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Article de méthode

Méthodes pour détecter les cytotoxiques amyloïdes suivant Infection de pulmonaire cellules endothéliales par Pseudomonas aeruginosa

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DOI :

10.3791/57447

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12 juillet 2018

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of South Alabama, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 4Center for Lung Biology, University of South Alabama

Dans cet article

Résumé

Méthodes simples sont décrits pour démontrer la production des cytotoxiques amyloïdes suite à une infection de l’endothélium pulmonaire par Pseudomonas aeruginosa.

Résumé

Les patients qui survivent à une pneumonie ont élevé le taux de mortalité dans les mois qui suivent la sortie de l’hôpital. Il a émis l’hypothèse qu’infection du tissu pulmonaire au cours de la pneumonie entraîne la production de cytotoxines longue durée de vie qui peuvent conduire à la défaillance d’organes fin subséquente. Nous avons développé in vitro tests pour vérifier l’hypothèse que les cytotoxines sont produites au cours d’une infection pulmonaire. Les cellules endothéliales pulmonaires isolés de rats et la bactérie Pseudomonas aeruginosa sont utilisées comme systèmes modèles et la production de cytoxins suite à une infection des cellules endothéliales par les bactéries est démontrée à l’aide de culture cellulaire, suivie dosage direct à l’aide de tests de lactate déshydrogénase et une nouvelle méthode microscopique utilisant la technologie ImageJ. La nature amyloïde de ces cytotoxines a été démontrée par des essais de liaison thioflavine T et par immunotransfert et protocole à l’aide d’anticorps anti-amyloïdes A11. Des analyses plus poussées à l’aide d’immunotransfert ont démontré qu’oligomérique tau et bêta-amyloïdes produit et diffusé par les cellules endothéliales après infection par P. aeruginosa. Ces méthodes doivent demeurer aisément adaptables aux analyses des échantillons cliniques humains.

Introduction

Les patients qui survivent à une pneumonie ont élevé le taux de mortalité dans les mois qui suivent l’hôpital décharge1,2,3,4,5,6. Dans la plupart des cas, la mort survient par certains type de défaillance terminale d’organes y compris rénale, pulmonaire, cardiaque, ou des événements hépatiques, mais aussi des AVC5,6. La raison pour le taux de mortalité élevé chez cette population de patients n’a jamais été établie.

La pneumonie est classée comme étant soit extra-hospitalière ou nosocomiales (infections nosocomiales) et les agents qui causent la pneumonie incluent des bactéries, virus, champignons et produits chimiques. Une des principales causes de la pneumonie nosocomiale est la bactérie Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa est un organisme Gram négatif qui utilise un système de sécrétion de type III pour transférer les diverses molécules effectrices, appelés exoenzymes, directement dans le cytoplasme des cellules de cible7,8. Au cours de l’infection des cellules endothéliales pulmonaires, les exoenzymes ciblent diverses protéines intracellulaires, y compris une forme endothéliale de la protéine associée aux microtubules tau9,10,11,12 , conduisant à la rupture de la barrière endothéliale aboutissant à un oedème pulmonaire sévère, une diminution de la fonction pulmonaire et, souvent, la mort.

Comme indiqué précédemment, les patients qui survivent à la pneumonie initiale ont élevé les taux de mortalité dans les 12 premiers mois suivant la sortie de l’hôpital. Un mécanisme potentiel pour expliquer ce phénomène, c’est que certains type de toxine de longue durée de vie est dégagée au cours de l’infection initiale qui mène à mauvais pronostic à long terme. Deux observations confirment cette possibilité. Tout d’abord, cultivés pulmonaire les cellules endothéliales qui sont traités initialement par la P. aeruginosa ne parviennent pas à proliférer pour jusqu'à une semaine après que les bactéries sont tuées par les antibiotiques,13. Deuxièmement, longue durée de vie des prions et agents ayant des caractéristiques de prion ont été démontrées dans diverses maladies humaines et animales, notamment les maladies associées au système nerveux14,15.

Méthodes pour l’examen de la production potentielle d’agents cytotoxiques longue durée de vie au cours de l’infection pulmonaire n’ont jamais été décrites. Ici figurent une série de simples in vitro tests qui peut être utilisé pour étudier la production de cytotoxine et l’activité suite à une infection à l’aide d’un agent causant la pneumonie habituellement, P. aeruginosa. Ces tests devraient demeurer aisément adaptables pour étudier l’induction de cytotoxine possible suite à une infection à l’aide d’autres agents qui causent la pneumonie, et les fractions surnageantes générées doivent aussi être utiles pour étudier les effets des cytotoxines dans son ensemble organes ou des animaux. Enfin, les dosages qui sont décrites ici très probablement sera adaptables pour tester les liquides biologiques humains et animaux pour la production de cytotoxines au cours de la pneumonie.

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Protocole

Toutes les procédures d’animaux ont été examinés et approuvés par les institutionnels et le Comité de protection des animaux de l’Université d’Alabama du Sud et ont été effectuées conformément aux règlements fédéraux, étatiques et locales. Les cultures primaires de rat pulmonaire les cellules endothéliales microvasculaires (PMVECs) proviennent de la cellule Culture Core Facility au centre de l’Université d’Alabama du Sud pour la biologie de poumon. Les cellules ont été préparés à l’aide des procédures décrites précédemment,16.

1. génération des surnageants cytotoxiques

Remarque : Ici, nous utilisons deux différentes souches de P. aeruginosa: PA103, qui possède un système de sécrétion de III type intact capable de transférer les exoenzymes ExoU et ExoT pour cibler les cellules au cours de l’infection et ∆PcrV, qui ne dispose pas d’un type de système de sécrétion III et est incapable de transférer des exoenzymes pour cibler les cellules après l’inoculation.

  1. Ensemencer des bactéries sur Vogel-Bonner (VB) agar plaques17 et croître une nuit à 37 ° C.
    1. Pour préparer les plaques, faire la solution suivante (sels de Vogel-Bonner ; stock de x 10) : mesurer 2 g MgSO4, 20 g d’acide citrique (acide libre), 100 g K2PO4et 35 g NaH2PO4. Ajouter ddH2O à 1 L et stériliser pendant 15 min avec échappement lent.
    2. Placer 7,5 g de gélose dans 450 mL FD2O et stériliser comme ci-dessus.
    3. Après autoclavage, placez les deux solutions dans un bain d’eau de 50 ° C pour refroidir.
    4. Ajouter 50 mL de la solution saline stock de 10 x VB à la gélose.
    5. Ajouter carbénicilline à 400 µg/mL (pour les souches P. aeruginosa utilisé) et bien mélanger en agitant le flacon.
    6. Déposer 5 mL de la solution d’agar VB en Pétri stériles individuelles, permettent l’agar pour solidifier et ensuite stocker à 4 ° C jusqu’au jour de l’ensemencement bactérien.
    7. Le jour de l’ensemencement bactérien, préchauffer un plat à 37 ° C et puis strier les bactéries sur la plaque à l’aide d’une anse stérile. Place la plaque dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit.
  2. Vérifier la pureté PMVEC de coloration positive avec fluorescent Griffonia simplicifolia lectine et une coloration négative avec fluorescentes Helix pomatia lectine (un marqueur de l’endothélium artériel). Les cellules aliquotes et congélation dans l’azote liquide.
  3. Pour les expériences, maintenir les cellules en de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de sérum de veau fœtal 10 % et la croissance de cellules dans un incubateur à 37 ° C contenant 5 % de CO2. Utiliser des cellules à passages 5-15.
    1. Pour la génération des surnageants cytotoxiques, plaque 2 x 106 cellules dans des plats individuels 150 cm et pousse pendant 3-4 jours jusqu’au confluent est atteint. Utiliser deux plaques par expérience (voir ci-dessous).
    2. Pour l’analyse des surnageants cytotoxiques, cellules5 plaque 1 x 10 dans des puits individuels d’un puits 6 plat et poussent pendant quatre jours jusqu'à confluence est atteint.
  4. Pour produire le surnageant, laver un des plats deux 150 cm de PMVECs de l’étape 1.3.1 avec une solution saline tamponnée au phosphate, trypsinize et puis compter les cellules (nous utiliser un compteur cellulaire automatisée et suivre le protocole du fabricant ; voir Table des matières). Laver l’autre plat de PMVECs avec Hank Balanced Salt Solution (HBSS) et ensuite infecter avec deux souches P. aeruginosa à une multiplicité d’infection (MOI) de 20:1. Ce résultat est obtenu comme suit :
    1. Pour P. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 UFC/mL. Pour préparer cette dilution, ajouter 1 mL HBSS dans une cuvette jetable 1 mL. Grattez suffisamment les bactéries de la plaque qui a été préparé à l’étape 1.1 jusqu'à l’obtention d’une OD540 de 0,25 lorsqu’elle est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre. La prochaine étape permettra un calcul de combien il faudra des bactéries.
    2. Une fois déterminé le nombre de PMVECs dans la boîte de Petri (étape 1.4 ci-dessus), déterminer le nombre de bactéries à ajouter à la seconde, non-trypsinisées boîte de Petri contenant les PMVECs. Par exemple, s’il est établi que la boîte de Petri de PMVECs contient 1,3 x 107 cellules, puis préparer 1,3 x 107 cellules x 20 bactéries/cellules x 1 mL/2 x 108 UFC = bactéries 1,3 mL.
    3. Diluer le 1,3 mL de bactéries en HBSS pour un volume final de 20 mL, afin que la totalité de la surface d’un plat de 150 cm peut être recouvert de liquide, puis ajouter les bactéries dilués à la plaque de PMVECs.
    4. Incuber les PMVECs inoculées avec les bactéries à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 4-5 h, jusqu'à ce que les lacunes sont visibles en formant de la monocouche cellulaire lorsque la plaque est observée au microscope (voir Figure 1 pour un niveau approprié de formation lacunaires).
    5. Recueillir le liquide surnageant, puis centrifuger pendant 10 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse de table pour supprimer les débris cellulaires.
      Remarque : Aucune centrifugeuse de dessus de table capable de produire suffisamment g force pour granuler entassée de cellules et de grandes cellules fragments peuvent être utilisés pour cette étape.
    6. Versez le liquide surnageant dans une seringue qui possède un filtre de 0,2 µm, attaché à son extrémité, puis passer le liquide surnageant à travers le filtre pour éliminer les bactéries.
    7. Utilisez une partie aliquote du liquide surnageant stérile pour test de cytotoxicité (voir 2.1) et congelez le reste du liquide surnageant à-80 ° C pour une utilisation future.

2. analyse des surnageants cytotoxiques

  1. Test de cytotoxicité
    1. Pousser PMVECs dans les plats de 6 puits jusqu’au confluent. Puits de lavage une fois avec HBSS, puis ajouter 1,5 mL du surnageant stérilisée par filtration (recueillie auprès de deux cellules PA103 - ou ∆PcrV-inoculés) à puits individuels. Ajouter HBSS stérile dans un autre puits comme témoin négatif.
    2. Placer la plaque dans l’incubateur à CO2 pendant 21 à 24 heures, puis l’observer pour meurtre/la cytotoxicité des cellules (voir étape suivante). Utiliser les surnageants qui présentent une cytotoxicité d’expérimentation plus et jeter celles qui ne présentent pas de mort cellulaire.
    3. Quantification de la mort cellulaire
      1. Procédures recommandées mesure communiqué de lactate déshydrogénase (LDH) des cellules mortes à l’aide de Kits de dosage LDH commercialement disponibles et du fabricant.
      2. Vous pouvez également chiffrer mort cellulaire au microscope à l’aide de logiciels ImageJ. Pour ce faire, enregistrez les images microscopiques et zones de la boîte de Petri contenant des cellules intactes, puis quantifier les régions manquent de cellules (indicatifs de la mort cellulaire dans une monocouche) à l’aide d’une macro personnalisée d’ImageJ (National Institutes of Health) (voir fichier de codage supplémentaire ). Si vous le souhaitez, effectuer les opérations de macro manuellement comme suit :
        1. Entrer images (au format RVB ou Tiff) dans la macro et d’ajuster le contraste à 15 % saturés pixels. Dupliquer les images à contraste réglable et exécuter la commande « soustraire le fond » pour obtenir une image de contraste élevé de cellules et gap zone dans le champ de vision.
        2. Soustraire cette image de l’image originale et combiner l’image obtenue avec l’image d’origine à l’aide de la calculatrice d’image « Et » fonction. Convertir l’image résultante en noir (lacunes) et masque blanc (cellules) avec la fonction de seuil (0 minimum, maximum 5) et utiliser la fonction « binaire éroder » pour éliminer le bruit de l’image.
        3. Mesurer le rapport du noir au blancs pixels dans l’image résultante à l’aide de la mesure de la « fraction de l’espace ». Tracer et exprimer des zones fractionnaires pour chaque point de temps de traitement sous forme de pourcentage de la zone écart maximal.
        4. Moyens de calculer et de comparer avec ANOVA à test post-hoc de Tukey, avec les valeurs de p inférieure à 0,05 considérés comme significatifs.
    4. Analyse par immunotransfert permet d’établir la présence d’amyloïde, oligomère tau et bêta-amyloïdes dans les surnageants de culture. Effectuer une analyse par immunotransfert utilisant11,10,procédures normalisées12, à l’exception de concentrer les surnageants de culture au moins 10 fois avant l’électrophorèse.
      1. Pour concentrer le liquide surnageant, placez 1 à 2 mL de liquide surnageant dans une unité de filtration de centrifugation dont la membrane a un seuil de poids moléculaire de 10 kDa. Ensuite, placez le filtre dans une centrifugeuse de dessus de table et centrifuger à 2 000 x g jusqu'à ce que le degré de concentration requis soit atteint (habituellement 45-60 min).
      2. Déterminer la quantité de protéine dans le surnageant concentré11 et charger des quantités égales d’échantillons dans les puits du gel.
      3. Exécuter les gels, les protéines de transfert sur nitrocellulose, puis sonde taches avec anticorps anti-amyloïdes A11, anticorps anti-oligomères tau T22 ou anticorps d’anti-Aß MOAB2 suivie d’anticorps secondaires appropriés. Développer les taches à l’aide de procédures standard de chimiluminescence.
    5. Pour faire un thioflavine T test, utilisez thioflavine T fluorescence (ThT) pour quantifier les amyloïdes dans les surnageants. Pour ces mesures, utiliser les surnageants stérilisée par filtration.
      1. Préparer une solution (x 50) de thioflavine T en suspendant 8 mg thioflavine T (ThT) dans une solution saline tamponnée au phosphate de 10 mL (PBS). Après mélange, filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 µm pour éliminer les particules.
      2. Pour les mesures, ajouter 20 µL de stock ThT à 1 mL de PBS dans une cuvette de spectrophotomètre de 1 mL. Placer l’échantillon dilué dans un spectrofluorimeter.
      3. Mesurer l’émission de fluorescence de base à l’aide d’une excitation 425 nm et l’émission de fluorescence de 450-575 nm incréments de 2 nm de numérisation.
      4. Effectuer un balayage de Time-lapse utilisant une excitation 425 nm et 482 émission nm, avec les données acquises chaque 0,2 s pour 60 s.
      5. Les premiers 20 s du scan Time-lapse mesures de fluorescence dans la cuvette vide. À 20 s, mettre en pause le scan et ajouter 10 µL de surnageant stérilisée par filtration dans la cuvette. Mélanger la cuvette par inversion et puis remettre dans la spectrofluorimeter.
      6. Reprendre l’analyse temporelle, acquérant le final 40 s de données.
      7. À la fin du scan Time-lapse, effectuer un balayage de spectre d’émission de fluorescence final à l’aide des paramètres identiques, comme détaillé dans 2.1.5.3.

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Résultats

Un test simple in vitro a été développé pour doser la présence de cytotoxines dans les surnageants de cellules infectées par la bactérie P. aeruginosa. Fondamentalement, milieu de culture de cellules infectées est recueilli 4 h après l’addition de bactéries, les bactéries sont éliminées par stérilisation de filtre de surnageant de la culture, et puis le surnageant stérile est ajouté à une nouvelle population de cellules. Les cellules sont ensuite observés 21 à 24 h après...

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Discussion

Méthodes simples en vitro figurent ici, qui permettent la démonstration de la génération des cytotoxiques amyloïdes lors de l’infection avec une pneumonie causant l’organisme. Ces méthodes incluent un test de cytotoxicité de culture cellulaire, l’immunoblotting, la quantification des cellules tuer en utilisant une nouvelle méthode microscopique et liaison ThT. Des agents cytotoxiques, les analyses ont démontré qu’ils sont amyloïdes dans la nature (Figure 2 et

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Déclarations de divulgation

Aucun rapport.

Remerciements

Cette recherche a été financée en partie grâce à des subventions de NIH HL66299 TS, RB et SL, HL60024 à TS et HL136869 MF.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lapin anti bêta-amyloïdeThermo71-5800
A11 Anticorps oligomère amyloïdeStressMarqSPC-506D
T22 Anticorps anti-oligomère tauEMD MilliporeABN454
Thioflavin TSigma AldrichT3516
HBSSGibco14025-092
PBSGibco10010-023
Filtres pour seringues de 0,22 micronMilliporeSLGP033RS
DMEMGibco11965-092
HRP Chèvre anti-lapin IgGAbcamab6721-1
Souches PA103 et &Delta ; PcrVCes souches de P. aeruginosa ont été obtenues auprès du Dr Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lectinSigma AldrichL9381
TRITC Helix pomatia lectinSigma AldrichL1261
AgarFisherBP1423-500
0,22 micron nitrocelluloseBioRad162-0112
Collagénase de type 2WorthingtonLS004176
Sérum fœtal bovinHycloneSH30898.03IH
PenStrepGibco15070063
Carbenicilline Sel disodiqueSigma  ;C1389
Concentrateurs de microcétrifugation - coupure de 10 000 MWMilliporeUFC801008
phosphate de potassium dibasiqueSigma  ;795496-500G
Phosphate de magnésium heptahydratéMP BiomedicalsMP021914221
Acide citriqueG Biosciences50-103-5801
Phosphate de sodium dibasique heptahydratéSigmaS9506-500G
Compteur de cellules automatisé CountessInvitrogenC10277

Références

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