Article de méthode

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

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DOI :

10.3791/57476

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5 septembre 2018

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1Oncology Drug Discovery: Molecular Pharmacology, Novartis Institutes for Biomedical Research, 2Chemical Biology and Therapeutics, Novartis Institutes for Biomedical Research

Dans cet article

Résumé

Dans un grand éventail d’indications de la maladie, les modèles plus physiologiquement pertinents soient développés et mis en œuvre dans les programmes de recherche. Le nouveau système de modèle décrit ici montre comment tridimensionnelle tumeur sphéroïdes peuvent être cultivées et diffusés dans un système d’axée sur la plaque du haut débit 1536 puits pour chercher de nouveaux médicaments anticancéreux.

Résumé

Les cellules cancéreuses ont systématiquement été cultivés en deux dimensions (2D) sur une surface en plastique. Cette technique, cependant, n’a pas le vrai environnement une tumeur masse affleure à in vivo. Tumeurs solides poussent non pas comme une feuille jointe au plastique, mais plutôt comme un ensemble de cellules clonales dans un en trois dimensions (3D) espace interagissant avec leurs voisins et avec des propriétés spatiales distinctes telles que l’interruption de la polarité cellulaire normale. Ces interactions provoquent des cellules cultivées en 3D à acquérir des caractéristiques morphologiques et cellulaires qui sont plus pertinentes pour les tumeurs in vivo . En outre, une tumeur masse est en contact direct avec les autres types de cellules comme les cellules stromales et immunitaires, ainsi que la matrice extracellulaire de tous les autres types de cellules. La matrice déposée est constituée de macromolécules biologiques, comme le collagène et la fibronectine.

Dans le but d’augmenter la traduction des résultats de la recherche en cancérologie de banc au chevet du patient, de nombreux groupes ont commencé à enquêter sur l’utilisation de systèmes de modèles 3D dans leurs stratégies de développement de médicaments. Ces systèmes sont censés être plus physiologiquement pertinentes car elles tentent de récapituler l’environnement complexe et hétérogène d’une tumeur. Ces systèmes, cependant, peuvent être assez complexes, et, bien que favorable à la croissance de formats de 96 puits et d’autres maintenant même en 384, ils offrent peu de choix pour la croissance à grande échelle et de dépistage. Cette observée écart a conduit à l’élaboration des méthodes décrites ici en détail de sphéroïdes de tumeur de la culture dans une capacité de haut débit en plaques 1536 puits. Ces méthodes représentent un compromis aux systèmes de matrice-basé très complexes, difficiles à l’écran et des essais 2D classiques. Une variété de lignées de cellules cancéreuses hébergeant des mutations génétiques différentes sont retenus et menée, en examinant l’efficacité composée en utilisant une bibliothèque organisée des composés ciblant la voie Mitogen-Activated protéine Kinase ou MAPK. Les réponses de culture sphéroïde sont ensuite comparées à la réponse des cellules cultivées en 2D, et activités différentielles sont signalées. Ces méthodes fournissent un protocole unique pour tester l’activité composée dans un cadre 3D haut débit.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, de plus en plus des études ont mis en place l’utilisation de modèles de culture de cellules 3D de comprendre les concepts qui ne sont pas entièrement récapitulées en cultivant des cellules en 2D sur plastique. Exemples de ces concepts incluent les alternances dans les cellules épithéliales normales polarité1 où l’orientation spatiale de couches basales et apicales des cellules sont perdus, ainsi que le rôle de la matrice extracellulaire dans la régulation de la survie et le sort de la cellule. Recherche en oncologie, en particulier, utilise des modèles 3D pour comprendre la biologie fondamentale des cellules cancéreuses et les différences entre 2D et 3D cell culture systèmes3,4. Le développement des techniques de culture cellulaire plus sophistiqués et leur adaptation supplémentaire aux formats multipuits a permis à la recherche de nouveaux médicaments dans paramètres 3D. Contrairement aux cellules cultivées dans des conditions 2D, des modèles 3D de la gamme de tumeurs dans la complexité de systèmes cellulaires en couches5 de type single-cell sphères de différentes tailles, complexe multi-cell-type sphères6,7, 8. la découverte de nouveaux composés ou un agent biologique qui puissamment induire la mort cellulaire dans ces systèmes de modèle 3D est, par conséquent, d’un grand intérêt dans les campagnes de développement de médicaments. Points de terminaison de ces tests sont souvent identiques à celles exercées dans les cultures 2D pour évaluer les changements dans la prolifération cellulaire, mais lorsque menées dans un cadre plus physiologiquement pertinent, ils peuvent révéler le véritable niveau de dépendance du gène cible ou en voie interrogé.

Tel que présenté ci-dessus, une variété de systèmes modèles ont été développés pour étudier les réponses de drogue dans des systèmes de culture 3D, mais la plupart utilise deux microplaques 96 ou 384 puits et n’est pas facilement adaptable aux formats haut débit (HTS) de dépistage souvent utilisés dans les campagnes de dépistage de découverte de médicaments. Ces systèmes comprennent l’utilisation d’accrocher technologies gouttelette, cultures de sphéroïde, pulsant de cellules avec des particules magnétiques pour induire la lévitation et les cultures, incorporant des gels naturels ou synthétiques comme le collagène, Matrigel ou polyéthylène glycol (PEG)2 . Nous présentons ici les méthodes détaillées d’une technique déjà développée pour produire des cultures de sphéroïde 3D provenant de lignées cellulaires établies du cancer dans un format de plaque 1536 puits. Dans le présent protocole, un milieu très défini est utilisé qui empêche la fixation des lignées de cellules adhérentes normalement9. Ce système a des limites (par exemple, il ne peut pas récapituler complètement un système complexe modèle de cancer), mais néanmoins, ces tests permettent un criblage à haut débit de grandes collections de petites molécules et des comparaisons en travers de la réaction aux médicaments entre 2D et 3D des cultures contre une variété de lignées cellulaires et composés.

Les lignées de cellules sélectionnées afin de démontrer les méthodes dans cet article toutes les mutations dans les gènes associés à la signalisation de voie, une voie qui est hautement dysrégulation dans le cancer, MAPK harbor et pour les thérapies dont beaucoup sont disponibles. Beaucoup de lignes ont activation d’oncogènes mutations du virus Kirsten Rat Sarcoma, également dénommé KRAS, le RAS de neuroblastome ou ARN, l’oncogène virus de sarcome de Rat Harvey ou HRAS et les kinases associées rapidement accéléré fibrosarcomes, également connu sous le nom Fra. La littérature récente suggère que les inhibiteurs des différents nœuds de cette voie sont particulièrement bien plus efficaces pour un sous-ensemble des lignées cellulaires lorsqu’il est cultivé sous des conditions 3D9,10. Une étude a révélé que lorsque les cellules cancéreuses avec RAS active ont été cultivées en 3D, ils ont démontré une sensibilité accrue aux inhibiteurs de la MAPK et en outre, que cette approche pourrait identifier les voies et ciblé des inhibiteurs qui pourraient manquer dans le 2D traditionnelle réglage. L’objectif de cette étude est de présenter les méthodes utilisées pour la culture de ces lignées cellulaires, et plus, pour démontrer la différence de réponses à ces inhibiteurs que l'on peut observer seulement en utilisant 3D cell systèmes de culture.

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Protocole

1. mise en culture des sphéroïdes tumeur 1536 puits 3D

  1. Préparer une tige moyenne frais 3D tumeur sphéroïde (milieu cellulaire + remplacement de sérum knockout + insuline-transferrine-sélénium) en ajoutant les réactifs suivants dans 500 mL de milieu d’Eagles modifié de Dulbecco (DMEM/F12) : 1 x pénicilline/streptomycine, 10 ng/mL de l’homme facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), 20 ng/mL d’humain facteur croissance épidermique (EGF), 0,4 % d’albumine sérique bovine (BSA) (Fraction V), 1 x insuline-transferrine-sélénium et le remplacement de sérum 1 % knockout (KO) (ne pas de gel-dégel).
  2. Filtre-stériliser le milieu ensemble avec les suppléments grâce à un système de filtre bouteille-top 0,4 µm.
  3. Détacher les lignées de cellules cancéreuses, qui ont augmenté selon des conditions de culture courante recommandée, des flacons de culture cellulaire traditionnelle en les lavant 3 x avec phosphate 1 x tampon salin (PBS) et en ajoutant une quantité appropriée de 0,25 % de trypsine (1 mL par 5 cm2) pendant 5 min créer une fine couche sur les cellules. Neutraliser la trypsine avec 5 fois le montant du milieu contenant du sérum et continuer à compter les cellules non vides. Par exemple, utilisez 25 mL de milieu pour 5 mL de la trypsine.
  4. Ajuster la concentration de la solution de la cellule à 62,5 x 104 cellules/mL pour un total de 500 cellules / puits dans 8 µL de milieu de sphéroïde de graines dans les plaques 1536 puits de tissu-culture-traitée.
  5. Dans une armoire de sécurité biologique, les cellules à l’aide d’une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite avec un système de pompe péristaltique dotés de graines. Entre différentes lignées cellulaires, rincer la tubulure de la cassette avec 1 x PBS et 70 % éthanol pendant 10 s.
  6. Par ailleurs, les semences les cellules à l’aide d’un gestionnaire liquid situé à l’intérieur d’une pièce de filtre HEPA en utilisant soit une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite et une pompe péristaltique ou une pompe à seringue jointe, selon le nombre de plaques par une lignée de cellules nécessaires.
  7. Sceller les plaques en utilisant un joint de plaque adhésive respirante soit manuellement ou à l’aide d’un adhésif.
  8. Placer les plaques dans un incubateur à rotation fixée à 10 tr/min et 37 ° C, avec 5 % de dioxyde de carbone (CO2) et 95 % d’humidité relative. Laissez les sphéroïdes à se former pendant 3 jours.

2. mise en culture de lignées cancéreuses 1536 puits 2D

NOTE : Les lignes de cancer 2D 1536 puits doivent être cultivées 24h avant l’ajout du composé aux plaques 3D.

  1. Préparer un support de cellule de cancer 2D en ajoutant les réactifs suivants à 500 mL d’un milieu de culture approprié pour les lignes sélectionnées : 1 x sérum bovin fœtal (SVF) pénicilline/streptomycine et 10 %.
  2. Filtre-stériliser le milieu ensemble avec les suppléments grâce à un système de filtre bouteille-top 0,4 µm.
  3. Détacher les lignées de cellules cancéreuses, qui ont augmenté selon des conditions de culture courante recommandée, des flacons de culture cellulaire traditionnelle en les lavant 3 x avec 1 x PBS et en ajoutant une quantité appropriée de 0,25 % de trypsine (1 mL par 5 cm2) pendant 5 min à créer une couche mince sur les cellules. Neutraliser la trypsine avec 5 fois le montant du milieu contenant du sérum et continuer à compter les cellules non vides. Par exemple, utilisez 25 mL de milieu pour 5 mL de la trypsine.
  4. Ajuster la concentration de la solution de la cellule à 62,5 x 104 cellules/mL pour un total de 500 cellules / puits dans 8 µL de milieu complet de graines dans les plaques 1536 puits tissu-culture-traitées.
  5. Dans une armoire de sécurité biologique, les cellules à l’aide d’une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite avec un système de pompe péristaltique dotés de graines. Entre les différentes lignées cellulaires, rincer la tubulure de la cassette avec 1 x PBS stérile et de 70 % éthanol pendant 10 s.
  6. Par ailleurs, amorcer les cellules à l’aide d’un gestionnaire liquid situé à l’intérieur d’une pièce de filtre HEPA robotique utilisant une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite et une pompe péristaltique ou le pousse-seringue jointe, selon le volume des plaques par cellule ligne nécessaire.
  7. Sceller les plaques en utilisant un joint de plaque adhésive respirante soit manuellement ou à l’aide d’un adhésif.
  8. Placer les plaques dans un incubateur à rotation fixée à 10 tr/min et 37 ° C pendant 24 h avant l’addition de composé, avec 5 % CO2 et 95 % d’humidité relative.

3. composé d’Addition

  1. Préparer des dilutions de 8 points, 3 fois la série des inhibiteurs de la MAPK à 100 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) sur un robot de gestion liquide avec une concentration supérieure de 10 mM. L’inhibiteur du protéasome bortézomib est utilisé comme témoin positif pour une cellule complète tuant pour déterminer la plage dynamique du dosage.
  2. Rapide-spin tout dosage plaques et composé à 100 g pour recueillir toute condensation. Retirer le joint adhésif de chaque plaque et placer une plaque sur une installation de distributeur acoustique pour ajouter un total de 8 nL de chaque composé/dilution, ce qui représente une concentration finale de 0,1 % DMSO / puits et une dose supérieure composée de 10 µM.
  3. Après que l’ajout du composé est terminée, placer un couvercle de culture cellulaire sur mesure, en acier inoxydable qui empêche l’évaporation sur la plaque et place la plaque dans un incubateur de filature à 37 ° C pendant 5 jours, avec 5 % CO2 et 95 % d’humidité relative.

4. Ajout de réactif détection et l’acquisition des données brutes

  1. Préchauffer un volume suffisant d’un réactif de lyse cellulaire contenant la luciférine pour détecter les variations triphosphate de l’adénine (ATP) et, par conséquent, la prolifération des cellules à température ambiante ou dans un bain-marie à 37 ° C. Ajouter un total de 3 µL de réactif de détection à chaque puits à l’aide d’une pompe péristaltique et incuber la plaque à température ambiante pendant au moins 15 min.
  2. Capturer la luminescence sur un luminomètre plaque.

5. traitement des données

  1. Extraire les données brutes de l’instrument et normaliser tous les champs contenant des composés d’essai à la moyenne de tous les puits contenant DMSO seul comme le contrôle neutre. Calculer à partir de cette valeur, l’inhibition de la croissance pour cent de chaque composé. C’est terminé à l’aide de la formule fonction dans Microsoft Excel où f (x) = {(échantillon valeur relative unités légères (RLUs) / (valeur de DMSO RLUs en moyenne) * 100)}.
  2. Générer les courbes dose-réponse et l’inhibiteur IC50s en traçant la courbe des valeurs des données normalisées de l’étape 5.1 contre la concentration de composés à l’aide d’un programme graphique.
    NOTE : Nous avons analysé les données à l’aide de Helios, un outil de logiciel NIBR interne. Pour compléter cette fonction, nous avons sélectionné l’outil d’analyse de courbe non-paramétrique.

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Résultats

Une variété de cellule de cancer établis lignées qui poussent bien dans des conditions de culture 2D ont été testées en utilisant les méthodes décrites ici. Des images représentatives d’une variété de cancer mutant MAPK lignées cellulaires (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS et KNS-62:HRAS) sont visibles dans la Figure 1. Ces images montrent que bien que les lignées cellulaires ont des morphologies différentes, chacun formé des structures 3D des plaq...

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Discussion

Les méthodes présentées ici montrent un protocole détaillé sur la façon de produire des sphéroïdes de tumeur en plaques 1536 puits pour projections composées à grande échelle. Ces méthodes ont été initialement adaptés au travail à l’Institut National du Cancer où sphéroïdes de tumeur ont été cultivées dans des essais de faible débit dans des plaques 6 puits et 96 puits à poser des questions sur la génétiques dépendances et sensibilité composé13, 14 , <...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs sont des employés de Novartis, et certains employés sont également actionnaires.

Remerciements

Les auteurs aimerait Marc Ferrer au Centre National pour faire progresser les Sciences translationnelle, National Institutes of Health pour son soutien et ses conseils sur le développement initial de ces tests. En outre, nous tenons à remercier Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling et Vesselina Cooke pour leur apport scientifique et de la discussion que les membres de l’équipe du projet.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
forts
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)/F12ATCC30-2006Acheté en tant que solution préparée. Cette recette s’est avérée préférée par rapport à d’autres fournisseurs.
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)/F12Lonza12-604FAcheté en tant que solution préparée.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Lonza12-115QAcheté en tant que solution préparée.
Sérum fœtal bovin (FBS)Seradigm1500-500Acheté comme solution préparée.
1x 0,25 % de trypsine avec acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)HycloneSH30042.01Acheté sous forme de solution préparée.
1x Pénicilline/StreptomycineGibco15140Acheté comme solution préparée.
10 ng/mL Facteur de croissance fibrobère humain basique (bFGF)SigmaF0291Remettre en suspension dans de l’eau stérile.
20 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain (EGF)SigmaE9644Resuspension dans de l’eau stérile.
0,4 % d’albumine sérique bovine (BSA)SigmaA9418Remettre en suspension dans du PBS stérile et un filtre.
1x Insuline Transferrine Sélénium (ITS)Gibco51500056
1 % KnockOut (KO) Remplacement du sérumGibco10828-028Ajouter frais juste avant utilisation.
100 % Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma276855-100ML
CellTiter-GloPromegaG7573Acheté comme solution préparée.
Consommables
Small Combi CassetteThermoFisher24073295
Small Multiflow CassetteBioTek294085
1536 puits (blanc)Corning3727
Plaques TC stériles 1536 puits (noir)Corning3893
Scivax PlaquesMBL InternationalNCP-LH384-10
Equipment
AdhesivesThermoFisherAB0718
Incubateur rotatifLiCONiC
Couvercles en acier inoxydableInstitut de génomique de la Fondation de recherche Novartis (GNF)
Dispensateur acoustiqueATS EDS Biosystems
Echo Acoustic DispensorLabcyte
LuminometerEnvision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop CombiThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FXBioTek
joints

Références

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Mots-clés

Criblage haut d bitplaques de 1536 puitsculture cellulaire 3Dlign es cellulaires canc reusesvoie MAPKincubateur rotatifdistributeur acoustiqueluminescence ATP

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