Rigaku	D/MAX 2500	Source de photons Cu K (40kV, 100mA)
JuLI Br	NanoEnTek	JULI-BRSC  ;