Article de méthode

Évaluation de collagène et élastine Microarchitectures dépendant de la pression dans les artères de résistance vivants, humains en microscopie par Fluorescence Label-free

DOI :

10.3791/57451

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9 avril 2018

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1Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons simultanée des essais mécaniques et 3D-imagerie de la paroi artérielle d’isolé, vivent les artères de la résistance humaine et des analyses d’image Fidji et Ilastik pour la quantification des densités de volume et d’organisation spatiales élastine et de collagène. Nous discutons de l’utilisation de ces données dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La contribution de pathogène de résistance artère remodelage est documentée dans l’hypertension essentielle, le diabète et le syndrome métabolique. Enquêtes et le développement de modèles mathématiques microstructurally motivés pour comprendre les propriétés mécaniques des artères de résistance humain sain ou malade ont le potentiel pour aider à comprendre comment la maladie et les traitements médicaux effet sur la microcirculation humaine. Pour développer ces modèles mathématiques, il est essentiel de déchiffrer la relation entre les propriétés mécaniques et micro architecturale du mur microvasculaire. Dans ce travail, nous décrivons une méthode ex vivo pour essais mécaniques passives et simultanée exempte d’étiquette imagerie en trois dimensions de la microarchitecture d’élastine et de collagène dans la paroi artérielle des artères isolées de la résistance humaine. Le protocole d’imagerie peut être appliqué aux artères de résistance de toute espèce d’intérêt. Analyses d’image sont décrits pour quantifier les changements i) induit par la pression dans les angles de ramification de la limitante élastique interne et de la rectitude de collagène adventitiels à l’aide de Fidji et des densités de volume ii) collagène et d’élastine, déterminées à l’aide du logiciel Ilastik. Préférence toutes les mesures mécaniques et d’imagerie sont effectuées sur les routes de live, perfusés, cependant, est une approche alternative à l’aide de pression standard de vidéo-microscopie myographie en combinaison avec l’imagerie après fixation de re-pressurisés discutés. Cette méthode alternative offre aux utilisateurs des options différentes pour les approches de l’analyse. L’inclusion des données mécaniques et d’imagerie dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle est discutée, et développement futur et ajouts au protocole sont proposées.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La contribution pathogène et les effets du remodelage de l’artère de résistance sont documentées dans l’hypertension essentielle, le diabète et le syndrome métabolique1,2,3,4,5. Déchiffrer la relation entre les propriétés mécaniques et micro architecturale du mur microvasculaire est essentiel pour le développement de modèles mathématiques de cette association. Ces modèles seront mieux comprendre le processus de remodelage et soutiennent le développement de modèles de silico utile pour tester des stratégies pharmacologiques ciblant des maladies liées de remodelage de la paroi artérielle.

Études préalables porté à comprendre comment la microarchitecture de la paroi artérielle est liée à la mécanique de la paroi artérielle en incorporant des mesures mécaniques et la microarchitecture de la matrice extracellulaire (ECM) sont presque exclusivement réalisées sur les grands , les artères élastiques conduit des souris ou porcine6,7,8,9,10,11. Imagerie des microstructures de la paroi est généralement effectuée à l’aide des techniques optiques non linéaires, profitant de l’autofluorescence d’élastine et de deuxième génération harmonique de collagène. Cela permet l’imagerie spatio-temporelle des deux principales composantes de la matrice extracellulaire, élastine et du collagène, sans une nécessité pour la coloration. Imagerie de la paroi artérielle dans toute son épaisseur est un défi dans les artères de gros conduits en raison de la dispersion de la lumière dans les médias de tunica épais. Toutefois, pour déterminer comment la microarchitecture des composantes structurales de la paroi artérielle portent sur les propriétés mécaniques observées, informations en trois dimensions doivent être obtenues pendant l’essai mécanique. Pour les grosses artères comme l’aorte humaine, cette opération requiert biaxial montage, les essais mécaniques et imagerie des régions d’intérêt en morceaux2 1-2 cm de la paroi artérielle7,9,10, 12. qu’une partie de la paroi peut être imagée et testée mécaniquement.

Pour les plus petites artères de toute espèce (par exemple, péricardique humaine13, pulmonaire14 et les artères sous-cutanées15 , rat artères mésentériques16,17,18, 19 , 20, souris cremaster, mésentérique, cérébrale, fémorale et artères carotides21,22,23,24,25,26, 27) imagerie de l’épaisseur du mur entier est possible et peut être combinée avec les essais mécaniques. Cela permet l’enregistrement simultané des propriétés mécaniques et les arrangements structurels au sein de la paroi. Toutefois, une modélisation mathématique directe de la relation entre les altérations observées dans la structure tridimensionnelle de l’ECM et modifié les propriétés mécaniques de la paroi artérielle de résistance, au meilleur de nos connaissances seulement signale à récemment dans les artères de la résistance humaine13,15.

Dans ce travail, on décrit une méthode de ex vivo pour essais mécaniques passives et une imagerie tridimensionnelle simultanée de la microarchitecture d’élastine et de collagène dans la paroi artérielle des artères isolées de la résistance humaine. Le protocole d’imagerie peut être appliqué aux artères de résistance de toute espèce d’intérêt. Analyses d’image sont décrits pour l’obtention de mesures des angles de ramification de la limitante élastique interne et de rectitude de collagène adventitiels13 à l’aide de Fidji28. Les densités de volume collagène et d’élastine sont déterminées au moyen de logiciels Ilastik29 et enfin, on discute de l’inclusion des données mécaniques et d’imagerie dans les modèles mathématiques de la mécanique de la paroi artérielle.

Le but de décrire les analyses de l’imagerie et l’image en combinaison avec la modélisation mathématique des techniques consiste à fournir aux enquêteurs une approche systématique pour décrire et comprendre la pression induite par changements observés dans l’ECM des artères de résistance. La méthode décrite vise à quantifier les changements dans l’ECM dans un récipient pendant la pressurisation, en comparant la structure de l’ECM à 20, 40 et 100 mmHg. Ces pressions ont été retenues pour la détermination de la structure de la paroi artérielle plus dociles (20 mmHg), raide (100 mmHg) et un état intermédiaire de (40 mmHg), respectivement. Cependant, tout processus dans la paroi vasculaire des artères vivants, y compris les changements induits par les composants vasoactifs, hystérésis et flux, peut être quantifié, selon l’hypothèse de recherche en question par l’enquêteur.

L’utilisation de la microscopie de fluorescence excitation biphotonique (TPEM) en combinaison avec un myographe pression pour étudier la pression (ou autre) induit des changements dans l’ECM des artères direct est mis en valeur. Tout d’abord, parce que cela permet une acquisition simultanée de la structure tridimensionnelle dans l’ensemble de la paroi artérielle (diamètre et épaisseur de paroi) ainsi que l’acquisition de label-free tridimensionnelle de haute qualité, des images de la collagène et d’élastine détaillées microarchitectures comme décrit13 en profitant de l’autofluorescence élastine et le collagène deuxième génération harmonique signal (SHG)30. Deuxièmement, TPEM permet d’utilisation de la lumière d’excitation proche-infrarouge de faible énergie, minimiser le photovieillissement du tissu et ainsi, l’imagerie répété à exactement la même position dans la paroi vasculaire est autorisée, permettant des analyses répétées-Mensurations d’observé changements.

L’utilisation d’une approche alternative à l’aide de l’imagerie confocale de pression fixé des artères est discutée pour permettre aux utilisateurs sans accès à TPEM l’occasion d’utiliser la méthode décrite aussi bien. Informations sur la structure et le volume des densités ECM peuvent également être récupérées de l’analyse bidimensionnelle des tissus sectionnés en série, par exemple, tel que décrit par31,32. Toutefois, en raison de l’absence de possibilité de récupérer des informations structurelles en trois dimensions sur les échelles de longueur de l’artère ainsi qu’au cours de l’évolution des conditions à l’aide de cette méthode, il est déconseillé d’utiliser cette approche pour les enquêtes de pression et traitement induit des changements en trois dimensions de la MEC.

L’exigence minimale pour l’enquêteur d’appliquer la méthode décrite ci-après est l’accès à un programme d’installation pour canulation et la pressurisation des artères en combinaison avec un microscope à fluorescence excitation confocal ou deux photons. La configuration décrite dans le protocole suivant est un myographe pression sur mesure avec un capteur de force longitudinale, construit pour s’adapter sur un microscope à fluorescence personnalisé excitation construit à deux photons inversé.

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Protocole

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Collection des biopsies du péricarde pariétal humain destiné à ces travaux ont été effectuée après consentement éclairé, comme précédemment décrit33. L’étude de tissus humains sont conformes aux principes énoncés dans la déclaration d’Helsinki34 et a été approuvé par les comités régionaux sur l’éthique de la santé recherche pour Southern Denmark (S-20100044 et S-20140202) et l’Agence danoise de Protection des données.

1. récupérez le tissu et l’artère de résistance isolat (homme)

  1. Recueillir des échantillons de tissus d’intérêt immédiatement après l’excision pendant une intervention chirurgicale. Transfert du tissu à 4 ° C HEPES physiologique solution saline tamponnée (HBS) immédiatement après la collecte et la stocker dans HBS.
    Remarque : Les tissus humains sont seulement collectées après l’approbation par commissions institutionnelles et éthiques, mais aussi écrit le consentement éclairé des patients. Composition de HBS en mM : 144 de NaCl, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, HEPES 14,9, glucose 5.5. Ajuster le pH 7,4 avec NaOH et filtre la solution bien que 0,2 µm.
  2. Laissez les tissus prélevés en HBS stérile à 4 ° C durant la nuit pour laver des anesthésiques.
    Remarque : Aucun effet de stockage pendant la nuit sur l’intégrité du navire et de la fonctionnalité doit être vérifiée par le laboratoire de recherche individuelles.
  3. Isoler soigneusement les artères de résistance de taille (diamètre du lumen ± 200 µm) à l’aide d’une paire de sharp-tip pinces et ciseaux micro-dissection.
  4. Stocker les artères à 4 ° C en HBS glacée tout en amorçant la chambre de pression/imagerie.

2. monter l’artère isolée dans la pression myographe

  1. Monter les canules de verre d’un diamètre de pointe d’environ 80 µm sur les détenteurs de canules. Positionner le µm conseils environ 150 au-dessus du fond de verre de chambre.
    NOTE : canules de 45° pointe plié peuvent permettre un positionnement précis du navire au-dessus du fond de verre.
  2. Remplissez les deux entrée puis le tube de sortie avec HBS avec 1 % de BSA et connecter au système de pression.
    NOTE : BSA est inclus afin de préserver la fonction des cellules endothéliales.
  3. Monter l’artère isolée à l’aide de deux sutures double noeud par la canule.
    Remarque : Les noeuds peuvent être préparés à l’avance et stockés sur double ruban adhésif jusqu'à ce que nécessaire.
  4. Remplir la chambre avec HBS et placer deux doubles noeuds sur chaque canule de verre.
    Remarque : Lorsque vous utilisez des artères affichant un tonus myogène, HBS remplacer avec le calcium que libre HBS additionné de 3 µM EGTA et 3 µM nitroprussiate de sodium.
  5. Tenir l’artère doucement à une extrémité à l’aide de deux paires de pinces à bout pointu. Ouvrez la lumière de l’artère et faire glisser doucement sur la canule. Difficulté sur la canule à l’aide de deux noeuds.
  6. Appliquer une pression de 5 mmHg pour rincer délicatement la lumière avec HBS / 1 % BSA.
  7. Canule dans l’autre extrémité de l’artère et fixez-le sur la canule à l’aide de deux doubles noeuds.
  8. Transférer le myographe sur la platine du microscope et pressuriser l’artère à 5 mmHg (pression d’entrée = pression de sortie), puis chauffer jusqu'à 37 ° C pendant 30 min.
  9. Facultatif : Calibrer le capteur de force longitudinale selon les instructions du fabricant (1 g = 9.81 mN).
    Remarque : Il est essentiel d’étalonner le capteur de force après qu’il est sensible à la température de chauffage.

3. réaliser l’expérience : Imagerie du diamètre artériel, épaisseur de paroi et le collagène et élastine Microarchitecture utilisant TPEM

  1. Analyser rapidement l’artère canulée sous pressurisé à 5 mmHg avec un objectif 20 X (ouverture numérique (NA) ≥ 0,8) et la lumière d’excitation faible puissance afin d’évaluer le navire diamètre et épaisseur de paroi à 5 mmHg.
    Remarque : Pour des microscopes inversés, utiliser un objectif à immersion d’eau ; pour les microscopes verticale, utilisez une eau trempage objectif. Si l’objectif n’a pas un collier de correction pour corriger pour l’épaisseur de la lamelle couvre-objet, assurez-vous de faire correspondre la lamelle couvre-objet utilisé avec l’objectif utilisé. Les paramètres du logiciel et les descriptions peuvent varier selon l’utilisateur-interphase et le microscope et le logiciel utilisé.
    1. Configurer le chemin optique.
      1. Activer Mai Tai deux photons laser et placez-le à la lumière d’excitation 820 nm.
        ATTENTION : Éviter toute exposition à une lumière laser visibles mais aussi invisibles.
      2. Recueillir des émissions simultanément dans les deux canaux. Split d’émission lumineuse entre le Photomultiplier utilisant un miroir dichroïque de longue passe nm et une émission virée à l’aide de filtres à large bande passante 30-60 nm centrées à 520 460 nm (élastine) et 410 nm (collagène), respectivement.
    2. Activer l’analyse continue avec 10 µs laser dwell time/pixel et 512 × 512 pixels pour 100 % de champ.
    3. Parcourir manuellement l’artère pour déterminer la profondeur où le diamètre maximum est observé.
    4. Choisissez une tranche rectangulaire couvrant les plus large diamètre de l’artère et analyser une seule image avec taille ≤ 300 nm/pixels (Figure 2). Utilisation comme puissance lumineuse faible excitation et temps de pause de pixel que possible pour éviter le photodamaging l’artère direct.
      Remarque : Il est recommandé d’obtenir une forme rectangulaire, par exemple., 100 × 1024 pixels image, plutôt qu’une image quadratique à cette position pour gagner du temps et de limiter l’exposition de photon de tissus (Figure 2).
    5. Enregistrer l’image pour des analyses ultérieures.
  2. Déterminer le lumen diamètre et épaisseur de paroi au diamètre maximal de l’artère.
    1. Charger l’image dans les îles Fidji.
    2. Définissez l’échelle en cliquant Main menu | Analyser | Définissez l’échelle et entrez les taux µm/pixel et les pixels (il est fortement recommandé de garder le pixels 1:1).
    3. Choisissez l’outil de ligne de Fidji et tracer une ligne entre les deux lamelles élastiques internes de chaque côté de la lumière artérielle et cliquez sur ctrl + M. Fidji des rapports longueur comme valeur par défaut dans le tableau de résultats.
    4. De même, tracer des lignes plus pour mesurer l’épaisseur de chaque paroi et cliquez sur ctrl + M pour mesurer le balisage suivant.
    5. Enregistrer les mesures.
  3. Image de collagène et élastine microarchitecture à 5 mmHg en balayant toute l’épaisseur de la paroi artérielle, obtenir des piles d’image 3D de bonne qualité pour 1-3 régions d’intérêt le long de l’artère.
    1. Obtenir des piles d’image par le biais de toute la paroi de l’artère à l’aide d’un 60 X objectif, NA ≥ 1, tailles pixel optimisée et z-espacement.
      1. Calculer les conditions optimales d’imagerie (tailles de pixel et l’espacement de z-étape) conformément à la voie optique, milieu d’immersion et dégustez les indices de réfraction à l’aide de la calculatrice scientifique Volume d’imagerie Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator).
        Remarque : Faites attention ici à la différence entre la taille des pixels optimale et z-espacement par rapport à l’avis à la section 3.4. plus haut sur l’utilisation d’un format de pixel maximum .
    2. Utilisez les mêmes paramètres d’excitation et d’émission que ci-dessus (3.1.1.).
    3. Analyser rapidement la paroi des vaisseaux tel que décrit ci-dessus pour déterminer l’épaisseur de la pile-z.
    4. Définir le début de z-pile et la profondeur de la fin, l’espacement z-étape et la densité de pixels (calculé en 3.3.1.1.) et effectuer le z-scan. Enregistrez chaque canal séparément.
      Remarque : Les Images doivent être assez petits par exemple 30 x 30 µm ou 50 × 50 µm selon la taille du navire pour éviter toute influence de courbure dans les analyses subséquentes d’image.
  4. Déterminer le diamètre artériel, l’épaisseur du mur et microarchitecture élastine et de collagène à des pressions restantes du protocole.
    1. 3.1 ou 3.2 à pressions 10 et 20 mmHg de répéter, répéter 3,3 à pression 20 mmHg.
    2. Répétez les points 3.1 et 3.2 à 40 mmHg de pression.
    3. 3.1 ou 3.2 à pressions, 60, 80 et 100 mmHg de répéter et répéter 3,3 à 100 mmHg.
      NOTE : 3.1 à 3.3 peuvent être répétées pour toutes les pressions et les combinaisons des pressions (par exemple une série/combinaison de pressions ainsi que diminue croissantes), selon l’hypothèse à tester. Éosine concentration 0,3 - 1 µM peuvent être ajoutés pour améliorer l’élastine autofluorescence dans le cas de photoblanchiment. Photoblanchiment peut être évité en appliquant comme excitation faible puissance légère que possible.
    4. Remplacez la mémoire tampon dans la chambre myographe frais 37 ° C HBS après chaque étape de la pression. Permettre l’artère s’adapter pendant 5 min avant l’imagerie après chaque changement de pression.
  5. Stocker les piles de canaux séparément pour les analyses de l’image.
  6. Tester la viabilité de l’artère.
    1. Appliquer 10 µM U46619 dans la chambre myographe suivie par l’ajout de 10 bradykinine µM lorsqu’on observe une constriction stable.
    2. Enregistrer le diamètre et épaisseur de paroi comme décrit ci-dessus dans la section 3.1, suite à la demande de chacun des composés.
    3. Ajouter 3 µM nitroprussiate de sodium lorsque l’artère n’est pas entièrement dilatée après l’addition de la bradykinine et enregistrement diamètre et épaisseur de paroi.
      Remarque : En fonction des propriétés pharmacologiques de l’artère d’intérêt (lit vasculaire et espèces) autres vasoconstricteur et vasodilatateur (endothélium-dépendante) composés utilisables.
  7. Facultatif : Fixer l’artère sous pression ou continuer avec l’imagerie de collagène et d’élastine pour des densités de volume (étape 7).
    1. Ajoutez 4 % de formaldéhyde dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C pendant 1 h.
    2. Laver l’artère fixe trois fois dans du PBS 1 x et faites doucement glisser l’artère hors les canules, touchant uniquement les parties de l’artère en dehors des noeuds. Ne pas enlever les noeuds, utilisez-les pour tenir l’artère lors du transfert à un tube de rangement.
    3. Magasin à 1 x PBS / 0,05 % d’azide de sodium à 4 ° C jusqu'à ce que l’imagerie de l’élastine et le collagène des densités de volume ou d’autres fins.
      NOTE : Artères fixes peuvent être conservés pendant au moins 3 mois dans 1 x PBS / 0,05 % d’azide de sodium à 4 ° C.

4. calcul du Stress relations de souche et rigidité intrinsèque mur

  1. S’il vous plaît suivre les formules et les étapes de calcul pour le calcul des contraintes, souches et la raideur de mur tel que décrit par Bloksgaard, M. et al. 13 et les références dans les présentes.

5. image Analysis - Angles de ramification de IEL (limitante élastique interne)

  1. Pile d’ouvrir l’image dans les îles Fidji. Allez dans fichier | ouvrir l’image pour sélectionner image ensemble.
    NOTE : Les projections intensité Max consécutif de 2-7 z-sections couvrant la Lei (1-2 µm d’épaisseur) sont utilisées pour déterminer les angles IEL élastine fibres ramifiées à l’aide de l’outil angle à Fidji28,35. Reportez-vous à la Figure 4 a à titre d’illustration.
  2. Aller à Image | piles | projet z... de choisir les images et la « Projection d’intensité Max ».
  3. Enregistrez la projection de l’intensité max sous TIFF.
  4. Choisissez autant bifurcations IEL fibre possible à l’aide de l’outil « angle » et systématiquement à travers les images. Cliquez sur ctrl + M pour mesurer chaque angle.
  5. Enregistrer la feuille de résultats de Fidji.

6. image Analysis - collagène adventitiels ondulation

  1. Pile d’ouvrir l’image dans les îles Fidji. Allez dans fichier | ouvrir image pour sélectionner image ensemble.
    NOTE : Max projections d’intensité de 2-7 consécutives z-sections portant sur le droit de collagène à l’extérieur de la limitante élastique externe (anguille, 1-4 µm d’épaisseur) sont utilisés pour déterminer ondulation de collagène utilisant le plugin de Fidji NeuronJ36 tel que décrit par Rezakhaniha, R . et al. 37 (Figure 4 b).
  2. Définissez l’échelle. Allez dans analyser | définissez échelle d’entrer les dimensions en pixels.
  3. Aller à Image | piles | projet z... de choisir de travailler avec des images et « Projection d’intensité Max ».
  4. Modifier le type d’Image à 8 bitt TIFF en cliquant sur Image | type | 8 bitt et enregistrez la projection de l’intensité max sous TIFF.
  5. Mesurer la rectitude de fibres de collagène en utilisant le Plugin de J de neurone de Fidji.
    1. Ouvrez le plugin NeuronJ en cliquant sur Fidji | Plugins | Neurone J.
    2. Ouvrir les 8 bits TIFF dans NeuronJ en cliquant sur charger l’Image | Sélectionnez le fichier.
    3. Cliquez sur Ajouter des calques, puis sélectionnez les fibres à analyser en cliquant sur le début et la fin de chaque fibre.
    4. Cliquez sur les tracés de mesure, choisissez afficher le suivi (Lf) et mesures de vertex dans la boîte de dialogue.
  6. Calculer L0/Lf dans excel (ou similaire) et enregistrer les résultats.
    1. Copiez et collez des Fidji neurone J tracés et sommets sortie vers excel (ou similaire) et calculer L0 en utilisant le théorème de Pythagore partir des mesures du sommet. Premier et dernier point à la ligne indiquent les positions des extrémités de l’hypoténuse dans un système de coordonnées 2D.
      Remarque : Un L0/Lf [longueur de bout à bout de bundle de fibre de collagène via une ligne droite (L0) / pleine longueur (Lf)] proche de 1 indique une fibre de collagène presque rectiligne.

7. imagerie de collagène et d’élastine Volume densités

  1. Laver l’artère (fixe) 1 x dans du PBS et souiller pendant 15 min dans 1 Eosine µM dans du PBS 1 x dans l’obscurité. Pour les artères fixes, effectuez cette étape à la température ambiante.
    NOTE : Éosine améliore la fluorescence de l’élastine. Éosine souillera autres structures telles que le collagène et le cytoplasme de la cellule si l’échantillon est laissé dans la solution colorante pendant de longues périodes. Si la coloration des autres structures est trop intense, abaisser la concentration de l’éosine à 0,3 µM ou répéter le lavage.
  2. Laver l’artère 3 x dans du PBS 1 x
    1. Pour les artères fixes : monter l’artère pour l’imagerie.
      ATTENTION : Imagerie des vaisseaux non pressurisés ne permet pas de récupérer des informations quantitatives géométriques. Lorsque les quantités absolues sont nécessaires, ceux-ci devraient provenir toujours sur les routes de direct et sous pression. Ratios de volume peuvent être obtenus sur les artères non pressurisés avec cette méthode.
      1. Placer deux morceaux d’adhésif double bande 1 à 1,5 cm de distance sur un objet de verre. Ruban adhésif double est environ 100 µm d’épaisseur. Appliquer une ou plusieurs couches de ruban pour correspondre au diamètre de l’artère à monter.
      2. Placer 10-20 µL de PBS sur le verre au milieu de la place et l’artère dans le menu déroulant de PBS.
        Remarque : La goutte doit être aussi petit et plat que possible pour éviter de pousser l’artère hors de position lors du montage de la lamelle couvre-objet.
      3. Placez le couvre-objet et appuyez sur double ruban adhésif.
      4. Remplissez le réservoir entre la lamelle couvre-objet et l’objet verre avec 1 x PBS. Remplir toutes les heures pour éviter le séchage de l’échantillon.
  3. Obtenir des piles d’image pour le collagène et l’élastine densités de volume avec un objectif 20 X NA > 1 afin de couvrir autant de la paroi artérielle que possible tout en ayant une bonne résolution optique (Figure 2D, 2 G et 2 H).
    Remarque : Utilisez un objectif à immersion d’eau pour l’imagerie des artères fixes sous un lamelle couvre-objet et un pendage objectif pour l’imagerie des artères vitales de l’eau. Si l’objectif n’a pas un collier de correction pour corriger pour l’épaisseur de la lamelle couvre-objet, assurez-vous de faire correspondre la lamelle à l’objectif. Utilisez de préférence des tailles de pixel optimale et z-espacement. Calculer celles-ci à l’aide de la calculatrice de Nyquist (étape 3.3.1.1.). Sinon, utilisez une taille de pixel minimum de 300 nm et z-espacement de 1 µm. Il est recommandé d’obtenir trois images sur toute la longueur de l’artère pour permettre à l’utilisateur de déterminer la variabilité intra-essai.
  4. Élastine d’image à l’aide de 820 nm excitation lumineuse et virés d’émission à l’aide de filtre un passe-bande large de 30 à 60 nm centrée à 520 nm.
  5. Collagène d’image à l’aide de 990 lumière d’excitation nm pour éviter toute excitation de l’élastine et autres protéines auto-fluorescente et collecter des émissions à l’aide du filtre passe-bande large de 10 à 30 nm centrée à 495 nm.
  6. Enregistrer image de chaque canal séparément sous forme de fichiers TIFF

8. image Analysis pour extraire l’élastine et le collagène des densités de Volume à l’aide de Ilastik

  1. Convertir des piles d’image TIFF à HDF5 utilisant les Fidji28,35 en cliquant sur choisir fichier | Enregistrer sous... HDF5.
  2. Créez deux dossiers de fichiers de données sur le disque dur de l’ordinateur, un d’élastine, pour piles de collagène d’image, respectivement. Copiez piles image pertinente dans le dossier approprié.
  3. Créez deux nouveaux projets de Ilastik dans le logiciel Ilastik, l’un de l’élastine, une pour le collagène, respectivement.
    1. Ouvrez Ilastik | Créer le nouveau projet | classification des pixels | nouveau projet | Ajouter des données et sélectionnez l’image dossier créé à l’étape 8.2.
      Remarque : Suivez l’Assistant de Ilastik.
  4. Importer une pile d’image 3D pour former le logiciel.
    1. Sélectionnez l’applet Input Data | zone d’espace de travail principal | Onglet de données brute | Ajouter un nouveau... | Ajouter des images séparées et choisir les données d’image souhaitée
  5. Choisissez les fonctionnalités pertinentes dans le logiciel.
    1. Applet de sélection des fonctionnalités ouverte | Sélectionnez la fonction qui ouvre une nouvelle boîte de dialogue. Pour plus d’informations, voir Figure 5 a .
  6. Ajouter au moins deux étiquettes en utilisant le bouton Ajouter Label dans l’applet de formation.
    Remarque : Chaque étiquette correspond à un type d’objet qui doit être séparé. Dans cet ouvrage, trois étiquettes servent d’élastine : l’élastine lui-même, les points lumineux (à exclure) et l’arrière-plan (à exclure).
  7. Dessiner des étiquettes sur le dessus de la pile d’images raw à l’aide du pinceau, outil d’annotation de style.
    1. Sélectionnez l’étiquette appropriée : cliquez sur l’outil pinceau et commencer à dessiner.
  8. Invite Ilastik à analyser la pile d’image et de chercher des biens similaires en cliquant sur Activer Live Update.
  9. Vérifiez soigneusement la carte de prédiction (Figure 5).
    NOTE : Le processus de l’image raw à une carte de prévision complet est présenté dans la Figure 5. Ilastik utilise la pile de la carte de prédiction pour segmenter l’image selon quel label un pixel est plus susceptible d’être lié (Figure 5).
  10. Appliquer un seuil.
    1. Sélectionnez l’applet de seuillage, choisir une méthode appropriée, lisse, étiquette d’entrée, seuil et taille des paramètres de filtre et enfin cliquez sur appliquer.
      Remarque : Ceci sépare les parties de même marqués de l’image en objets distincts. Tissu très connecté, comme l’élastine et le collagène n’a pas besoin d’être séparés, par conséquent, un seuil de 0,4 est appliqué (la valeur par défaut est 0,5). Figure 5E et 5F illustrent le résultat de l’application d’un seuil.
  11. Répétez la formation des Ilastik jusqu'à ce que le résultat est satisfaisant (seulement élastine, collagène respectivement est reconnu pour l’analyse).
    1. Fréquemment les applets de basculer entre la formation et de Segmentation (et parfois aussi le seuillage) au cours de ce processus. Un exemple de l’effet de re-formation Ilastik est illustré dans la Figure 6.
  12. Lot analyser les données d’image similaire : sélectionnez sélection d’entrée de prédiction par lot et ajoutez les dossiers pertinents.
    Remarque : Le Ilastik de sortie est une collection des piles de 3D image de pseudo - 1 bit (masques d’images) par 0 (zéro) qui dénote l’absence d’élastine (ou collagène) et 1 (un) qui dénote la présence présentes (la profondeur binaire réel est 8 bits).
  13. Vérifier les résultats pour chaque cheminée image de comparer visuellement les masques d’image et les fichiers image raw.
  14. Optimiser le masque de Ilastik (étapes 8,4 8,9) et réanalyser tout piles d’image avec des résultats insatisfaisants.
  15. Calculer des densités de volume élastine et de collagène de masques d’images de Ilastik à l’aide de MATLAB
    1. Ouvrir MATLAB.
    2. Sélection d’un dossier avec des masques d’image ilastik dans MATLAB « dossier en cours » fenêtre.
    3. Copiez le script MATLAB entre1 fichier complémentaire à l’éditeur de MATLAB, puis enregistrez ce code comme volumeCalculator.m dans le dossier MATLAB sur le disque dur de l’ordinateur.
    4. Entrez les tailles de pixels et hauteur en pixels dans les lignes de script
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000 ; micron % * micron
      pixelHeight = 0,9 ; micron %
    5. Enregistrez le script.
    6. Allez dans la fenêtre de commande MATLAB et entrez « volumeCalculator (« chemin-de-data') "pour charger le script.
    7. Cliquez sur Entrez. Chaque masque de l’Image est maintenant résumer et multiplié par le volume (connu) pixel/voxel (dimensions physiques d’un pixel multiplié par la résolution de l’axe z). La sortie de MATLAB est le volume total d’élastine et de collagène dans la pile de chaque image.
  16. Enregistrer les résultats.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le myographe pression sur mesure pour l’imagerie utilisée dans ce travail est montré dans la Figure 1. Une attention particulière pour la conception de la myographe a été versée à i) la chambre avec une petite quantité (2 mL) et ii) la possibilité pour le positionnement des canules proche et en parallèle avec le fond de verre (Figure 1 b). Le fond de la chambre correspond à un 50 × 24 mm #1.5 verre couvre-objet (remplaçable). Le ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail représente notre suggestion pour un standard, combinée d’imagerie et de la pression myographie approche, précieuse pour l’évaluation simultanée des propriétés mécaniques des artères de résistance et les changements liés à la pression dans la structure de cette artère mur sur une plage de pression de 0 à 100 mmHg. L’approche présentée a été développé en utilisant des équipements de construction personnalisée, cependant, n’importe quel myographe de pression qui s’adapte sur un microscope à fluorescence biphotoni...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient le centre d’imagerie biomédicale danois moléculaire à la Faculté des Sciences naturelles, University of Southern Denmark, pour l’utilisation des laboratoires et des microscopes. Kristoffer Rosenstand et Ulla Melchior sont reconnues pour l’excellente assistance technique avec la pression myographie et d’imagerie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Outils scientifiques fins15401-12
Outils scientifiques fins11251-23
NikonSMZ800N
Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.761028à des fins
Vitrex Medical A/S, Herlev, Danemark1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, Royaume-Uni
EthiconEthilon 11-0
ConstruitDK numéro de brevet 201200167, Université du Danemark du Sud, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.B3259
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.A7030
² ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.C5670
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.G7021
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.E3889
Merck Millipore, Hellerup, Danemark1.00496.9010Phosphate tamponné (pH 6,9) solution de formaldéhyde à 4 %  ;
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.H3784
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.P9666
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.P5655
° ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.M2643
° ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.S2002
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.S5886
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.S5761
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific10010015
  ; Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.PHR1423
Sigma-Aldrich, Brø ; ndby, Danemark.Z370525
  ; Tocris Bioscience, Bristol, Royaume-Uni538944
NikonCustom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
NikonCFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
NikonCFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, DanemarkH7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tü ; bingen, Allemagne).ChromaET 460 nm dichroïque dichroïque
AHF analysentechnik AG (Tü ; bingen, Allemagne).Semrock FF01-520/35-25 Filtre
BrightLine AHF analysentechnik AG (Tü ; bingen, Allemagne).Chroma ET402/15X  ;
L’épaisseur de la lamelle Scotch TM
de dissection sur mesure doit correspondre à celle de l’objectif utilisé au microscope (#1 ou #1,5), ou régler le collier de réglage pour qu’il corresponde à la lamelle

Références

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Collagen Elastin MicroarchitectureResistance Artery MechanicsLabel free Fluorescence MicroscopyTwo photon Excitation ImagingElastin AutofluorescenceCollagen Second Harmonic GenerationFiji Image AnalysisIlastik Software AnalysisPressure induced Vascular ChangesExtracellular Matrix Quantification

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