Étude cinétique de réparation des dommages ADN nécessite un système d’induire des lésions à des régions sub nucléaires définies. Les auteurs décrivent une méthode pour créer des sauts de double-brin localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à 405 nm et fournir des procédures automatisées afin de quantifier la dynamique des facteurs de réparation à ces lésions.
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Article de méthode
Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La réponse de dommages ADN (DDR) utilise une pléthore de protéines pour détecter, signaler et réparer les lésions de l’ADN. Délimiter cette réponse est essentiel de comprendre les mécanismes de maintien du génome. Recrutement et échanges de protéines à des lésions étant très dynamiques, leur étude nécessite la capacité de générer des dommages à l’ADN de façon rapide et dans l’espace délimité. Nous décrivons ici les procédures pour induire localement des lésions de l’ADN dans les cellules humaines à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser couramment disponible équipé d’un faisceau de 405 nm. Accumulation de maintenance du génome à rayures de laser peut être évaluées par immunofluorescence (IF) ou en temps réel à l’aide de protéines fluorescents reporters le tag. À l’aide de phosphorylés histone H2A. X (γ-H2A.X) et Replication Protein A (RPA) comme marqueurs, la méthode fournit une résolution suffisante pour distinguer les facteurs recrutés localement de celles qui se propagent sur la chromatine adjacente. Nous fournir également des scripts basés sur ImageJ pour surveiller efficacement la cinétique de la relocalisation de la protéine à ADN endommagent des sites. Ces améliorations simplifient grandement l’étude de la dynamique de la DDR.
Introduction
Les cellules sont constamment exposés à des sources de dommages à l’ADN endogènes et exogènes qui menacent leur intégrité génomique. Le DDR est un ensemble de voies que détecter et réparer les lésions de l’ADN pour maintenir la stabilité du génome de signaux de signalisation. Cassures double-brin d’ADN (CDB), le DDR se produit principalement sur les deux plateformes complémentaires : γ-H2A.X-étiqueté de la chromatine et une région d’ADN (ADN simple brin) simple brin réséquée généralement recouvertes d’ADNsb-liaison complexe Apr1,2.
UV-laser micro-irradiation des cellules pré sensibi....
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Protocole
1. sensibilisation préalable des cellules
- 24 h avant l’expérience de micro-irradiation, graines 40 000 U2OS cellules / puits dans 1 x DMEM contenant 10 % FBS dans 8 puits culture glisse avec fond de 170 µm d’épaisseur type lamelle verre/polymère afin d’assurer la transmission maximale de 405 nm lumière laser et l’imagerie excellent avec un laser à balayage confocal microscope inversé. Si vous utilisez un micro-lames 8 puits, utilisez 500 µL des solutions ou des médias / puits pour tous les traitements ultérieurs et les étapes de lavage du protocole.
Remarque : En raison de leur morphologie plate, bonne adhérence et gros noyaux, U2OS cellules facilitent la....
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Résultats
Après irradiation micro, les cellules sont autorisés à récupérer pendant un certain temps selon la nature du génome entretien protéines1,12. CDB est traitées par les nucléases, plus intensivement durant les phases S et G2 du cycle cellulaire, pour créer une région limitée de l’ADN simple brin qui est rapidement recouvert par l’armée patriotique rwandaise et autres génome entretien facteurs9. Cette région de.......
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Discussion
Utilisant les méthodes décrites ci-dessus, 405 nm laser micro-irradiation des cellules pré sensibilisées avec BBET ou BrdU permet la génération localisée des lésions de l’ADN dont la CDB dans le noyau des cellules humaines adhérentes. Cinétique de DDR à ces DSBs sont similaires à ceux générés avec d’autres méthodes dans les cellules eucaryotes9,18,19. Résection de DSB sur les sites de micro-irradié mène à ssDNA-génération qui pe.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les Sciences naturelles et en génie conseil de recherches [subvention à la découverte 5026 à a.M] et par une nouvelle génération de bourses d’études scientifiques de la société de recherche du Cancer [21531 à a.M]. Nous remercions m. Jean-François Lucier fournissant l’excellent contrôle de la qualité des scripts Python de Fidji et conseils sur l’analyse statistique. Nous remercions le Dr. Stephanie A. Yazinski pour la recette de solution de fixation IF. Nous remercions Paul-Ludovic Karsenti de l’aide avec les mesures de puissance laser.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Olympus FLUOVIEW FV3000 Microscope confocal à balayage laser résonant | Logiciel Olympus | ||
| FluoView FV3000 (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm | laser Source de rayonnement cohérent | ||
| Incubateur de microscope AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objectif | Olympus | Oil objectif d’immersion | |
| Lames de culture à 8 puits sur verre de couverture (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS ostéosarcome lignée cellulaire humaine | ATCC | HTB-96 | Lignées cellulaires stables ; |
| 4',6-Diamidino-2-Phénylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Attention |
| toxique 5-bromo-2&prime ;-désoxyuridine ;( BrdU) ; | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Attention |
| toxique Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsine EDTA 0,1 % ; | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 ; | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 ; | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Saccharose ; | BioShop | SUC507 | |
| Réactif de transfection JetPRIME ; | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade avec DAPI ; | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + rouge phénol | Wisent ; | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, - rouge phénol | Wisent | 319-051-CL | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Wisent ; | 080-150 | |
| Souris anti-RPA32 | anticorps Abcam | ab2175 | 1:500 pour IF |
| Lapin anti-&gamma ;-H2A. | Signalisation cellulaire de l’anticorps X ; | 9718S | 1:500 pour |
| l’anticorps anti-53BP1 | l’IF Rabbit ; | 4937S | 1:500 pour IF |
| Lapin Anticorps Anti-PRP19 | Abcam | ab27692 | 1:500 pour IF |
| Chèvre anti-lapin IgG Alexa Fluor 647 | Signalisation cellulaire ; | 4414S | 1:250 pour IF |
| Goat anti-souris ; IgG Alexa Fluor 488° ; | Signalisation cellulaire ; | 4408S | 1:250 pour IF |
| Fiji logiciel open source d’analyse d’images ; | https://fiji.sc | ||
| Capteur de puissance 1918-K avec capteur 918D-SL-0D3 | Newport |
Références
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in respo....
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