Évaluation de collagène et élastine Microarchitectures dépendant de la pression dans les artères de résistance vivants, humains en microscopie par Fluorescence Label-free

Maria Bloksgaard; Bjarne Thorsted; Jonathan R. Brewer; Jo G. R. De Mey

doi:10.3791/57451

Article de méthode

Évaluation de collagène et élastine Microarchitectures dépendant de la pression dans les artères de résistance vivants, humains en microscopie par Fluorescence Label-free

DOI :

10.3791/57451

⸱

9 avril 2018

Maria Bloksgaard¹ , Bjarne Thorsted² , Jonathan R. Brewer² , Jo G. R. De Mey¹^,³

¹Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, ²Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, ³Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons simultanée des essais mécaniques et 3D-imagerie de la paroi artérielle d’isolé, vivent les artères de la résistance humaine et des analyses d’image Fidji et Ilastik pour la quantification des densités de volume et d’organisation spatiales élastine et de collagène. Nous discutons de l’utilisation de ces données dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle.

Résumé

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La contribution de pathogène de résistance artère remodelage est documentée dans l’hypertension essentielle, le diabète et le syndrome métabolique. Enquêtes et le développement de modèles mathématiques microstructurally motivés pour comprendre les propriétés mécaniques des artères de résistance humain sain ou malade ont le potentiel pour aider à comprendre comment la maladie et les traitements médicaux effet sur la microcirculation humaine. Pour développer ces modèles mathématiques, il est essentiel de déchiffrer la relation entre les propriétés mécaniques et micro architecturale du mur microvasculaire. Dans ce travail, nous décrivons une méthode ex vivo pour essais mécaniques passives et simultanée exempte d’étiquette imagerie en trois dimensions de la microarchitecture d’élastine et de collagène dans la paroi artérielle des artères isolées de la résistance humaine. Le protocole d’imagerie peut être appliqué aux artères de résistance de toute espèce d’intérêt. Analyses d’image sont décrits pour quantifier les changements i) induit par la pression dans les angles de ramification de la limitante élastique interne et de la rectitude de collagène adventitiels à l’aide de Fidji et des densités de volume ii) collagène et d’élastine, déterminées à l’aide du logiciel Ilastik. Préférence toutes les mesures mécaniques et d’imagerie sont effectuées sur les routes de live, perfusés, cependant, est une approche alternative à l’aide de pression standard de vidéo-microscopie myographie en combinaison avec l’imagerie après fixation de re-pressurisés discutés. Cette méthode alternative offre aux utilisateurs des options différentes pour les approches de l’analyse. L’inclusion des données mécaniques et d’imagerie dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle est discutée, et développement futur et ajouts au protocole sont proposées.

Introduction

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La contribution pathogène et les effets du remodelage de l’artère de résistance sont documentées dans l’hypertension essentielle, le diabète et le syndrome métabolique¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Déchiffrer la relation entre les propriétés mécaniques et micro architecturale du mur microvasculaire est essentiel pour le développement de modèles mathématiques de cette association. Ces modèles seront mieux comprendre le processus de remodelage et soutiennent le développement de modèles de silico utile pour tester des stratégies ....

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Protocole

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Collection des biopsies du péricarde pariétal humain destiné à ces travaux ont été effectuée après consentement éclairé, comme précédemment décrit³³. L’étude de tissus humains sont conformes aux principes énoncés dans la déclaration d’Helsinki³⁴ et a été approuvé par les comités régionaux sur l’éthique de la santé recherche pour Southern Denmark (S-20100044 et S-20140202) et l’Agence danoise de Protection des données.

1. récupérez le tissu et l’artère de résistance isolat (homme)

Recueillir des échantillons de tissus d’intérêt immédiatement après l’excision pendant une intervention c....

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Résultats

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Le myographe pression sur mesure pour l’imagerie utilisée dans ce travail est montré dans la Figure 1. Une attention particulière pour la conception de la myographe a été versée à i) la chambre avec une petite quantité (2 mL) et ii) la possibilité pour le positionnement des canules proche et en parallèle avec le fond de verre (Figure 1 b). Le fond de la chambre correspond à un 50 × 24 mm #1.5 verre couvre-objet (remplaçable). Le .......

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Discussion

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Ce travail représente notre suggestion pour un standard, combinée d’imagerie et de la pression myographie approche, précieuse pour l’évaluation simultanée des propriétés mécaniques des artères de résistance et les changements liés à la pression dans la structure de cette artère mur sur une plage de pression de 0 à 100 mmHg. L’approche présentée a été développé en utilisant des équipements de construction personnalisée, cependant, n’importe quel myographe de pression qui s’adapte sur un microscope à fluorescence biphotoni.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs remercient le centre d’imagerie biomédicale danois moléculaire à la Faculté des Sciences naturelles, University of Southern Denmark, pour l’utilisation des laboratoires et des microscopes. Kristoffer Rosenstand et Ulla Melchior sont reconnues pour l’excellente assistance technique avec la pression myographie et d’imagerie.

....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue
Outils scientifiques fins	15401-12
Outils scientifiques fins	11251-23
Nikon	SMZ800N
Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	761028	à des fins
Vitrex Medical A/S, Herlev, Danemark	1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, Royaume-Uni
Ethicon	Ethilon 11-0
Construit		DK numéro de brevet 201200167, Université du Danemark du Sud, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	B3259
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	A7030
² ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	C5670
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	G7021
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	E3889
Merck Millipore, Hellerup, Danemark	1.00496.9010	Phosphate tamponné (pH 6,9) solution de formaldéhyde à 4 % ;
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	H3784
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	P9666
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	P5655
° ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	M2643
° ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	S2002
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	S5886
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	S5761
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific	10010015
; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	PHR1423
Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.	Z370525
; Tocris Bioscience, Bristol, Royaume-Uni	538944
Nikon	Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon	CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon	CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Danemark	H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tü ; bingen, Allemagne).	ChromaET 460 nm dichroïque dichroïque
AHF analysentechnik AG (Tü ; bingen, Allemagne).	Semrock FF01-520/35-25 Filtre
BrightLine AHF analysentechnik AG (Tü ; bingen, Allemagne).	Chroma ET402/15X ;
L’épaisseur de la lamelle Scotch TM

de dissection sur mesure doit correspondre à celle de l’objectif utilisé au microscope (#1 ou #1,5), ou régler le collier de réglage pour qu’il corresponde à la lamelle

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med.....

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Mots-clés

Collagen Elastin Microarchitecture Resistance Artery Mechanics Label free Fluorescence Microscopy Two photon Excitation Imaging Elastin Autofluorescence Collagen Second Harmonic Generation Fiji Image Analysis Ilastik Software Analysis Pressure induced Vascular Changes Extracellular Matrix Quantification

Évaluation de collagène et élastine Microarchitectures dépendant de la pression dans les artères de résistance vivants, humains en microscopie par Fluorescence Label-free

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