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Article de méthode

Co transplantation de tissu ovarien humain avec des cellules endothéliales ingénieries : une combinaison de stratégie basés sur les cellules accéléré la Perfusion avec livraison directe Paracrine

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DOI :

10.3791/57472

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16 mai 2018

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1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Angiocrine Biosciences, Inc., 3Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College, 4Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Dans cet article

Résumé

Pour certains patients, la seule option pour la préservation de la fertilité est cryopréservation de tissu ovarien. Malheureusement, revascularisation tardive sape la viabilité folliculaire. Nous présentons ici un protocole co transplantation de tissu ovarien humain avec des cellules endothéliales pour utilisation comme une stratégie axée sur la cellule qui combinerait accélérée de perfusion avec une livraison directe paracrine de molécules bioactives.

Résumé

L’infertilité est un effet secondaire fréquent de la chimiothérapie et/ou radiothérapie et pour certains patients, la cryopréservation d’ovocytes ou d’embryons n’est pas une option. Comme alternative, un nombre croissant de ces patients choisissent de cryopréserver des tissus ovariens pour autogreffe après récupération et remise. Malgré des améliorations dans les résultats chez les patients subissant une auto-transplantation de tissu ovarien cryopréservé, efficace revascularisation du tissu greffé demeure un obstacle majeur. Pour atténuer l’ischémie et ainsi améliorer les résultats chez les patients qui doivent subir une auto, nous avons développé une stratégie axée sur les cellules vasculaire pour accélérer la perfusion des tissus ovariens. Nous décrivons une méthode pour la transplantation de cellules endothéliales exogènes (ExECs) Co avec tissu ovarien cryopréservé dans un modèle de xénogreffe de souris. Nous étendre cette approche à employer des ExECs qui ont été conçus pour exprimer constitutivement hormone Anti-Müller (AMH), permettant ainsi soutenue paracrine signalisation entrée aux greffes de l’ovaires. Transplantation Co avec ExECs ont augmenté de volume folliculaire et le développement de follicules antraux améliorée, et exprimant l’AMH ExECs promu rétention des follicules primordiaux quiescentes. Cette stratégie combinée peut être un outil utile pour atténuer l’ischémie et moduler l’activation folliculaire dans le contexte de la préservation de la fertilité ou de stérilité dans son ensemble.

Introduction

Le cancer demeure parmi les principales causes de décès dans le monde développé, mais des décennies de recherches ont abouti à des progrès significatifs pour la plupart des types de cancer et dans certains cas presque doublé de survie taux1. Malheureusement, les chimiothérapies sont souvent gonadotoxiques, appauvrissant la réserve de follicules primordiaux dans les ovaires et la réduction de la fertilité2. Cette croissance de la population peut bénéficier de diverses méthodes de préservation de la fertilité dont la cryopréservation d’ovocytes ou d’embryons, cependant, les patients nécessitant un lancement rapide de la thérapie contre le cancer et les patients prépubères ne sont pas admissibles pour ces options. Comme alternative, certains patients ont choisi de cryopréserver tissu ovarien avant d’entreprendre leur régime thérapeutique et sur la récupération et la rémission, auto-transplantation de tissus pour restaurer la fertilité3. Pourtant, à ce jour, survie du greffon et folliculaire sortie auto-TRANSPLATATION demeurent relativement faible4, principalement en raison de tissu ischémie et l’hypoxie5,6,7. Malgré les nombreux efforts visant à améliorer la viabilité des greffons de corticales ovariennes à l’aide des anti-oxydants8,9, pro-angiogénique cytokines10,11,12,1 3, ou des manipulations mécaniques14, ischémie greffon dans une post-transplantation de fenêtre de 5 à 7 jours sape la viabilité et la survie du greffon7. Pour y remédier, nous avons développé une stratégie de base de cellules pour faciliter l’anastomose des vaisseaux hôte et prothèse et ainsi accélérer une reperfusion de tissu ovarien.

En plus de l’accident ischémique de tissu ovarien greffé dans la fenêtre suivant la greffe, la perturbation de la signalisation inter folliculaire peut contribuer à l’appauvrissement de la piscine15,16. Car les cellules endothéliales exogènes (ExECs) contribuent à bateaux stable et fonctionnel dans la périphérie de la prothèse, ils présentent une opportunité unique de transmettre une entrée moléculaire définie au tissu transplanté. Comme une preuve de principe, ExECs ont été machinés pour niveaux express Super-physiologiques de l’hormone Anti-Müller (AMH), un membre de la superfamille de bêta (TGFβ) facteur de croissance transformant qui a été montré pour limiter la croissance folliculaire17. Comparaison de la distribution folliculaire dans les greffons transplantés conjointement avec le contrôle et les cellules exprimant l’AMH vérifie l’activité biologique et la puissance d’exECs machinés.

En résumé, en améliorant la greffe la viabilité et la suppression de mobilisation prématurée du pool de follicules, cette approche peut augmenter la productivité des tissus ovariens transplantés auto dans les patients subissant une préservation de la fertilité. De plus, la plate-forme ExEC permet interrogatoire expérimentale des régulateurs moléculaires qui ont été impliqués dans le développement folliculaire.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) au Weill Cornell Medical College. Toutes les expériences de xénotransplantation, à l’aide de tissus ovariens ont été effectuées conformément aux règlements et aux lignes directrices pertinentes. De tissu ovarien humain ont été recueilli chez des patients à la demande pour la chimiothérapie ou la radiothérapie pour le traitement du cancer ou de la transplantation de moelle épinière préalable. La Commission de révision institutionnelle (CISR) Comité du Weill Cornell Medical College a approuvé la collection de tissus pour usage autologue potentiel et après consentement éclairé du patient qu'un Don jusqu'à 10 % de leur tissu ovarien pour la recherche a été effectué.

1. collection de tissu ovarien humain

Remarque : Lorsqu’un tissu ovarien est transporté d’un transit d’installation à distance, temps ne doit pas dépasser 5 h18,19.

  1. Recueillir le tissu ovarien et rincer avec une solution saline stérile.
  2. Placez l’ovaire dans un récipient stérile.
  3. Versez le moyen L-15 de Leibovitz jusqu'à ce que l’ovaire est complètement immergé dans le milieu.
  4. Fermer et sceller le contenant.
  5. Transporter le conteneur sur la glace.

2. traitement du tissu ovarien au niveau multinational, adapté de Schmidt et al. 18

  1. Préparations pour traitement ovarien et la congélation
    1. Préparer 100 mL de milieu pour le traitement : solution antibiotique-antimycosiques de la L-15 de moyenne 99 mL + 1 mL de Leibovitz. Masses filtrantes à l’aide de 0,2 µm filtre. Garder le milieu réfrigéré.
    2. Préparer 100 mL de solution de gel à l’aide de DMSO comme un cryo-protecteur. Ajouter L-15 moyenne, 17,66 mL bovin sérum foetal de 69,64 mL Leibovitz (FBS), 3,42 g de saccharose (pour créer une concentration finale de 0,1 mol/L), 10,65 mL de DMSO (pour créer une concentration finale de 1,5 mol/L) et 1 mL de solution antibiotique-antimycosiques. Filtrer le milieu à l’aide d’une unité de filtration de 150 mL, 0,2 µm. Rangez le support à 4 ° C.
    3. Stériliser les instruments chirurgicaux à l’aide d’un autoclave programmé pour un cycle de stérilisation de solides enveloppé.
  2. À l’arrivée du tissu
    1. Définir les outils chirurgicaux stériles dans la prévention des risques biotechnologiques armoire : ciseaux scalpel avec numéro 21, de la lame bien affûtée courbée fine et pinces à diversité de tailles : long (environ 150 mm de longueur) et 2 moyennes (environ 110 mm de longueur).
    2. Porter des gants stériles, ouvrez le conteneur au sein de la biosécurité du cabinet. Prendre l’ovaire et placez-le dans un plat de Pétri de 150 mm et versez milieu froid préparé à l’étape 2.1.1 sur le dessus de l’ovaire pour prévenir la déshydratation du tissu ovarien.
    3. Isoler l’ovaire de n’importe quel tissu résiduel et le rincer à froid moyen jusqu'à ce qu’elle est dépourvue de tissus et de sang.
    4. Placer l’ovaire dans une propre 150 mm boîte de Pétri, ajouter froid moyen, préparé à l’étape 2.1.1 jusqu'à ce que l’ovaire est à moitié immergé dedans.
  3. Dissection du tissu ovarien
    1. Coupent l’ovaire et enlevez d’abord la medulla par dissection pointue, à l’aide de courbes des ciseaux. Puis gratter la zone médullaire, à l’aide d’un scalpel stérile avec un nombre de lame 21. Précèdent jusqu'à ce que le tissu cortical est de 1 à 1,5 mm d’épaisseur.
    2. Couper le tissu cortical en lamelles de 2-3 mm de largeur, la longueur de la bande sera toute la longueur de la pièce ovarienne qui a été traitée.

3. ovaire tissu congélation lente, adapté de Newton et al. et Oktay et al. 6 , 20

  1. Préparation pour la congélation
    1. Cryovials étiquette (1,8 mL).
    2. Ajouter 1,5 mL de la solution de congélation préparée à l’étape 2.1.2 dans chaque flacon.
    3. Transférer une bande corticale par cryogénique flacon contenant la solution de congélation.
    4. Equilibrez la bande corticale pendant 20 min sur un plateau tournant, s’appliquent à une agitation modérée à 4 ° C.
  2. Congélation lente de tissu ovarien
    1. Charger le cryovials dans un congélateur de raboteuse programmable à partir de 0 ° C.
    2. Refroidir à 2 ° C/min jusqu'à-7 ° C.
    3. Garder les tissus à cette température constante pendant 10 min.
    4. Effectuer un semis manuel pour l’induction nucléation de glace cristalline, en touchant chaque cryovial avec un bout de coton plongé dans l’azote liquide (LN2).
    5. Continuer à refroidir à 0,3 ° C/min jusqu'à ce que la température de l’échantillon atteint-40 ° C.
    6. Refroidir à un rythme plus rapide de 10 ° C/min jusqu'à-140 ° C.
    7. Transfert de cryovials à la dewar pour entreposage à LN2 (-196 ° C).

4. les préparations pour les chirurgies (ovariectomie bilatérale et transplantation Co)

  1. Préparation des plaques
    1. Un jour avant le dégel du tissu ovarien à la transplantation
      1. Placez un morceau d’un film de paraffine en plastique au fond d’un plat de Pétri de 50 mm, vaporisez-le avec 70 % éthanol jusqu'à ce qu’il sera complètement couvert.
      2. Laisser les boîtes de Pétri avec une nuit dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Préparer 2 boîtes de Pétri par la souris.
    2. Lors de la journée d’interventions chirurgicales
      1. Aspirer l’éthanol à partir de la boîte de Pétri contenant le film de paraffine en plastique dans l’armoire de biosécurité.
      2. Laisser la tête de la boîte de Pétri moitié ouverte jusqu'à ce que l’éthanol s’évapore complètement.
      3. Fermer le couvercle de la boîte de Pétri lorsque le film plastique paraffine est complètement sèche. Gardez-le dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
      4. Puits de l’étiquette d’un 6 plaque bien en conséquence, 0,1 mol/L de saccharose + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L saccharose + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L de saccharose, Solution base de dégel (BTS), moyen.
  2. Préparation des solutions
    1. Préparation de 100 mL de BTS : L-15 de Leibovitz moyenne 79 mL + BF 20 mL de solution antibiotique-antimycosiques 1 mL. Filtrer avec un système de filtre de 0,22 µm.
    2. Préparer 10 mL de BTS à 0,1 mol/L de saccharose. Échelle de 0,342 g de saccharose et ajouter 10 mL de BTS préparé à l’étape 4.2.1, agiter doucement jusqu'à dissolution complète de la saccharose. Filtrer la solution à l’aide d’une seringue filtre 0,22 µm.
    3. Préparer les solutions selon le tableau 1. Couvrir les tubes contenant le DMSO avec du papier aluminium. Conserver au réfrigérateur jusqu'à l’utilisation.

5. ovaire tissu décongélation rapide

  1. Sortez le LN2 dewar un flacon contenant congelé de tissu ovarien et gardez-le à température ambiante pendant 30 s.
  2. Essuyez le flacon à l’aide d’un papier de soie.
  3. Plonger le flacon dans un bain d’eau de 30 ° C pendant 1-2 min jusqu'à ce que son « contenu est décongelé.
  4. Ouvrir le flacon et placez une bande corticale dans le premier puits qui contient 3ml de la solution première (0,1 mol/L DMSO, préparé à l’étape 4.2.3 de saccharose + 1 mol/L).
    Remarque : Toutes les étapes impliquant l’ouverture du couvercle de la plaque seront fera sous hotte à flux laminaire.
  5. Incuber la plaque 6 puits sur un plateau tournant à 4 ° C pendant 5 min. Gardez la plaque couverte avec du papier aluminium pour cette étape.
  6. Transvaser la bande corticale dans le deuxième bien contenant 3 mL de la deuxième solution (0,1 mol/L saccharose + 0,5 mol/L DMSO, préparé à l’étape 4.2.3).
  7. Incuber la plaque 6 puits sur un plateau tournant pour agitation modérée à 4 ° C pendant 5 min. Gardez la plaque couverte avec du papier aluminium pour cette étape.
  8. Transvaser la bande corticale dans le troisième puits, contenant 4 mL de solution (BTS avec 0,1 mol/L de Sucrose, préparé à l’étape 4.2.2).
  9. Incuber sur un plateau tournant pour agitation modérée à 4 ° C pendant 5 min.
  10. Transvaser la bande corticale dans le quatrième bien contenant 4 mL de solution (BTS, préparé à l’étape 4.2.1).
  11. Incuber sur un plateau tournant pour agitation modérée à 4 ° C pendant 5 min.
  12. Transvaser la bande corticale dans le dernier bien contenant 4 mL de milieu froid (préparé à l’étape 2.1.1). Conservez les tissus ovariens décongelés sur la glace jusqu'à effectuer la transplantation.

6. encapsulation du tissu ovarien

  1. Préparer les solutions suivantes
    1. Préparer 25 mL d’un tampon HEPES 20 mmol/L en solution saline à 0,9 %. Filtrer et conserver à 4 ° C.
    2. 1 mL de CaCl2 à une concentration de 1 mol/L. filtre de préparer et de conserver à 4 ° C.
  2. Préparer une solution fibrinogène 50 mg/mL
    1. Ajouter 1 g de fibrinogène dans 20 mL d’un tampon HEPES 20 mmol/L dans une solution saline en mélangeant lentement fibrinogène dans l’HEPES 0,9 % solution saline tamponnée pendant plusieurs heures à 37 ° C.
    2. L’étiquette de 1,7 mL tubes à centrifuger-micro.
    3. Filtrer la solution à travers un filtre de seringue de 0,45 µm, puis à travers un filtre de seringue 0,2 µm.
    4. Partie aliquote de la solution dans 200 µL de tube à centrifuger-micro et conserver à-20 ° C.
  3. Préparer une solution thrombine 100 U/mL
    NOTE : Solutions de thrombine s’adsorber sur les verre, aliquote de la solution dans les tubes/fioles en plastique.
    1. Ajouter 2,5 mL de sérum physiologique 0,9 % à 250 U de la thrombine.
    2. Secouer doucement jusqu'à ce que la solution pour dissoudre complètement.
    3. L’étiquette de 1,7 mL tubes à centrifuger-micro.
    4. Filtrer à travers un filtre de seringue 0,2 µm, aliquote 50 µL dans les tubes à centrifuger-micro et conserver à-80 ° C.
  4. Faire un caillot de fibrine 70 µl, obtenir une concentration finale de 10 mg/mL fibrinogène et de thrombine de U/mL 5
    Remarque : Veillez à travailler vite, les caillots de la solution en quelques secondes. Aussi, éviter l’ajout de bulles dans le mélange.
    1. Préparer une solution de fibrinogène dans un tube à centrifuger-micro 1,7 mL.
      1. Ajouter 360 µL de 20 mmol/L HEPES tampon à 0,9 % solution saline à l’aliquotés 200 µL de la crosse de fibrinogène, préparé à l’étape 6.2.4.
      2. La composition de pipetage doux.
      3. Gardez-le sur la glace.
    2. Préparer une solution de thrombine dans un deuxième tube micro-centrifuge.
      1. Ajouter 148,7 µL de DMEM dans l’aliquotés 50 µL de la crosse de la thrombine, préparées à l’étape 6.3.4.
      2. La composition de pipetage doux.
      3. Ajouter 1,3 µL de 1 mol/L CaCl2.
      4. La composition de pipetage doux.
      5. Gardez-le sur la glace.
    3. Préparer une suspension monocellulaire, dans un troisième tube micro-centrifuge.
      1. Détacher les cellules endothéliales machinés de la plaque à l’aide d’un milieu de détachement enzyme cellulaire.
      2. Tournez en bas l’et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre avec un couvercle en verre.
      3. Utilisez 20 000 cellules par tous de 1 mm2 de tissu ovarien. Calculez 20 000 x surface de tissu ovarien en mm2.
      4. Tournez en bas les cellules endothéliales machinés et remettre en suspension il en milieu basique (DMEM) pour atteindre un volume total de 16,8 µL.
      5. Gardez-le sur la glace.
    4. Placez un morceau de tissu ovarien sur un tampon de gaze stérile afin de sécher pendant quelques secondes.
    5. Placez le morceau de tissu ovarien sur le dessus le film plastique paraffine dans la boîte de Pétri de 50 mm.
    6. Ajouter 39,2 µL de la solution de fibrinogène, préparée à l’étape 6.4.1.2, dans la suspension de cellules préparée à l’étape 6.4.3.4, mélange de pipetage doux. Gardez-le sur la glace.
    7. Ajouter 14 µL de la solution de thrombine préparée à l’étape 6.4.2.4. Mélanger doucement en pipettant également, une fois. Travail rapide.
    8. Placez le mélange sur le dessus du tissu ovarien, pipette sous la forme d’une goutte allongée.
    9. Placez la boîte de Pétri avec le caillot dans l’incubateur à 37 ° C.

7. bilatéraux ovariectomie et co transplantation de tissu ovarien humain avec des cellules endothéliales machinés, à NSG souris

NOTE : Dix à quatorze semaines femelle NSG souris21 ont été utilisés (Jackson Labs).

  1. Préparer des outils tout chirurgicales, comme défini à l’étape 2.1.3, assurez-vous de qu'avoir toutes les sutures, plaquettes et rubans chirurgicaux très pratiques.
  2. Anesthésier la souris à l’aide d’un système d’anesthésie à l’Isoflurane.
    1. Placez votre souris dans la chambre de l’induction, fermer le couvercle et ouvrir le robinet approprié.
    2. Débitmètre ouverte à 1 000 mL/min. Allumez le vaporisateur et réglez-le pour livrer 2 à 3,5 %.
    3. Observer les effets de l’anesthésie ; perte de conscience, lente et régulières respirations.
    4. Transfert vers le cône de nez pour maintenir l’anesthésie. Tourner le vaporisateur pour offrir de 1 à 3 %, selon les signes vitaux.
    5. Vérifier l’absence de réflexe de pédale ou queue. Si le réflexe est présent, augmenter l’isoflurane jusqu'à ce qu’il est absent.
  3. Couper les cheveux en arrière de la souris, depuis la queue jusqu'à la ligne des clavicules, à l’aide d’une tondeuse à cheveux électrique.
  4. Placez votre souris dans une position couchée sur la plate-forme chirurgicale.
  5. Difficulté du cône de nez à la plate-forme chirurgicale à l’aide d’un ruban chirurgical.
  6. Bande des membres de la souris doucement vers la plate-forme chirurgicale à l’aide d’un ruban perforé chirurgicale de 1,25 cm de large.
  7. Utilisez une gelée lubrifiante stérile et insérer un thermomètre PR. Fix le thermomètre par du ruban adhésif il à la plate-forme chirurgicale à l’aide d’un ruban chirurgical en plastique de 1,25 cm de large perforé.
  8. Tape la queue à la plate-forme chirurgicale à l’aide d’un ruban chirurgical large de 2,5 cm.
  9. Chaleur, à l’aide d’un infrarouge ou un coussin, chauffant l’eau chaude et surveiller la température du corps de la souris tout au long de la procédure. Maintenir la température du corps dans la plage de 35-37 ° C.
  10. Nettoyer la zone rognée avec un coton-tige stérile de Solution de Povidone-iode et essuyer à l’aide de préparation d’alcool stérile.
  11. Répétez l’étape deux fois plus de 6,9.
  12. Déposer une goutte de pommade vétérinaire Lubrifiant oculaire stérile sur chacun des yeux de la souris pour protéger de la déshydratation et les dommages à la cornée.
  13. Couvrir la souris à l’aide d’un drap stérile chirurgical.
  14. Injecter la buprénorphine (1 mg/Kg) sous-cutanée (S/C).
  15. Effectuer une incision dorsale médiale longitudinale à l’aide d’un scalpel (lame #21).
  16. Effectuer une ovariectomie bilatérale, utiliser une approche dorsale.
    1. Libérer le tissu conjonctif sous-cutané par dissection par clivage à l’aide des ciseaux.
    2. Pincez le fascia latéralement pour la marque de la ligne médiane une incision et atteindre la cavité péritonéale à l’aide des ciseaux pointus.
    3. Prenez la grosse garniture ovarien et l’ovaire doucement avec des pincettes et tirez-la hors de la cavité abdominale.
    4. Saisir l’ovaire et les coussinets adipeux avec une pince vasculaire.
    5. Ligaturer l’ovaire et la garniture à l’aide d’une suture résorbable de monofilament de 4/0 à la base de l’ovaire, distale de la trompe de Fallope.
    6. Clip l’ovaire distale à la cravate. Assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement de la base du moignon.
    7. Replacez le tissu intérieur de la cavité abdominale et la suture de l’aponévrose à l’aide d’une suture résorbable tressée 6/0.
    8. Répétez les étapes 7.15.1-7.15.7 sur le côté controlatéral.
  17. Conjointement une transplantation du tissu ovarien.
    1. Effectuer une incision horizontale dans le fascia ci-dessus le Gluteus Maximus, à la longueur qui correspond à la dimension de la formation de caillots. Créer une poche au sein de cet espace virtuel en ouvrant les ciseaux sous le fascia.
    2. Ramasser un morceau de tissu cortical encapsulé, tel qu’établi à l’étape 6.4.8 et placez-le dans cette poche.
    3. Suture de l’aponévrose avec un 6/0 tressé résorbable.
  18. Répétez les étapes 7.16.1-7.16.3 sur le côté controlatéral ainsi.
  19. Proche de la paroi dorsale à l’aide de points interrompus simples avec une suture résorbable de monofilament de 4/0.
  20. Injection de lidocaïne 0,5 % (1,2 mL/Kg) S/C sur le site d’incision.
  21. Utilisez une préparation d’alcool stérile pour nettoyer la peau.
  22. Désactiver l’isoflurane tout en contrôlant la température de la souris.
  23. Prévoir 1-2 min d’O2, sans l’Isoflurane. Garder le réchauffement sur la souris jusqu'à ce qu’il commence à se déplacer et de retour à la conscience.
  24. Placez la souris dans une cage propre rétablissement et plus tard la maison la souris dans une cage séparée jusqu'à la guérison complète de la plaie opératoire.
  25. Injecter la buprénorphine (1 mg/Kg) S/C au besoin toutes les 8-12 h, 24 h après l’opération.
  26. Gardez les souris dans des cages séparées lorsque tous les aliments, eau, literie et cages sont stérilisés à l’autoclave, jusqu’au point de fin de l’expérience. Garder les cages dans une pièce aérée et sous pression. Utiliser les équipements de protection individuelle toute manipulation des souris.

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Résultats

Pour déterminer si la transplantation Co de ExECs fournit un avantage pour les tissus malades, bandes corticales ovariennes décongelés ont été divisés en morceaux de taille égale et implantés bilatéral en immuno-déprimées, de gamma NOD scid (NSG), souris. Avec un côté intégré dans un seul caillot de fibrine (aucun ECs) et les autres ExECs contenant (Figure 1 a), chaque souris a servi son propre témoin. ExECs ont été obtenus par l’isolement de l’endothélium pr...

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Discussion

Nous démontrons que co transplantation d’exECs fournit un avantage important pour la viabilité des tissus ovariens et fonction après xénogreffe chez la souris. Normes relatives à l’application clinique des auto-transplantation de tissu ovarien pour la préservation de la fertilité n’ont pas été ensemble et les paramètres optimaux (taille, site de transplantation, durée de la prothèse, etc.) 32 , 33 , 34 pour la récupérat...

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Déclarations de divulgation

Michael Ginsberg est un employé de Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, aux États-Unis, qui isolé, transfectées avec E4-ORF-1 et étiqueté les cellules endothéliales, que nous avons utilisé.

Remerciements

Omar Alexander Man pour les illustrations.
L.M. a été soutenue par une bourse de pilote de la clinique de Cornell et de subvention de recherche translationnelle Science Center et l’ASRM.
Les auteurs tiennent à remercier James lab membres pour une lecture critique du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Leibovitz' s L-15 moyenGibco11415064
Antibiotique-antimycosiqueGibco15240062Anti-Anti X100
SaccharoseSigmaS 1888
FibrinogèneSigmaF 8630à partir de plasma bovin
ThrombineSigmaT 1063à partir de plasma humain
DMSOSigmaD 2650
DMEMGibco12491015
Enzyme Détachement cellulaire MilieuInvitrogen00-4555-56Accutase
Film de paraffine plastiqueBemis NAParafilm M
Ruban de papier chirurgical 2,5 cm3M1530-1Micropore
Ruban de papier chirurgical 1,25 cm3M1530-0Micropore
Plastique perforé Ruban chirurgical 1,25 cm3M1527-0Transpore
Monofilament Suture RésorbableCovidienUM-203Biosyn
Suture RésorbableTressée CovidienGL-889Polysorb
Povidone-iode Solution USP 10 %Purdue Products67618-153-01Bétadine Solution Écouvillon
CryovialesNunc377267CryoTube
stérile oculaire lubrifiantDechra17033-211-38Puralube
1,7 ml micro-centrifugeuse tubeDenvilleC-2172Eppendorf
Système d’anesthésieVetEquipV-1 système de table avec balayage
Cellules endothélialesAngiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USAIsolé, transfecté avec E4-ORF-1 et cellules endothéliales marquées
Coloration trichromeSigmaHT15-1ktColoration Trichrome (Masson)
Kit IsolectineInvitrogenI32450ISOLECTINE GS-IB4 De Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&trade ; 647 Conjugué

Références

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