Développement et Validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human interféron-α

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à décrire le développement et la validation d’une seule molécule tableau numérique analyse d’ELISA, qui permet la détection ultrasensible de tous les sous-types d’IFN-α dans des échantillons humains.

Abstract

Le principal objectif du présent protocole est de décrire le développement et la validation d’un interféron (IFN)-essai de α seule molécule tableau numérique Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Ce système permet la quantification de la protéine humaine IFN-α avec une sensibilité sans précédent et aucune réaction croisée pour d’autres espèces de l’IFN.

La première étape clée du protocole est le choix de la paire d’anticorps, suivie par la conjugaison de l’anticorps de capture à billes paramagnétiques et biotinylation de l’anticorps de détection. Après cette étape, les différents paramètres tels que la configuration de l’épreuve, la concentration d’anticorps détecteur et composition du tampon peuvent être modifiés jusqu'à l’obtention d’une sensibilité optimale. Enfin, la spécificité et la reproductibilité de la méthode sont évalués afin d’assurer la confiance dans les résultats. Ici, nous avons développé un test de tableau IFN-α seule molécule avec une limite de détection de 0,69 µg/mL à l’aide d’auto-anticorps de grande affinité isolées de patients présentant des mutations bialléliques dans la protéine auto-immune regulator (AIRE) causant polyendocrinopathie auto-immune le syndrome type 1/autoimmun Polyendocrinopathie-candidose-ectodermique dystrophie (APS1/APECED). Ce qui est important, ces anticorps a permis la détection de tous les sous-types d’IFN-α 13.

Cette nouvelle méthode permet la détection et la quantification des protéines de l’IFN-α dans des échantillons biologiques humains à des concentrations d’attomolar pour la première fois. Un tel outil sera très utile dans la surveillance des niveaux de cette cytokine dans la santé humaine et les États de la maladie, plus particulièrement l’infection, l’auto-immunité et autoinflammation.

Introduction

Type j’ai interférons sont une famille de cytokines qui jouent un rôle central dans l’orchestration des réponses immunitaires antivirales. Ils ont été découverts par Isaacs et Lindenmann 60 ans il y a^1,2 et il sait maintenant que cette famille hétérogène de polypeptides comprend 14 différentes sous-classes (13 sous-types d’IFN-α et 1 IFN-β). Type I IFNs sont essentiels à l’apurement des infections virales, mais ont également été impliqués dans la pathologie des divers États de la maladie humaine, y compris les maladies auto-immunes lupus érythémateux systémique (les), dermatomyosite juvénile (JDM), et le type J’ai interferonopathies dans quel type de comportement j’induite par l’IFN signalisation résulte en pathologie^3,4,5,6,7.

Étudier la protéine IFN de type I dans les échantillons biologiques a été difficile depuis son identification initiale comme une « ingérence substance »^1,2. Actuellement, "sandwich" Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) est la méthode la plus largement utilisée pour la détection de la protéine de l’IFN-α. En dépit d’être précis, simple et rapide, j’ai taper présentes limitations importantes IFN ELISA, comme la sensibilité limitée. En outre, la mesure de tous les sous-types de l’IFN-α nécessite l’utilisation de multiples essais chaque avec leur propre capacité de détection et de la sensibilité. Bien qu’il existe des tests ELISA commerciales détectant les différents sous-types de l’IFN-α, leur sensibilité est limitée (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL et 12,5 pg/mL, respectivement) qui est souvent insuffisant pour détecter les protéines de l’IFN-α dans des échantillons biologiques. Pour contourner cette limitation, les proxy biologique plusieurs épreuves ont été développées pour quantifier de type I NIA en mesurant l’expression des gènes induits ou activité fonctionnelle^{8,9,10,11, 12 , 13 , 14}. Néanmoins, ces tests ne fournissent pas une mesure directe de la protéine de l’IFN-α.

Dans cette étude, seule molécule tableau numérique ELISA technologie a été utilisée pour développer un test permettant la détection de molécules de protéines uniques IFN-α. ELISA numérique utilise la même base en chimie comme ELISA classique, cependant, la réaction a lieu dans des tableaux comprenant 50 000 individuels 46 femtoliter taille puits^15,16. Molécules protéiques unique sont capturés par des billes paramagnétiques revêtus d’anticorps et étiquetés avec un anticorps de détection biotinylé, suivi par la liaison d’un conjugué d’enzyme, streptavidine-β-galactosidase (SBG). Par la suite, les perles sont suspendues avec un substrat de l’enzyme fluorogène, résorufine-β-D-galactopyranoside (RGP), dans les tableaux de simple-molécule. En diminuant le volume réaction 2 milliards de fois¹⁷, une forte concentration locale de signal fluorescent est atteint et comtes de molécules simples devenus possibles, car chaque molécule génère un signal qui peut maintenant être fiable mesuré¹⁸. Essentiellement les tableaux seule molécule sont capables de compter immunocomplexes unique et de déterminer un nombre moyen d’enzymes par perle (AEB). Compter les micropuits où un signal est détecté permet de quantification/numérisation des molécules de protéines, tel qu’il existe une corrélation directe entre la concentration de protéines et le rapport entre immunocomplexed-perles et un nombre total de perles présentes dans les chambres de taille femtoliter.

Yeung et al. effectué une étude d’évaluation de multi-plateforme étendue à l’aide de neuf différentes technologies et quatre cytokine immuno-essais avec le but de comparer la précision du dosage, la sensibilité et la corrélation des données à travers les différentes plateformes¹⁹. Une des principales conclusions de l’étude était que les baies de la molécule unique et seule molécule comptage immuno-essai présenté la sensibilité la plus élevée pour la détection des cytokines dans le sérum humain dans le secteur de concentration sub-pg/mL. Tests de cytokine seule molécule tableau numériques ELISA ont été utilisés pour étudier le rôle de TNF-α et IL-6 dans la maladie de Crohn maladie²⁰, IFN-α en interferonopathy et auto-immunes patients ⁷, et les différents modifiées post-traductionnellement formes de C-X-C motif chemokine 10 (CXCL10) hépatite chronique et de donneurs sains recevant la sitagliptine^21,22. Autres applications incluent la mesure de la rhodopsine chez les patients atteints de rétinopathie diabétique²³; l’étude des pathologies du cerveau par le biais de mesures de sérum/plasma des neurofilaments light²⁴ et β-amyloïde 1-42 peptide²⁵, dans le cadre de la sclérose en plaques et la maladie d’Alzheimer, respectivement. Molécule unique tableau dosages permet également meilleure détection de pathogènes tels que la caractérisation du réservoir viral du VIH²⁶, ainsi que pour la détection d’ADN²⁷ et micro RNAs²⁸. Un avantage majeur de la technologie seule molécule est cette grande polyvalence, comme un test contre les analytes d’intérêt peut être développé si une paire de l’anticorps spécifique est disponible. En outre, homebrew test kits sont disponibles dans le commerce, permettant le développement de nouveaux tests, le protocole qui est détaillé dans une forme modifiée ci-dessous.

Ici, une description détaillée des étapes de développement et de validation pour un dosage de tableau seule molécule est présentée qui résulte en une sensibilité accrue pour la détection de protéines d’IFN-α. Pour seule molécule tableau des dosages des anticorps doivent être très précis, évitant une réactivité croisée avec les protéines apparentées (avec la spécificité d’espèce a examiné le cas échéant). Idéalement, les anticorps avec un plus petit que 10^-9 M K_D devraient être choisis ; affinité élevée assure une liaison forte, avec la production d’un signal plus élevé. La cinétique de la liaison anticorps-antigène sont également importantes et rapides K_sur et lent K_large privilégiera assemblage complexe antigène-anticorps. Commençant par une paire d’anticorps ayant une bonne performance dans ELISA classique, avec une limite de détection (LD) de 1 à 100 pg/mL, augmente les chances d’obtenir un dosage de tableau très sensible seule molécule. Chang et ses collègues effectué des études détaillées de cinétiques des interactions biomoléculaires qui se produisent à chaque étape, proposant un ensemble d’équations pour prédire la sensibilité analytique¹⁸. Ils ont montré ce tableau unique molécule ELISA numérique semble être efficace dans un large éventail des affinités d’anticorps (KD ~ 10⁻¹¹ - 10⁻⁹ M), ainsi que cette génération de signal dépend davantage de la sur-taux de ces anticorps.

Pour utiliser une affinité élevée anticorps que nous avons profité des anticorps isolées de patients atteints du syndrome de la polyendocrinopathie auto-immune de type 1/autoimmun dystrophie Polyendocrinopathie-candidose-ectodermique (APS1/APECED)²⁹. Pour des raisons qui ne sont pas encore compris, la grande majorité des personnes déficientes en AIRE développer un ensemble de haut-avidité des anticorps contre sous-types²⁹de l’IFN-α tous, et nous avons choisi deux clones d’anticorps anti-IFN-α des affinités de liaison complémentaire pour les différents sous-types de IFN-α, selon les estimations de valeurs₅₀ IC. L’Association de ces anticorps de haute affinité uniques avec la technologie seule molécule à permis la quantification directe de l’IFN-α à des concentrations d’attomolar (µg/mL). Une détection ultrasensible de protéine IFN-α contribuera à une meilleure compréhension de la nature, la réglementation et l’impact biologique de la réponse induite par l’IFN dans les paramètres de différentes maladies.

Protocol

1. sélection des anticorps

1. Avant de commencer le protocole de revoir toutes les étapes clés (tableau 1), puis sélectionnez anticorps optimales.
   NOTE : Les anticorps anti-IFN-α haute affinité - l’IC50 qui sont décrits dans le tableau 2 ont été sélectionnés pour ce protocole. De préférence, choisir une paire qui fonctionne bien avec ELISA classique.

2. conjugaison des anticorps de Capture à billes paramagnétiques et l’essai de différentes Concentrations

Remarque : Gardez toujours perle conjugaison tampon (BCB) et tampon de lavage perle (BWB) sur la glace au cours du processus de conjugaison des anticorps.

1. Capture des anticorps tampon Exchange
   1. Prendre les quantités initiales des anticorps anti-IFN-α A pour tester les 3 rapports de conjugaisons différentes perles (0,038 mg/mL, 0,075 mg/mL et 0,3 mg/mL).
      NOTE : Concentrations de revêtement d’anticorps faible peuvent être bénéfiques si l’essai présente un signal de fond élevé. Quantité d’anticorps initial doit comptabiliser une perte estimée à 30 % au cours du processus d’échange de mémoire tampon. Conformément aux instructions du fabricant et afin de réduire le fond initial, les concentrations de 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL et 0,3 mg/mL ont été testées, bien que ces valeurs exactes souvent n’a été obtenues suite à la perte de variables susmentionnée dans la mémoire tampon processus d’échange.
   2. Ajouter le volume requis de l’anticorps dans une colonne de filtrage ainsi que de la BCB, jusqu'à 500 µL.
   3. Centrifuger les colonnes à > 10 000 x g pendant 5 min et jeter le cheminement.
   4. Laver la colonne deux fois en ajoutant un volume total de 450 µL de BCB suivie par centrifugation à > 10 000 x g pendant 5 min et jeter le débit à travers.
   5. Placer la colonne filtre contenant l’anticorps dans un tube de microcentrifuge propre à l’envers - la partie ouverte de la colonne vers l’intérieur du tube nouveau - et centrifuger à 800 g pendant 1 min.
      Remarque : Cette étape permettra de collection de l’anticorps nettoyé. Aucun ajout de mémoire tampon n’est nécessaire pour cette étape.
   6. Laver les membranes avec 50µl BCB et centrifuger à 800 g pendant 1 min comme 2.1.5.
   7. Mesurer la concentration d’anticorps à l’aide d’un spectrophotomètre de faible volume.
   8. Ajouter BCB pour atteindre la concentration en anticorps désiré et noter le volume final.
      Remarque : Un volume de 200 µL servira à décrire le reste du protocole, ce volume étant désignée comme les 2 volumes (2V). Tous les volumes de réactifs suivants seront adaptés en conséquence.
   9. Vortex et continuer sur la glace.
2. Préparation des billes paramagnétiques
   1. Transfert de 2,8 x 10⁸ perles (100 µL = 1V) dans un tube à centrifuger.
      Remarque : Le volume des perles dépend le volume final obtenu en 2.1.8.
   2. Spin d’impulsion et mettre dans un séparateur magnétique pendant 1 min, jeter le diluant et retirer de l’aimant.
   3. Ajouter 2V de BWB et vortexer pendant 5 s.
   4. Répétez 2.2.2 et 2.2.3 deux fois avec le BWB et deux fois plus avec BCB.
   5. Pour 1V de perles ajouter 190 µL BCB, vortex, 5 s, spin de l’impulsion et stocker les perles lavés sur la glace.
3. Activation de la perle
   1. Ajouter 1 mL de BCB froid dans un flacon de 10 mg de chlorhydrate de 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et vortex jusqu'à ce que la solution soit homogène.
   2. Pour 1V de perles ajouter 10µl d’EDC dilué froid aux perles lavés, vortex et garder dans un shaker à 1 000 tr/min pendant 30 min à température ambiante.
      Remarque : Préparation d’EDC et ajout aux talons devraient s’effectuer aussi rapidement que possible en raison de l’instabilité d’EDC dans des solutions aqueuses. Aussi, comme EDC est très réactif, il est important d’avoir une suspension homogène perle avant l’ajout d’EDC pour éviter toute activation perle hétérogènes. Après addition d’EDC, les perles doivent rester en suspension.
4. Conjugaison de la perle de l’anticorps
   1. Vortex et impulsion spin les perles activés. Maintenant mettre les perles dans un séparateur magnétique pendant 1 min, jeter le surnageant BCB et retirer le tube de l’aimant.
   2. Laver les billes avec 2V de BCB. Vortex, spin d’impulsion et mis dans le séparateur magnétique pendant 1 min. Puis jetez le tampon de la BCB et enlever les perles de l’aimant.
   3. Ajouter rapidement le froid, échange tampon 200 µL (2V) d’anticorps aux talons activés.
   4. Vortex et maintenez pendant 2 h dans le shaker à température ambiante.
5. Perle de blocage et dernier nettoyage
   1. Impulsion spin la suspension perles revêtus d’anticorps, mettre dans le séparateur magnétique pendant 1 min, transférer le surnageant dans un nouveau tube et mesurer la concentration avec un spectrophotomètre de faible volume.
      Remarque : Cette étape vous renseignera sur la question de savoir si les perles sont saturés - toutes les valeurs au-dessus de zéro indique saturation perle - comme la détection des anticorps solubles incapable de se lier aux talons seront mesurable.
   2. Retirez les perles conjugués de l’aimant, ajouter 2V de BWB, Vortexer pendant 5 s, pouls spin et mis dans le séparateur magnétique pendant 1 min.
   3. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre de faible volume.
      Remarque : Cette étape vous renseignera sur savoir si les anticorps sont solidement fixés aux talons. Concentration en anticorps détectables dans ce surnageant indiquera le détachement de l’anticorps de la perle, ce qui arrive régulièrement. Ce test fonctionne souvent même quand il reste attachées aux talons de très petites quantités d’anticorps de capture.
   4. Retirez les perles conjugués de l’aimant, ajouter 2V de BWB, Vortexer pendant 5 s, pouls spin et mis dans le séparateur magnétique pendant 1 min.
   5. Enlever les cordons conjugués de l’aimant, ajouter 2V de tampon de blocage talon, Vortexer pendant 5 s et incuber dans le shaker pendant 30 min à température ambiante.
   6. Laver les enduits d’anticorps et bloqué perles 3 x avec 2V, une fois avec BWS et 2 x avec un diluant tampon perle (jeter tous les surnageants).
   7. Conserver les perles couchés et bloqués à 4° C jusqu'à l’utilisation avec 2V de perle tampon diluant.
      NOTE : Juste avant utilisation, perles doivent être lavés une fois avec détecteur/diluant de l’échantillon à l’aide d’un volume de 250 x perle volume/20, en utilisant le séparateur magnétique.

3. détection anticorps Biotinylation

1. Anticorps de détection tampon Exchange
   1. Prendre 260 µg des deux clones Ab anti-IFN-α.
      Remarque : Cela prend en compte une perte de 30 % au cours de l’échange de la mémoire tampon et permet de tester deux ratios de biotine/anticorps différents.
   2. Procéder comme 2.1 utilisation Biotinylation réaction tampon (BRB) au lieu de BCB.
   3. Mesurer le volume et la concentration d’anticorps et ajuster le volume pour obtenir une concentration finale de 1 mg/mL.
      Remarque : Il s’agit d’une concentration de départ suggérée, mais elle peut être optimisée si le dosage n’atteint pas la sensibilité requise.
2. Biotinylation anticorps de détection
   1. Ramener la N-hydroxysuccinimide-polyéthylène-glycol4-biotine (NHS-PEG4-biotine) à température ambiante et remettre en suspension avec un total de 400 µL d’eau distillée pour obtenir une concentration de 3,4 mM.
   2. Décider le ratio de biotine : anticorps pour tester et mélanger les anticorps de détection et de la biotine dilué en conséquence (ratio de 60 : 1 est égal à 100 µL d’anticorps de détection et 4,5 µL de biotine).
      Remarque : Pour commencer, testez les ratios de 30 : 1 et 60 : 1.
   3. Mélange de Vortex l’anticorps-biotine, impulsion spin et incuber 30 min à température ambiante.
      NOTE : Pas besoin de secouer.
3. Purification d’anticorps biotinylé détection
   1. Transférer l’anticorps biotinylé à un nouveau filtre et procéder comme 2.1, effectuer les 3 étapes de lavage avec BRB (400, 450 et 450 µL) et une collection finale.
   2. Mesurer le volume et la concentration des anticorps de détection biotinylé purifié et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.

4. MODE OPERATOIRE optimisation

NOTE : Utiliser le logiciel d’analyseur tableau seule molécule dans un Homebrew configuration³⁰.
La machine d’analyseur de tableau seule molécule est contrôlée par un logiciel qui permet d’exécuter des étalonnages de dosage, pour effectuer des analyses quantitatives échantillon, pour modifier les paramètres externes (bead, détecteur, SBG, RGP concentrations ; dilutions d’échantillons...) et internes paramètres (nombre d’étapes, durées d’incubation...) pour créer les conditions optimales de dosage et peut également être utilisé pour calculer les résultats (quantités de fond, LOD,). Pour la configuration de l’analyseur de tableau de molécules simples et pour calculer les volumes de réactifs nécessaires à chaque tour d’optimisation, voir les instructions du fabricant. Effectuer les premiers coups d’optimisation à l’aide d’une configuration 2-step.

1. Dans les deux configurations d’essai combinaisons de perles conjugués anticorps de capture et les anticorps de détection biotinylé.
   1. Tester des combinaisons de trois différents anti-IFN-α A capturer des concentrations d’anticorps avec les deux anti-IFN-α B biotinylation des ratios différents comme l’anticorps de détection et de capture et vice versa (Figure 1) par la sélection des conditions appropriées dans le logiciel de l’analyseur.
   2. Choisissez la combinaison plus sensible, c'est-à-dire les conditions qui offre la plus basse limite de détection, et utilisez-le pour nouvelles mesures à prendre
      Remarque : La Figure 1 montre comment un 0,3 mg/mL anti-IFN-α une concentration de perle d’anticorps et un ratio de biotine : anticorps de 30 : 1 avec l’anticorps B anti-IFN-α a abouti à la sensibilité la plus élevée, comme en témoigne un LOD de 11,6 µg/mL. (Voir le tableau1 supplémentaire). Cette combinaison sera utilisée pour toutes les étapes futures. Notez que la grande sensibilité atteint cette analyse particulière avant n’importe quel tours d’optimisation.

Figure 1 : sélection de l’orientation de l’anticorps, capturer la concentration d’anticorps sur les perles et ratio biotinylation. Les deux configurations différentes possibles ont été testées, en utilisant l’anti-IFN-α A comme anticorps de capture et anti-IFN-α B comme détection anticorps (A) et vice versa (B). IFNα - 2C a été utilisé comme antigène. Concentrations d’anticorps de capture différents ainsi que les ratios de biotine : anticorps (B:A) ont aussi été testés pour les deux configurations. Ligne pointillée indique LOD pour les meilleures conditions ; anti-IFN-α un 0,3 mg/mL comme capture et anti-IFN-α B biotine : détecteur anticorps ratio 30 (LOD = 11,6 mg/mL, correspondant à une valeur AEB de 0.017265). Une configuration 2-étape a été utilisée. Biotine : anticorps (B:A). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. Comparer un 2 vs 3 étapes de configuration.
   Remarque : Dans une configuration à 3 étapes, il y a étapes trois différents incubation avec l’anticorps de capture, un avec l’anticorps de détection et une troisième finale pour l’étiquetage d’enzyme SBG. Toutefois, dans une configuration 2-step, capturer et les anticorps de détection sont incubés simultanément avec l’analyte d’intérêt.
   1. Exécuter l’analyseur de tableau de molécule unique avec la capture et la concentration en anticorps détecteur et le ratio de 4.1.2 choisir les configurations 2 et 3 étapes pré configurées dans l’analyseur instructions^{30 du fabricant suivant}.
   2. Choisissez la configuration qui permet la sensibilité la plus élevée et la conserver pour les prochaines étapes
      Remarque : Comme indiqué dans la Figure 2 et Tableau complémentaire 2, la configuration 2-step a donné sensibilité légèrement plus élevée et le ratio signal/fond pour chaque concentration d’essai. Par conséquent, la configuration 2-étape a été maintenue pour les prochaines étapes.

Comparaison de 3 étapes configuration vs figure 2:2. Les configurations 2 et 3 étapes ont été évaluées à l’aide de 0,3 mg/mL d’anti-IFN-α un anticorps comme la capture et anti-IFN-α B comme anticorps de détection dans une proportion de 30 biotine : anticorps. IFNα - 2C a été utilisé comme antigène. Dans un cadre de la condition de 3 étapes, il y a des étapes de trois différents incubation avec l’anticorps de capture, un avec l’anticorps de détection et une troisième finale pour l’étiquetage d’enzyme SBG. Toutefois, dans une configuration 2-step, capturer et les anticorps de détection sont incubés simultanément avec l’analyte d’intérêt. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

3. Optimisation de concentration détecteur anticorps et SBG
   1. Tester trois concentrations différentes d’anticorps de détecteur (0,1, 0,3 et 0,6 µg/mL) avec trois concentrations différentes de SBG (50, 150 et 250 h) tel que décrit ci-dessus³⁰.
   2. Choisir les concentrations qui donne la sensibilité la plus élevée et les conserver pour les prochaines étapes.
      Remarque : La Figure 3 montre ce détecteur de 0,3 µg/mL et 150 SBG pM ont été les conditions qui ont montré la limite de détection optimale. Ces conditions ont également donné des niveaux de fond de faible et moyenne amplitude, un comportement qui produit des valeurs de bonne déviation standard (SD) (supplémentaires Tableau 3). Concentrations typiques varient entre 0,1 - 1 µg/mL pour les anticorps de détection et 50-200 pM de SBG, bien que des concentrations plus élevées (par exemple jusqu'à 300 MP) de ce dernier pourrait être nécessaire. Il est important d’éviter les conditions qui rendront les arrière-plans supérieures à 0,02 AEB. Augmentation de la concentration du détecteur anticorps monoclonal (ACM) ou SBG améliorera signal réponse et arrière-plan. Cependant, si l’augmentation de signal surmonte le changement de fond, le LOD améliorera. Peut se retrouver une situation dans laquelle une diminution de fond permet meilleure discrimination entre les calibrateurs faibles.

Figure 3 : optimisation de concentration détecteur et SBG. Trois concentrations différentes de biotinylé de détecteur (0,1, 0,3 et 0,6 µg/ml) avec trois concentrations différentes de SBG (50, 150 et 250 pM) ont été évaluées. Ligne pointillée indique LOD pour les meilleures conditions ; anticorps de détecteur à 0,3 mg/mL et SBG 150 pM (LOD = 0,09 mg/mL, correspondant à une valeur AEB de 0.017184). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

4. Étapes d’optimisation supplémentaires
   1. Si la sensibilité requise n’a pas été atteint, tester le temps d’incubation différentes pour les différentes étapes en utilisant les options préconfigurées dans le logiciel de l’analyseur.
   2. Si le dosage n’est pas assez sensibilité, optimiser le nombre de perles par test en utilisant les options préconfigurées dans le logiciel de l’analyseur.
      Remarque : Une fois le début des tests d’échantillons biologiques, volume de l’échantillon est un paramètre supplémentaire susceptible d’optimisation. S’assurer que les échantillons sont traitées conformément aux procédures de santé et de sécurité.

5. répéter la spécificité et la reproductibilité

1. Tester la spécificité de dosage de IFN-α, en testant le dosage avec différents sous-types de l’IFN-α et autres protéines apparentées (Figure 4 a et 4 b).

Figure 4 : spécificité et la sensibilité du dosage optimisé IFNα seule molécule tableau. (A) IFN-β, IFN-λ1, λ2-IFN, IFN-ω et IFN-γ protéines recombinantes ont été testés, ainsi que (B) 16 sous-types d’IFN-α, y compris trois types d’IFN-α2 (IFN-α2a, IFN-α2b et IFN-α2c). Adapté de Rodero et al. 2017. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. Évaluer la reproductibilité du dosage optimisé en effectuant trois expériences répétées indépendantes et en évaluant les inter-dosages (Figure 5).
3. Calculer la limite de détection du test
   Remarque : La limite de détection a été calculée en utilisant la moyenne des trois blancs + 3 écarts-types (SD), obtenant ainsi une valeur de 0,23 µg/mL. Comme le facteur de dilution d’échantillon standard est de 1:3, l’inclusion du facteur de dilution donne un LOD de 0,69 µg/mL.

Figure 5 : reproductibilité du dosage tableau optimisé molécule unique pan-IFN-α. Trois essais indépendants ont été effectuées à l’aide de deux lots différents de perles. Pour le second lot, deux expériences indépendantes ont été réalisées. Chaque mesure a été acquise en doublons. La ligne pointillée représente la limite de détection, définie par la moyenne enzyme moyenne blanc perle + SD de toutes les courses. IFN-α17 a été utilisé comme référence, en tenant compte du fait que la courbe d’étalonnage dérivée est représentatif de tous les autres sous-types de l’IFN-α, comme illustré à la Figure 4 b. Graphique montre la valeur moyenne et SD (barres d’erreur). Les lignes pointillées montrent LOD pour les différents scénarios ; Course 1 : 0,073 µg/mL AEB = 0.006238, course 2 : 0,113 µg/mL AEB = 0.007119, exécuter 3 : 0,043 µg/mL AEB = 0.05518). Adapté de Rodero et al. 2017. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

6. protéine test de concurrence

1. Effectuer un test de concurrence de protéine (décrit dans la légende de la Figure 6 ) pour démontrer davantage la spécificité du test.
   Remarque : Les échantillons de Plasma chez les patients avec SLE (n = 5) ont été utilisés.
   1. Lorsque le virus sont suspectés d’être présents dans l’échantillon biologique, préparer tampon inactivation en ajoutant 200 µL d’un agent tensio-actif non-ioinic (0,5 % nonidet P40 substitut) à 40 mL diluant détecteur/échantillon et vortex vigoureusement.
   2. Centrifuger les échantillons biologiques contenant l’analyte d’intérêt à 10 000 g pendant 15 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires.
   3. Mix 185 µL détecteur/diluant ou inactivation tampon avec 100 µL d’échantillon biologique (facteur de dilution finale 3) et 15 µL anti-IFN-α anticorps A (initiale de concentration de 1 mg/mL, la concentration finale 50 ug/mL) ou tampon. Incuber 30 min à température ambiante.
   4. Exécuter les exemples avec et sans anticorps anti-IFN-α dans l’analyseur de tableau de molécules simples comme décrit ci-dessus.
      NOTE : En cas de saturation du signal, des échantillons doivent être plus dilués. En outre, 300 µL est le volume requis pour l’analyse en double.

Figure 6 : analyse de la concurrence de protéine. Expériences de compétition ont été effectués à l’aide d’échantillons provenant de cinq différents patients de SLE. Échantillons biologiques ont été centrifugés à 10,000 g pendant 15 min à 4 ° C. Ils ont été dilués 1/3 avec détecteur/diluant contenant NP40 pour inactivation virale. 15 µl d’anticorps anti-IFN-α A (initiale de concentration 1 mg/mL, la concentration finale de 50 µg/mL) ou tampon ont été ajoutés à un volume total de 300 µL. Incubation a été réalisée à température ambiante pour le groupe témoin de 30 min. est représentée en gris et les échantillons traitement par anti-IFN-α A anticorps sont représentés en noir. Graphique montre la valeur moyenne et SD (barres d’erreur). Ligne pointillée représente LOD (AEB = 0.024774, 0.8037 µg/mL). Adapté de Rodero et coll. 2017 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Results

En résumé, un essai de tableau de pan-IFN-α seule molécule avec une limite de détection de 0,69 µg/mL, en utilisant une configuration 2-étape avec des perles de capture enduit 0,3 mg/ml d’anti-IFN-α un anti-IFN-α et l’anticorps B détection anticorps biotinylé, à un taux de biotine : anticorps de 30 a été développé. Les concentrations utilisées pour les anticorps de détection biotinylé et SBG étaient 0,3 µg/mL et 150 h, respectivement. Ce test très spécifique est capable de détecter tous les sous-types d’IFN-α 13 et ne réagit pas croisées avec d’autres type d’interférons. Ainsi, s’il n’est pas possible d’identifier et de quantifier chaque espèce individuelle d’IFN-α, chacun d’eux peut être détectée et mesurées ensemble en donnant une valeur de la concentration totale d’IFN-α, qui comprend les 13 différentes sous-classes.

Pour explorer la valeur diagnostique potentielle de ce nouveau test, protéine IFN-α dans le plasma et le sérum d’individus sains ont été mesurées et comparées avec des échantillons provenant de patients atteints de SLE et JDM. Tel qu’illustré à la Figure 7, niveaux élevés de protéine de l’IFN-α ont été détectés dans les deux cohortes de la maladie comparativement aux groupes témoins sains. La ligne pointillée indique la limite de détection d’un ELISA disponible dans le commerce classique, illustrant comment cette approche ne détecterait pas protéine IFN-α dans ces groupes de patients malgré l’association connue de cette cytokine avec ces phénotypes. En outre, IFN-α quantifiables sur 5 journaux de magnitude, illustrant la gamme dynamique de l’essai, avec des niveaux détectables entre 1 à 10 µg/mL, confirmant le caractère hautement sensible du dosage.

Figure 7 : Quantification des protéines d’IFN-α dans le plasma et le sérum de cohortes de patients. Ce chiffre a été modifié par Rodero et al. 2017. plasma de sujets témoins sains (n = 20) et les patients souffrant de SLE (n = 72) et JDM (n = 43) ont été testés avec le test de tableau de molécule unique pan-IFNα. L’analyse a effectué un test ANOVA monodirectionnelle (Kruskal-Wallis) et Dunn comparaison plusieurs tests entre les groupes. Médiane est représentée. Ligne pointillée indique LOD d’un référence humaine anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 µg/mL). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Étape	Considérations	Référence
1. choix de paire anticorps	Différents épitopes cibles	Tableau 2
	Haute affinité
	Rapide Ksur / lent Koff
2. orientation de paire anticorps	Choisir des conditions à la limite de détection le plus bas	Figure 1
3. concentration d’anticorps de capture
4. rapport biotine : détecteur
5. 2 vs 3 étapes configuration	Choisissez condition avec le plus haut ratio Signal : fond	Figure 2
6. concentration en anticorps détecteur	Choisir des conditions à la limite de détection le plus bas	Figure 3
7. concentration de SBG
8. spécificité	Évaluer la réactivité croisée	Figure 4
9. sensibilité	Évaluer la reconnaissance des sous-types (si applicable)
10. reproductibilité	Évaluer la variabilité du dosage	La figure 5

Tableau 1 : Résumé des étapes de développement et l’optimisation d’un test de tableau unique molécule. Ce tableau résume les différentes étapes nécessaires à l’élaboration et l’optimisation d’un test de tableau molécule unique, depuis le choix initial de paire d’anticorps jusqu'à l’évaluation de la reproductibilité.

Antigène	8H 1 (A)	12H 5 (B)	Sifalimumab	Rontalizumab
IFNΑ1	28,3	51.3	460	22.63
IFNΑ2	2563	10.7	9.02	2.15
IFNΑ4	5.11	2.99	35,35	325,3
IFNΑ5	2.01	19.6	93,29	2.49
IFNΑ6	64,7	3.03	4.97	-
IFNΑ7	0,9	0,63	233.1	-
IFNΑ8	302	0,83	691	10,86
IFNΑ10	2.54	0,71	43,2	-
IFNΑ14	3224	2.1	14,52	0,9
IFNΑ16	1.83	32.99	59,18	28,65
IFNΑ17	2.21	0,77	890,9	23,86
IFNΑ21	2.78	12.87	1769	5.8

Tableau 2 : sélection d’anticorps Pan-alpha. IC50 (ng/mL) déterminée à l’aide de l’élément de réponse stimulée par l’interféron (sier)-analyse de Luciferase neutralisation. Tableau des valeurs d’IC50 du mAbs utilisé dans essai de tableau de molécule unique pour tous les sous-types de l’IFN-α. 10 000 cellules HEK 293 MSR ont été ensemencées en plaques à 96 puits moitié-zone blanches et inverse-transfectées avec 50 ng prémélangée sier-Firefly luciferase reporter et constructions de luciférase Renilla utilisant des réactifs de transfection selon les instructions du fabricant. La construction de la luciférase exprimant a servi un contrôle interne normalisation. Cellules ont été incubées pendant la nuit dans un milieu sérum réduit additionné de 0,1 mM des acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium 1 mM, sérum de veau fœtal de 0,5 % à 37 ° C, 5 % de CO₂ dans une atmosphère humidifiée. Après une nuit d’incubation, les cellules sont stimulées pendant 24 h avec un milieu contenant des mélanges de humaine recombinante IFN-α avec ou sans anti-IFN-α mAbs ou contrôle IgG qui avait été préincubé pendant 1 h à 37 ° C. Après 24 h de stimulation, dual luciferase reporter analyses ont été effectuées selon les instructions du fabricant. «- » Non déterminé. Sifalimumab est un entièrement humain, immunoglobuline G1 κ anticorps monoclonal qui se lie à et neutralise la plupart des sous-types de l’IFN-α ; Rontalizumab est un anticorps monoclonal humanisé contre IFN-α. Adapté de Meyer et coll. 2016 et Rodero et al. 2017.

Supplémentaire tableau 1 : sélection de l’orientation de l’anticorps, capturer la concentration d’anticorps sur les perles et ratio biotinylation. Les deux configurations différentes possibles ont été testées, en utilisant l’anti-IFN-α A comme anticorps de capture et anti-IFN-α B comme détection anticorps (A) et vice versa (B). IFNα - 2C a été utilisé comme antigène. Concentrations d’anticorps de capture différents ainsi que les ratios de biotine : anticorps (B:A) ont aussi été testés pour les deux configurations. Saturation (Sat). Orange : Valeurs d’AEB qui ont été utilisés pour le calcul de LOD ; ces concentrations étaient considérées comme vierges comme valeurs AEB est demeurés stables. LOD est calculé comme le signifie vide + 3SD. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaires Tableau 2 : Test de configuration 3-étape 2 vs. Les configurations d’étape 2 et 3 - ont été évaluées à IFNα - 2C comme antigène. AEB valeurs aussi bien comme signal/fond des rations (S/B) sont indiquées pour les deux conditions. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaires Tableau 3 : optimisation de concentration détecteur et SBG. Trois concentrations différentes de biotinylé de détecteur (0,1, 0,3 et 0,6 µg/mL) avec trois concentrations différentes de SBG (50, 150 et 250 pM) ont été évaluées. AEB valeurs sont indiquées pour les neuf conditions testées. Orange : Valeurs d’AEB qui ont été utilisés pour le calcul de LOD ; ces concentrations étaient considérées comme vierges comme valeurs AEB est demeurés stables. LOD est calculé comme le signifie vide + 3SD. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaires Tableau 4 : spécificité et la sensibilité du dosage optimisé IFNα seule molécule tableau. Enzyme moyenne par valeurs de perles sont indiqués lorsque les IFN-β, IFN-λ1, λ2-IFN, IFN-ω et IFN-γ protéines recombinantes ont été testés (A), ainsi que les 16 sous-types d’IFN-α (B). «- » Non déterminé. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Complémentaires tableau 5 : reproductibilité du dosage optimisé IFNα seule molécule tableau. Les valeurs moyennes de la DGVE pour tous trois essais indépendants figurent vers le haut à une concentration de 10.000 µg/mL. «- » Non déterminé. Saturation (Sat). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaires Tableau 6 : test de concurrence protéine. Enzyme moyen par les perles, les valeurs sont indiquées pour toutes les conditions testées. Des mesures ont été effectuées en double. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Nous avons décrit dans les présentes, le développement et la validation d’une molécule hautement reproductible, ultrasensible tableau numérique ELISA pour la quantification directe de protéine IFN-α dans des échantillons humains (étapes résumées dans le tableau 1). Une des étapes plus critiques dans le développement du dosage est le choix de la paire anticorps¹⁶, avec les caractéristiques en termes de cinétique et épitope liaison clé à un essai réussi. Il est important d’éviter l’utilisation d’anticorps monoclonaux appariés qui ciblent le même épitope ou qui cause empêchement stérique. Des anticorps polyclonaux pourraient servir d’anticorps de détection pour surmonter ces limitations. Si à une étape donnée la sensibilité souhaitée n’est pas atteint, possibilités d’optimisation doivent être examinées. Ceci peut inclure l’utilisation de paires de rechange anticorps, modifications des paramètres comme le type de protéine (p. ex. BSA < caséine), pH (6,0-8,5), force ionique, capacité tampon (p. ex. les concentrations de NaCl et de phosphate), perles de transporteur ou présence d’agents tensio-actifs. Une large gamme de paramètres con optimisée lors du développement d’un test de tableau seule molécule. Toutefois, dans l’ensemble, les conditions qui donnent aux ratios signal : ambiants et LODs minimes sont ceux préféré (voir la Figure 1, Figure 2et Figure 3).

Au sujet de la spécificité, le dosage de l’IFN-α a montré aucune réactivité croisée pour n’importe quel autres interférons ne testé (β, γ, λ1, λ2, ω) (Figure 4 a) et a été capable de détecter tous les sous-types d’IFN-α 13 (Figure 4 b). Toutefois, l’analyse a montré une affinité plus faible pour le sous-type de l’IFN-α2, (Figure 4 b et 4 de Table supplémentaire). Fait intéressant, des sensibilités différentes pour les différentes catégories d’IFN-α2 (a, b, c) ont aussi été observées, qui peut être due à des procédés de fabrication distinctes ou des séquences d’acides aminés différents, comme les sous-types d’IFN-α2 proviennent de différents utilitaires fournisseurs. À cette seule exception, toutes les espèces de l’IFN-α a donné des réponses très similaires. La spécificité de l’essai a été davantage démontrée par prétraitement des échantillons avec un anti-IFN-α un clone, qui a abrogé le signal (Figure 6 et supplémentaires Tableau 6).

L’un des principaux avantages de cette technologie est que toute substance d’intérêt peut être potentiellement ciblées¹⁶. En outre, différents spécimens biologiques peuvent être testés, comme le sérum, plasma, liquide céphalorachidien, lysats cellulaires, les surnageants de culture³¹ et même souffle³². Habituellement, une dilution de 1:3 de plasma est effectuée pour éviter l’obstruction des potentiels de l’analyseur de tableau seule molécule. Toutefois, l’analyte d’intérêt pourrait être présent en très faibles concentrations dans l’échantillon biologique pertinente et des concentrations plus élevées de l’échantillon peuvent être nécessaire (selon la sensibilité de l’éssai)³³. Bien qu’il y a potentiel pour le multiplexage tout en conservant la bonne sensibilité³⁴, c’est un processus plus difficile et des essais pour mesurer plus de 6 protéines à l’intérieur les mêmes expériences ont encore d’être mis au point³⁵.

La capacité de détecter et de quantifier des cytokines et autres protéines biologiques pertinentes à ces faibles concentrations ouvre une toute nouvelle gamme d’applications^33,,³⁶. Il est bien connu que les nombreuses protéines exercent leurs effets même à très faibles concentrations, qui jusqu'à présent étaient inférieures au seuil de détection de la meilleure des tests ELISA³⁷. Alors que les autres technologies d’immunoessai offrent des avantages sur les classiques ELISA¹⁹, nous démontrons ici que seule molécule tableau numérique ELISA est une plate-forme fiable et reproductible pour la détection ultrasensible des cytokines de faible concentration en échantillons humains. Par conséquent, cette technologie offre un énorme potentiel pour la découverte de biomarqueurs et une meilleure gestion de patients d’un large éventail de maladies.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorps anti-IFN-&alpha ; A (clone 8H1)	ImmunoQure AG	NA	Non disponible dans le commerce
Anticorps anti-IFN-&alpha ; B (clone 12H5)	ImmunoQure AG	NA	Non disponible dans le commerce
Anticorps anti-IFN-&alpha EBI-1 clone	eBioscience	BMS216C
Clone d’anticorps BMS216BK anti-IFN-alpha	eBioscience	BMS216BK	Pas un kit ELISA mais des abdos en vrac
IFN &alpha ; 2c	eBioscience	BMS305	OK
IFN & alpha ; I (17)	PBL	11150-1
IFN & alpha ; 2a	PBL	11100-1
IFN et alpha ; 2a	PeproTech	N’est plus disponible
IFN &alpha ; 2b	PBL	11105-1
IFN et alpha ; 1	PBL	11175-1
IFN et alpha ; 4a (M1)	PBL	11177-1
IFN et alpha ; 4b (a4)	PBL	11180-1
IFN et alpha ; B2 (a8)	PBL	11115-1
IFN et alpha ; C (a10)	PBL	11120-1
IFN et alpha ; D (a1)	PBL	11125-1
IFN et alpha ; G (a5)	PBL	11135-1
IFN et alpha ; F (a21)	PBL	11130-1
IFN & alpha ; H2 (a14)	PBL	11145-1
IFN et alpha ; J1 (a7)	PBL	11160-1
IFN & alpha ; K (a6)	PBL	11165-1
IFN et alpha ; WA (a16)	PBL	11190-1
IFN & lambda ; 1	PeproTech	300-02L
IFN & lambda ; 2	PeproTech	300-02K
IFN &omega ;	PeproTech	300-02J
IFN &beta ;	PeproTech	300-02BC
IFN & gamma ;	PeproTech	300-02
Anti-IFN-&alpha ; ELISA	PBL	41115.1
Plaques à 96 puits	Corning	3904
ISRE-Reporter	Qiagen	CCS-008L
Fu-GENE HD Réactif de transfection	Promega	E2311
Opti-MEM Sérum réduit Mediuem	ThermoFischer Scientific	31985062
Essai Reporter à double luciférase	Promega	E1910
Nonidet P40 Substitute	Sigma-Aldrich	74385
Spectrophotomètre NanoDrop 1000	Thermo Scientific	N’est plus disponible
Amicon micocentrifugeuse tubes - 0.5mL filtres	Merck Millipore	UFC505096
Bead Conjugation Buffer	Quanterix	102040	Ne peut pas être commandé séparément
Non encodé Perles paramagnétiques	Quanterix	101360
Tampon de lavage de billes	Quanterix	102040	Ne peut pas être commandé séparément
EDC	Fisher Scientific	11844071
Tampon de blocage de billes	Quanterix	102040	Ne peut pas être commandé séparément
Tampon de diluant de billes	Quanterix
Détecteur et échantillon Diluant	Quanterix	101359
Tampon de réaction de biotinylation	Quanterix	102040	Ne peut pas être commandé séparément
NHS-PEG4-Biotine	Fisher Scientific	11891195
diH2O
Centrifugeuse pour tubes de microcentrifugation de 1,7 ml (Centrifugeuse Heraens Fresco 21)	Thermo Scientific	75002478
Mélangeur vortex de laboratoire standard (MS2 Minishaker)		IKA MS2
(10, 20, 200 et 1000 &mu ; l)	Conseils Thermo Scientific
(10, 20, 200 et 1000 &mu ; l)
1,7 ml	Séparateur magnétique Eppendorf
pouvant accueillir des tubes de microcentrifugation de 1,7 ml (Life Technologies DynaMag-2)	ThermoFisher Scientific	12321D
(Galaxy MinisStar)	VWR	521-2844
(Eppendorf Thermomixer Comfort)	Eppendorf
Réactifs à matrice de molécules uniques (Simoa)
	Quanterix	101652
Simoa Spécimen 96 puits	Quanterix	101457
Simoa Disques	Quanterix
Embouts conducteurs Simoa 2.0	Quanterix	101726
Simoa Cuvettes	Quanterix	100803
Simoa SBG Réactif	Quanterix	102295
Simoa RGP Réactif	Quanterix	101736
Simoa System Buffer 1	Quanterix	100486
Simoa System Buffer 2	Quanterix	100487
Huile d’étanchéité	Quanterix	100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer	Quanterix	100032
Technologies
molecule array (Simoa)	Quanterix
Comptage de molécules uniques Systèmes d’immunodosage Erenna	Singluex