Un modèle à thorax fermé pour induire la Constriction de l’aorte transversale chez les souris

Résumé

Nous présentons ici un protocole de constriction transversal aortique (TAC) par une thoracotomie latérale. Cette technique est une intervention chirurgicale thoracique minimalement invasive, fermé visant à simuler une surcharge de pression et l’insuffisance cardiaque chez les souris en utilisant des paramètres standard de laboratoire de TAC.

Résumé

Recherche sur l’hypertrophie cardiaque et insuffisance cardiaque repose souvent sur des modèles de souris de surcharge de pression induites par le TAC. La procédure standard consiste à effectuer une thoracotomie partielle afin de visualiser le grand arc aortique. Cependant, le traumatisme chirurgical, due à la thoracotomie à thorax ouvert modèles remplace la physiologie respiratoire car les côtes sont disséqués et laissés seules après la fermeture de la poitrine. Pour éviter cela, nous avons établi une approche de coffre mini-invasive, fermée par thoracotomie latérale. Ci-après nous approchons la crosse aortique par l’intermédiaire de l’espace intercostal 2^nd sans entrer dans les cavités thoracique, laissant la souris avec un traumatisme moins pour récupérer à partir. Nous effectuons cette opération en utilisant les paramètres de laboratoire standard pour les procédures de thorax ouvert TAC avec des taux de survie égale. En dehors de maintien des patterns de respiration physiologique due à l’approche de thorax fermé, les souris semblent profiter en montrant une restauration rapide, comme la technique moins invasive apparaît pour faciliter un processus de guérison rapide et pour réduire la réponse immunitaire après un traumatisme.

Introduction

Modèles de souris sont souvent utilisés pour simuler des maladies humaines¹. Rétrécissement aortique transversal (TAC) est utilisé pour induire une surcharge de pression et l’hypertrophie ventriculaire gauche². Le modèle de TAC thorax ouvert chez la souris a été validé par Rockman et al. ³ et l’intervention chirurgicale est décrite en détail par Delisle et al. ⁴. baguage de l’aorte transverse est plus favorable en comparaison de la constriction de l’aorte abdominale, car une grande partie de la circulation peut compenser les effets négatifs de cette dernière procédure².

Le cerclage de l’aorte transversale mène à une augmentation de la pression artérielle dans l’aorte ascendante et l’artère brachiocéphalique mais laisse suffisamment perfusion des organes par l’intermédiaire des vaisseaux distaux (c.-à-d. l’artère carotide commune gauche, la sous-clavière gauche artère et l’aorte descendante). Cela conduit à une augmentation de la postcharge cardiaque et un stress de la paroi cardiaque élevé. La tension pariétale diminue par la suite en raison de l' épaississement de fibre⁵. La variation hémodynamique cardiaque chronique entraîne Erreurs d’adaptation et une dilatation du ventricule gauche. De cette façon le TAC crée un modèle reproductible de l’hypertrophie cardiaque aboutissant à une insuffisance cardiaque.

La procédure normalisée pour TAC tel que décrit par DeAlmeide et al. ⁴ approches de la crosse aortique par une thoracotomie supérieure partielle par dissection des côtes ou du sternum et entrant dans le médiastin ainsi que la cavité pleurale. Cela permet une bonne vue de l’aorte et ses branches latérales. Malheureusement, les côtes découpées ne peut pas être remis en place, qui leur laisse flotter librement et altérant ainsi la dynamique de la respiration.

Nous avons, a donc établi une approche mini-invasive à thorax fermé la crosse aortique en utilisant une approche chirurgicale latérale via l’espace intercostal 2^nd . Le plus grand avantage de ce modèle est la capacité d’exécuter des TAC sans même couper à travers les côtes. Le traumatisme chirurgical se limite à l’incision de la peau et la dissection des muscles intercostaux. Cette procédure réduit le traumatisme lui-même et contribue à maintenir la stabilité de la poitrine adéquate.

Ici, nous décrivons une procédure détaillée étape par étape pour effectuer la chirurgie TAC chez les souris sans effectuer le total ou la thoracotomie supérieure. Haute fréquence Doppler a été utilisée pour assurer le succès de la TAC comme décrit précédemment, ^6,7.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité d’éthique pour Animal Experimentation LANUV Recklinghausen (#84-02.04.2016.A374). En règle générale, cette procédure est effectuée sur des souris adultes > 10 semaines d’âge. Toutefois, il est possible d’effectuer cette chirurgie sur aussi bien les jeunes animaux. Instruments chirurgicaux doivent être stérilisés avant usage et toutes les mesures doivent être effectuées dans des conditions aseptiques.

1. l’induction de l’anesthésie et l’Intubation

1. Injecter la buprénorphine 0,1 µg/g de poids corporel par voie intrapéritonéale pour soulager la douleur. Répéter les injections intrapéritonéales de buprénorphine 0,1 mg/kg toutes les 8 h pour les trois prochains jours après la chirurgie.
2. Pour l’induction, placez votre souris dans une boîte d’induction de l’anesthésie qui est reliée au vaporisateur mis à 3,0 % en volume d’isoflurane avec un débit d’oxygène de 1 L/min.
3. Assurer la narcose profonde en induisant un stimulus tactile.
   NOTE : Augmentation vol% d’isoflurane jusqu'à 5 %, si l’induction de l’anesthésie échoue ou narcose n’est pas assez profonde.
4. Pincer la queue de la souris afin d’assurer l’absence de réflexe. En cas d’absence totale de réflexes, peser la souris pour l’installation de ventilation optimale (voir 1.12).
5. Déplacez la souris vers une table d’opération température contrôlée pour maintenir une température corporelle de 37 ° C tout au long de la procédure.
6. Placer le nez de la souris dans un cône en plastique qui est relié à la boîte d’induction de l’anesthésie pour maintenir la narcose.
7. Difficulté les incisives supérieures de la souris avec une suture en nylon. Fixer les extrémités d’un ruban adhésif.
8. Appliquer une pression sur la patte arrière avec l’extrémité de la pince pour assurer une narcose adéquate à nouveau. En l’absence d’un réflexe de retrait continuer avec les étapes suivantes.
   NOTE : Augmenter le % de volume d’isoflurane si l’induction de l’anesthésie échoue ou narcose n’est pas assez profonde et attendre que l’absence du réflexe de retrait.
9. Placez un lubrifiant ophtalmique stérile sur les cornées pour empêcher la dessiccation sous anesthésie.
10. Lubrifier la sonde rectale pour éviter un traumatisme rectal. Insérer une sonde de température rectale afin d’assurer une température de 37 ° C.
11. Épiler la gorge et le haut de la poitrine avec une crème dépilatoire selon les instructions du fabricant. Essuyer la crème après 1 min. Si nécessaire, répétez cette étape jusqu'à ce que réussie.
    Remarque : Utiliser des écouvillons coton-tige en cas de saignement.
12. Nettoyez la zone épilée avec de l’éthanol à 70 %. Puis appliquez povidone-iode pour la désinfection locale de la peau 3 fois et pendant au moins 3 min.
13. Régler le ventilateur de paramètres physiologiques. Définissez la fréquence respiratoire à 150/min et des volumes à 8-10 µL/g poids corporel (PC).
14. Mettre sur une nouvelle paire de gants stériles. Placez votre souris sous un microscope chirurgical et placer un drap stérile fenêtré sur la souris.
15. Inciser la peau à la ligne médiane environ 3 mm sous la mandibule jusqu'à la nervure 2^nd . Identifiez la ligne médiane et les tissus conjonctifs de la glande sous-maxillaire. Puis utiliser forceps intracapsulaire coudé pour diviser la glande à la ligne médiane sans ménagement avec deux pinces en douceur et explorer le muscle trachéal.
16. Préparer la trachée doucement en tirant les muscles para-trachéale sans ménagement avec une pince intracapsulaire.
17. Tirez sur la languette avec une pince à redresser la gorge pour des conditions d’intubation faciles et insérez délicatement une canule d’intubation (OD 1. 2 mm) à l’intérieur de la trachée. Confirmer l’intubation par visualisation directe du tube à l’intérieur de la trachée et en recherchant les mouvements thoraciques appropriée.
18. Ajuster la concentration isoflurane après intubation à l’isoflurane 2 % avec un débit de 1,0 L/min et 100 % O₂.
    Remarque : Si les mouvements respiratoires ne s’arrêtent pas ou souris commencent à bouger, tout d’abord augmenter le rythme respiratoire jusqu'à 180/min. Si nécessaire, augmenter la concentration de l’isoflurane jusqu'à 3,5 % secondairement jusqu'à ce que la souris s’arrête de respirer sur ses propres. Évaluer les fuites ou remplissage insuffisant du vaporisateur comme les problèmes les plus courants.
19. Vous pouvez également exécuter intubation comme suggéré dans la procédure sub suivante.
    1. Positionnez la souris sur une table à un angle de 60°.
    2. Fixer les extrémités de la souris avec du ruban adhésif et incliner la tête.
    3. Placer une source de lumière froide directement sur la peau au-dessus du larynx.
    4. Tirez doucement la langue avec une pince pour visualiser les cordes vocales.
    5. Insérer un tube en plastique d’une canule-IV (24 G) à travers les cordes vocales et branchez le tube en plastique pour les réglages du ventilateur.
    6. Branchez le ventilateur sur la canule pour confirmer l’intubation par mouvements thoraciques synchrone.
       Remarque : Si les mouvements respiratoires ne s’arrêtent pas ou souris commencent à bouger, tout d’abord augmenter le rythme respiratoire jusqu'à 180 / min. Si nécessaire, augmenter secondairement l’isoflurane concentration jusqu'à 3,5 % jusqu'à ce que la souris s’arrête de respirer sur ses propres. Évaluer les fuites ou remplissage insuffisant du vaporisateur comme les problèmes plus probables.

2. préopératoire Doppler mesure

1. Préparer les deux artères carotides qui adjoint laïque à la trachée en tirant doucement sur le tissu conjonctif apart avec une pince.
2. Placer l’embout de la sonde de 20 MHz Doppler avec certains gel échographie stérile sur le droit et l’artère carotide gauche à un angle inférieur à 45°.
3. Tournez lentement la sonde pour le déplacer latérale et médiale pour trouver un signal Doppler et inclinez la sonde pour optimiser le signal.
4. Utiliser un logiciel de Doppler pour afficher et stocker des vitesses d’écoulement dans les artères carotides communes droite et gauche sur un ordinateur.

3. thoracotomie

1. Utiliser un ensemble de gants stériles pour chaque souris individuelle pour prévenir les infections du site opératoire.
2. Développez l’incision de la peau vers le bas pour l’espace intercostal 2^nd avec un ciseau.
3. Identifier l’espace intercostal 2^nd visuellement en comptant les côtes et puis carrément pénétrer cet espace avec une pince intracapsulaire.
   Remarque : La côte de^st 1 est située sous la clavicule et n’est donc pas visible car l’espace intercostal 2^nd se trouve entre la première côte visible (c'est-à-dire 2^nd côtes) et les côtes de 3^rd .
4. Ouvrir l’espace intercostal 2^nd à l’aide des conseils de la pince et insérer les rétracteurs.
5. Ajuster les rétracteurs avec un élastique attaché à la table d’opération pour avoir une vue claire du thymus.
6. En cas de saignement, utiliser un coton-embout et appuyez sur les vaisseaux superficiels pendant 2 min.

4. des bandes de l’aorte transversal

1. Ajustez le grossissement à 200 % pour identifier la ligne médiane et les tissus conjonctifs. Puis utilisez pince coudée à diviser doucement le thymus. Enlever du tissu graisseux jusqu'à ce que l’arc aortique peut être vu clairement.
2. Préparer un tunnel avec angle attachant des pinces sous l’aorte transversale entre l’artère brachiocéphalique et l’artère carotide commune gauche (voir Figure 1). Tenez l’extrémité d’une suture 6.0 à l’aide de pinces fines et faire passer le fil sous la crosse aortique.
3. Prendre le fil avec la deuxième pince de l’autre côté de l’arche.
4. Couper une longueur de 3 mm long morceau d’un G 27 d’utiliser l’aiguille comme un l’entretoise pour TAC-ligature pour souris pesant entre 19-25 g de poids corporel et une aiguille 26 G comme une entretoise pour souris > 25 g BW.
5. Placer soigneusement l’entretoise parallèle à l’aorte transversal.
6. Préparer un double nœud lâche sur l’entretoise et d’assurer un positionnement optimal de l’entretoise en parallèle à l’aorte. Attacher ensuite le premier lancer et exécuter rapidement un deuxième jet contraire. Retirer l’entretoise rapidement.
7. Pour effectuer sham souris pour contrôle, suivez le même protocole, omettant la ligature de l’aorte.
8. Fermer l’espace intercostal 2^nd avec une suture en polypropylène 6.0. Accorder une attention particulière aux navires sous-clavière en ligaturant.
9. Suture de la peau à l’aide d’une suture en polypropylène 6.0 dans un modèle de suture continue.

5. confirmation de succès ligature de l’aorte transversal

1. Placez une sonde MHz Doppler 20 des deux côtés du cou à un angle de 45° comme dans l’article 2.
2. Les vitesses d’écoulement de chaque côté du document.
   NOTE : Un TAC réussi peut être validé par vitesse Doppler tel qu’illustré à la Figure 2. Un rapport de vitesse débit de 4-10 entre l’artère carotide droite et gauche habituellement garantit TAC adéquate (voir Figure 2).

6. récolte de coeur

1. Induire la narcose selon les étapes 1,2. et 1.3.
2. Placez la souris dans une chambre de l’euthanasie et régler le débit de gaz carbonique pour déplacer de 10 à 30 % le volume/minute.
3. Fixer la souris sur une table de chirurgie. Ouvrir l’abdomen avec des ciseaux et la récolte de sang de la veine cave inférieure avec une canule pour une analyse ultérieure.
4. Couper la membrane et l’OS sternal avec des ciseaux forts et retirez le cœur.
5. Supprimer toutes les artères et les tissus conjonctifs avant la pesée du cœur.
6. Séparer le ventricule droit et le septum du ventricule gauche et peser les deux échantillons.
7. Geler les deux échantillons de tissus dans l’azote liquide.

Résultats

Un TAC succès garantit l’induction d’une surcharge de pression et une hypertrophie ventriculaire gauche. Une validation ad hoc d’une surcharge de pression peut être réalisée à l’aide de mesure de vitesse de flux Doppler, comme illustré à la Figure 2. Alors que la vitesse d’écoulement de sang préopératoire est égale dans les deux artères carotides, TAC provoque une vitesse augmentée de sang dans l’artère carotide droite en raison de la pression élevée dans le ...

Discussion

L’apparition rapide de l’hypertension en raison de la TAC diffère cliniquement pertinente hypertrophie causée par une sténose aortique ou hypertension. Néanmoins, l’utilisation des petits modèles animaux pour induire une insuffisance cardiaque présente de nombreux avantages et est, par conséquent, choisie par de nombreux enquêteurs¹¹. Ce coffre fermé-modèle améliore les modèles déjà existants de la technique chirurgicale pour induire la constriction de l’aorte transversale en souris

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cathéter pression-volume	Millar Instruments, USA	SPR-839
Ventilateur de souris	Harvard Apparatus GmbH, Allemagne	Minivent - TYPE 845
Ventilateur de souris	Harvard Apparatus GmbH, Allemagne	Raccord en Y avec canule d’intubation OD 1.2mm 73-2844
Vaporisateur	Drä ; ger Medical AG&CO. KG, Allemagne	19.3 Vaporisateur Isofluran (une version plus récente est disponible sous le numéro de catalogue) D-877-2010)
Microscope  ;	Leica Microsystems, Allemagne	MZ 7.5
Source lumineuse	Schott AG, Allemagne	KL 1500 LCD
6-0 Prolene	Ethicon, USA	Suture en polypropylène BV-1 9,3 mm 3/8c	suture pour la chirurgie
Seraflex	Serag Wiessner, Allemagne	USP 5/0 schwarz ;   ; IC108000	suture pour la constriction
Tables d’opération à commande homoéthermique	Harvard Apparatus GmbH, Allemagne	Typ 872/3 HT avec trépied et contrôleur homothermique Type 874 ; 73-4233
Sonde rectale flexible	Harvard Apparatus GmbH, Allemagne	1,6 mm OD ; 55-7021
Instrument de visualisation du signal Doppler	Indus Instruments, États-Unis Station de	travail de traitement du signal Doppler (DSWP) avec module Doppler Doppler 20MHz
Pince intracapsulaire Arruga	Altomed, UK	A5400
Sonde Doppler	Indus Instruments, USA	Sonde
Jaffe Lid Retractor	Altomed, UK	A3513

montée sur tube 20MHz