Dans cet article, nous discutons trois préparations de cerveau utilisées pour l’enregistrement de germes entiers patch clamp pour étudier le circuit rétino des têtards de Xenopus laevis . Chaque préparation, avec ses propres avantages spécifiques, contribue à la traçabilité expérimentale du têtard de Xenopus comme modèle pour étudier la fonction des circuits neuronaux.
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Article de méthode
Préparations et protocoles pour toute cellule Patch Clamp enregistrement des neurones Tectal Xenopus laevis
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le circuit de rétino têtard Xenopus , composé des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans le œil qui font synapses directement sur les neurones dans le tectum optique, est un modèle populaire pour l’étude des circuits neuronaux comment s’auto-assembler. La capacité à réaliser ensemble patch clamp enregistrements de neurones tectal record réponses évoquée par le CJR, soit in vivo de cellules ou en utilisant une préparation de tout le cerveau, a généré un grand nombre de données à haute résolution sur les mécanismes sous-jacents normaux et la formation des circuits anormal et la fonction. Nous décrivons ici comment effectuer la préparation in vivo , la préparation originale de tout le cerveau, et plus récemment développé préparation de tranches de cerveau horizontale pour obtenir des enregistrements de germes entiers patch clamp de neurones opposantes. Chaque préparation a des avantages uniques expérimentales. La préparation in vivo permet l’enregistrement de la réponse directe des neurones opposantes à des stimuli visuels projetés sur le œil. La préparation de tout le cerveau permet les axones RGC être activé de façon très contrôlée, et la préparation de tranches de cerveau horizontal permet l’enregistrement de travers toutes les couches du tectum.
Introduction
Le circuit de rétino est le composant principal du système visuel amphibiens. Il est composé des CGR dans l’oeil, qui projettent leurs axones vers le tectum optique où ils forment des connexions synaptiques avec les neurones post-synaptiques opposantes. Le circuit de rétino têtard Xenopus est un modèle de développement populaire pour étudier la fonction et la formation des circuits neuronaux. Il y a beaucoup d’attributs du circuit rétino de ce têtard qui rendre un puissant modèle expérimental1,2,3. Un attribut important et la mise au point du présent article, est la ....
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Wyoming. Toutes les procédures, y compris les enregistrements électrophysiologiques, sont réalisées à température ambiante, environ 23 ° C. Toutes les méthodes décrites ici sont optimisés pour l’enregistrement des neurones tectal des têtards entre le stade de développement 42 et 49 (mise en scène selon Neiuwkoop et Faber15).
1. préparation de in Vivo
- Anesthésier le têtard.
- Placer le têtard dans une petite boîte de Pétri contenant une solution de Steinberg avec 0....
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Résultats
Pour enregistrer les réponses évoquée par la lumière, un flash tout le champ de la lumière est projeté sur la rétine tandis que la réponse obtenue est enregistrée de différents neurones tectal (Figure 4A). Ce protocole particulier est conçu pour mesurer les deux la réponse du neurone à la lumière allumer (« On » réponse) et ensuite éteindre le 15 s plus tard pour mesurer la « réponse Off ». Neurones tectal pièce généralement robuste sur et en.......
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Discussion
Toutes les méthodes décrites dans cet ouvrage sont optimisés pour l’enregistrement des neurones tectal des têtards entre le stade de développement 42 et 49 (mise en scène selon Neiuwkoop et Faber15). Par étape 42, les têtards sont suffisamment vaste et suffisamment développée pour que les insectes broches peuvent être placés sur chaque côté du cerveau in vivo enregistrements et pour mener à bien la dissection du cerveau entier. Aux premiers stades, lorsque les têtards sont essentiellement.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Financée par la NIH subvention SBC COBRE 1P20GM121310-01.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 ; | Microscope de dissection |
| MS-222 « Tricane" | Finquel | ARF5G | Anesthésique général amphibie |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Utilisé pour préparer la solution de Stienberg et la solution externe |
| Chlorure de potassium (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Utilisé pour préparer la solution de Stienberg et la solution externe |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Utilisé pour préparer la solution de Stienberg et la solution externe |
| Tétrahyrate de nitrate de calcium (Ca(NO3)&bull ; 4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Utilisé pour préparer la solution de Stienberg ; ; |
| Sulfate de magnésium (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Utilisé pour préparer la solution de Steinberg |
| Chlorure de calcium (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Utilisé pour préparer une solution d’enregistrement externe |
| Chlorure de magnésium (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Utilisé pour préparer une solution d’enregistrement externe |
| D-glucose anhydre | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Utilisé pour préparer une solution d’enregistrement externe |
| Chlorhydrate de tubocurine pentahydraté | Sigma | T2379 | Antagoniste des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine Épingles |
| insectes | scientifiques fins | 26002-10 | Broches en acier inoxydable de 0,1 mm de diamètre |
| Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone | Dow Corning | 761028 | Kit monomère prépesé et agent de durcissement |
| Boîte de Petri stérile en polystyrène - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Petites boîtes de Pétri |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | Aiguilles de seringue | 1mL |
| Slip Tip Seringue à tuberculine ; | BD | 309659 | Seringues jetables et stériles |
| Pipette en verre borosilicate | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Tiré selon les spécifications souhaitées à l’aide d’une machine à tirer des pipettes |
| Extracteur de micropipettes flamboyant/brun | Sutter Instruments | P-97 | Fabrique des micropipettes pour l’enregistrement électrophysiologique |
| Kimwipes Lingettes Kimtech | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate tâche essuie-glaces non pelucheux |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Pince de courant et pince de tension Headstage |
| MP-285 Manipulateur motorisé avec contrôleur de table | Instrument de sutter | MP-285/T | Contrôle pour la tête sur le banc d’électrophysiologie |
| LED couplée à la fibre (verte) | Thorlabs | M530F2 | Câble à fibre optique associé à une LED verte |
| Électrode bipolaire en grappe (25µ ; m diamètre) | FHC | 30207 | Électrode de stimulation bipolaire |
| ISO-Flex Stimulateur | A.M.P.I. (Israël) ; | Contacter le fabricant | Isolateur de stimulus flexible |
| Axon Instruments 700B Amplificateur multipatch | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplificateur pour l’enregistrement par pince de tension et de courant ; |
| Numériseur Digidata 1322A | Molecular Devices | 2500-135 | Système d’acquisition de données pour l’enregistrement électrophysiologique |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 ; | Microscope pour l’électrophysiologie |
| Table de laboratoire Micro-g | TMC | 63-533 | Table à air pour microscope électrophysiologique |
| Ordinateur de bureau personnel Inspiron 620 avec Windows 7 Ordinateur Dell D06D001 64 bits | exécutant le logiciel d’électrophysiologie | ||
| Caméra CCD c2400 Hamamatsu | 70826-5 | Caméra à dispositif à couplage de charge pour l’imagerie électrophysiologique | |
| 7 heures Super Platinum Razorblades | en acier inoxydableLames | rasoir en acier inoxydable recouvertes de platine | Gillette CMM01049 |
| Pipettes de transfert | Fisher Scientific | 13-711-7M | Pipettes de transfert jetables en polyéthylène |
Références
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu....
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