Article de méthode

Quantification de la croissance à l’intérieur de Macrophages intracellulaire est un rapide et une méthode fiable pour évaluer la Virulence de Leishmania

DOI :

10.3791/57486

⸱

16 mars 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

Dans cet article

Résumé

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Toutes les espèces pathogènes de Leishmania résident et répliquent à l’intérieur de macrophages de leurs hôtes vertébrés. Nous présentons ici un protocole pour infecter les macrophages dérivés de la moelle osseuse souris dans la culture avec la Leishmania, suivie d’une quantification précise de la cinétique de croissance intracellulaire. Cette méthode est utile pour l’étude des facteurs individuels qui influencent l’interaction hôte-pathogène et la virulence de Leishmania .

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cycle de vie de Leishmania, l’agent causal de la leishmaniose, alterne entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et vertébrés hôtes, respectivement. Alors que les symptômes pathogènes de la leishmaniose peuvent varier considérablement, de lésions cutanées bénignes aux formes hautement mortelle maladie viscérale selon l’espèce infectieux, toutes les espèces de Leishmania résident à l’intérieur de macrophages de l’hôte pendant l’étape de vertébrés du leur cycle de vie. Leishmania infectiosité est donc directement liée à sa capacité à envahir, de survivre et de répliquer dans les vacuoles parasitophore (PVs) à l’intérieur des macrophages. Ainsi, évaluer la capacité du parasite à répliquer intracellulairement sert une méthode fiable pour déterminer la virulence. Étudier le développement de la leishmaniose à l’aide de modèles animaux est long, fastidieux et souvent difficile, en particulier avec les formes viscérales rôle importants. Nous décrivons ici une méthodologie pour suivre le développement intracellulaire de Leishmania dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs). Nombre de parasites intracellulaires est déterminés à intervalles de 24 h pour 72-96 h après l’infection. Cette méthode permet une détermination fiable des effets de divers facteurs génétiques sur la virulence de Leishmania . À titre d’exemple, nous montrons comment une délétion seul allèle du gène Mitochondrial transporteur de fer Leishmania (LMIT1) porte atteinte à la capacité de la souche mutante de Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 à pousser à l’intérieur de BMMs, soit une réduction drastique dans la virulence par rapport au type sauvage. Ce dosage permet également un contrôle précis des conditions expérimentales, qui peuvent être manipulés individuellement pour analyser l’influence de divers facteurs (nutriments, espèces réactives de l’oxygène, etc.) sur l’interaction hôte-pathogène. Par conséquent, l’exécution appropriée et la quantification des études d’infection BMM fournissent une alternative non invasive, rapide, économique, sécuritaire et fiable pour les études sur des modèles animaux conventionnels.

Introduction

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La leishmaniose se réfère à un large éventail de maladies humaines causées par les espèces de protozoaire parasite du genre Leishmania. Environ 12 millions de personnes sont actuellement infectées par Leishmania dans le monde entier, et plus de 350 millions sont menacés. La pathologie de la maladie dépend de l’espèce de Leishmania et facteurs de l’hôte, et symptômes varient d’innofensif auto guérison des lésions cutanées aux formes visceralizing mortelles. Si non traitée, viscérale de la leishmaniose est fatale, rang seulement après le paludisme comme la plus meurtrière maladie humaine causée par une infection par un protozoaire parasite1. En dépit des différences de grande envergure dans la pathologie de la maladie et les symptômes, toutes les espèces de Leishmania ont un cycle de digéniques alternant entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et les hôtes vertébrés, respectivement. Intérieur vertébrés, Leishmania ciblent les macrophages hôtes pour invasion et induisent la formation de vacuoles parasitophore (PVs), compartiments acides avec les propriétés des phagolysosomes où les formes hautement virulente amastigote répliquent. Amastigotes persistent dans les tissus de l’hôte lors d’infections chroniques et peuvent être passés vers des phlébotomes, complétant le cycle de transmission. Par conséquent, dans le contexte du développement de la maladie humaine, amastigotes sont le plus important Leishmania lifecycle formulaire2. Étudier comment les amastigotes se reproduire à l’intérieur de macrophages PVs est essentiel pour comprendre Leishmania virulence3,4,5,6,7 et la développement de nouveaux traitements efficaces.

Nous décrivons ici une méthode régulièrement utilisée par notre laboratoire pour étudier les maladies infectieuses Leishmania et réplication dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs), qui prévoit une évaluation quantitative du nombre d’intracellulaire Leishmania au fil du temps. Le processus implique la récolte des monocytes de moelle osseuse de souris et de la différenciation à macrophages en culture, in vitro l’infection avec des formes infectantes (promastigotes métacycliques ou amastigotes) de Leishmania et quantification de la nombre de parasites intracellulaires à chaque intervalle de 24h pour une période de 72-96 h après l’infection. Ce test a été utilisé dans notre laboratoire pour déterminer l’effet de plusieurs facteurs environnementaux et les gènes parasites, y compris l’identification du rôle crucial de fer dans la promotion de L. amazonensis virulence qui a été également validé par coussinet plantaire études de développement de lésions en souris6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Étant donné que toutes les espèces de Leishmania pathogènes établissent leur niche réplicative à l’intérieur de macrophages de l’hôte, ce test peut être utilisé universellement pour les déterminations de la virulence chez toutes les espèces de Leishmania .

Effectuant des infections BMM permet l’analyse des interactions hôte-parasite au niveau de la cellule unique et donc une plus vaste compréhension de comment les parasites Leishmania interagissent avec leur microenvironnement hôte préféré, le PVs des macrophages. Macrophage infection dosages ont été utilisées avec succès par plusieurs groupes16,17,18,19,20,21,22 à explorer fonctions de macrophage hôte et Leishmania de gènes spécifiques et leur implication potentielle dans les interactions complexes qui caractérise l’infection intracellulaire. Les infections BMM permettent la quantification de la croissance du parasite comme une lecture de l’impact des facteurs de l’hôte qui influencent la survie intracellulaire, tels que la production d’oxyde nitrique microbicide, génération d’espèces réactives de l’oxygène et autres conditions défavorables rencontrés dans le lysosome type PVs23. Macrophage infection essais ont également été utilisés pour identifier prospects de drogue anti-leishmanies potentiels pour le développement de thérapeutiques13,24.

Le caractère in vitro des infections BMM offre plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes pour évaluer la virulence de Leishmania . Cependant, plusieurs études antérieures, examen des mécanismes de survie du parasite intracellulaire au fil du temps n’ont pas quantifié l’infection comme un taux de21,20,24. En outre, beaucoup d’études axé sur le suivi des infections in vivo au fil du temps l’a fait en mesurant la taille des lésions cutanées et autres symptômes physiologiques qui ne sont qu’indirectement liées au parasite réplication25,26 , 27. in vivo de l’infection est une approche rigoureuse pour évaluer la virulence du parasite, mais les mesures de taille de lésion basées sur coussinet plantaire gonflement seul sont souvent insuffisantes, car elles reflètent la réponse inflammatoire dans les tissus infectés et pas la nombre absolu de parasites. Pour cette raison, le développement des lésions coussinet plantaire dosages doivent être suivies par la quantification de la charge parasitaire dans les tissus infectés, une procédure qui exige la dilution limite longue tests28. En outre, des études in vivo impliquent souvent sacrifier plusieurs animaux à différents points dans le temps pour en extraire des tissus d’intérêt6,8,9,10, 11 , 13. en revanche, un grand nombre de BMMs peut être obtenu d’un seul animal, et que ces cellules peuvent être plaqués dans des conditions qui permettent l’évaluation d’infection à divers points dans le temps. En outre, par rapport aux études in vivo , effectuant des infections in vitro BMM permet une plus grande maîtrise des conditions expérimentales. Quantifier les macrophages infectés ainsi que les parasites permet un contrôle précis de la multiplicité d’infection (MOI) et des conditions de culture. Contrôle précis sur ces facteurs peut être la clé dans l’identification des caractéristiques des voies cellulaires discrets et dans la compréhension de leur impact sur l’évolution de l’infection.

Compte tenu de ces avantages, il est quelque peu surprenant que très peu étudient des Leishmania virulence ont jusqu'à présent pleinement tiré profit de l’évaluation quantitative de réplication intracellulaire dans les macrophages. Dans cet article, nous discutons des pièges communs qui peuvent être gênant l’utilisation plus étendue de ce test et fournir un protocole étape par étape pour faciliter son application correcte. Compte tenu de sa précision et la polyvalence, le dosage d’infection BMM que nous décrivons ici peut non seulement servir d’explorer les interactions hôte-pathogène qui influent sur la virulence de la leishmaniose , mais aussi d’étudier d’autres microorganismes qui reproduisent à l’intérieur macrophages29. Ce qui est important, ce dosage peut également être développé comme une méthode de dépistage pré-clinique rapide et économique pour le développement de médicaments anti-leishmanies.

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Protocole

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Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux recommandations du guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire par le National Institutes of Health et ont été approuvés par l’Université du Maryland IACUC. Toutes les étapes décrites dans les sections 1 à 4 devraient être effectués aseptiquement à l’intérieur des hottes à flux laminaire biologique. Protection individuelle doit être utilisée, et il faut être prudent lors de la manipulation de Leishmania vivants pendant toutes les étapes d’expérimentation .

1. isolement et différenciation des Macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs)8,30,31

  1. Jour 0 : 4 - 6 semaines femelle C57BL/6 ou souris BALB/c dans une chambre de CO2 de sacrifier et confirmer la mort par dislocation cervicale. Assurer la stérilisation des ciseaux et des pinces en les gardant trempées dans l’éthanol à 70 %. Vaporiser gants d’éthanol à 70 % pour permettre stérile manutention durant tout le processus d’isolement cellulaire la moelle osseuse.
  2. Sécuriser les souris sacrifiée au Conseil de dissection en épinglant ses pattes avant et désinfecter en pulvérisant abondamment avec l’éthanol à 70 %.
  3. Faire une petite incision (environ 1 cm) avec des ciseaux près de l’articulation de la hanche. Insérez avec précaution les ciseaux sous la peau pour séparer le muscle sous-jacent et couper la peau tout autour de l’articulation de la hanche.
    NOTE : Le jury de la dissection peut être tourné pour permettre un accès amélioré à l’articulation de la hanche.
  4. Soigneusement deglove la peau de la jambe en tirant vers la cheville et le retirer. Couper le pied à la cheville, en faisant très attention de ne couper égale ou inférieure à la cheville, commune de laisser le tibia entièrement intact.
    Remarque : Le péroné à ce stade est librement fixé et peut être facilement séparé avec la pince.
  5. Localiser manuellement l’articulation de la hanche en manipulant le fémur pour identifier le point de rotation. Avec soin, utiliser des ciseaux pour couper la jambe au-dessus de l’articulation de la hanche de laisser la tête proximale du fémur intact.
  6. Eliminez autant de muscles et du tissu conjonctif que possible de la jambe avec des ciseaux. Retirez toute la peau restante de la cheville et toute matière osseuse excessive au-dessus de l’articulation de la hanche.
  7. Placer les os nettoyés dans RPMI stérile additionné de pénicilline/streptomycine (concentration finale de 1 %) dans une boîte de Pétri sur la glace.
  8. Répétez les étapes 1,4 à 1,6 à isoler le tibia et le fémur de la jambe de derrière d’autre.
  9. Supprimer les éventuels musculaire et du tissu conjonctif des os trempage dans RPMI à l’aide de forceps stérilisé et lame #10 stérile.
  10. Placer les os sur le couvercle de boîte de Pétri. Coupez soigneusement le tibia avec la lame immédiatement au-dessus de l’articulation de la cheville pour accéder à la moelle. Enlever le tibia du reste de la jambe en coupant immédiatement au-dessous de l’articulation du genou.
  11. Tirer 10 mL RPMI stérile additionné de pénicilline/streptomycine (concentration finale de 1 %) dans une seringue de 10 mL et attacher une aiguille 25G.
  12. Maintenez les tibia fermement avec une pince, verticalement sur un tube conique de 50 mL sur la glace. Utiliser la seringue pour injecter doucement environ 5 mL de RPMI dans l’extrémité de l’OS pour vider la moelle osseuse de l’autre extrémité dans le tube à fond conique. Rincer la moelle osseuse avec un total de 10 mL RPMI jusqu'à ce que l’OS devient blanc.
    Remarque : Après vidange complète, l’OS doivent blanchir. Si ce n’est pas le cas, poursuivre le rinçage pour enlever la moelle osseuse. L’extrémité distale du tibia peut être nécessaire de tailler revient avec la lame si elle est trop étroite pour insérer l’aiguille.
  13. Coupez immédiatement le fémur au-dessus de l’articulation du genou et immédiatement au-dessous de l’articulation de la hanche pour exposer les deux extrémités de l’OS pour accéder à la moelle. Rincer la moelle osseuse du fémur avec un total de 10 mL RPMI de la même façon que le tibia.
  14. Répéter nettoyage et rinçage étapes 1.6 par 1.13 avec les os restants et de recueillir les cellules de la moelle osseuse rouge dans un tube conique unique 50 mL
    Remarque : Si un OS tombe à tout moment au cours de la dissection avant rinçage osseuse, n’utilisez pas la moelle de cet OS.
  15. Centrifuger le tube conique utilisé pour collecter la moelle osseuse vidée de tous quatre os pendant 10 min à 4 ° C à 300 x g.
  16. Mettre 60 mL de milieu stérile de BMM (RPMI avec une concentration finale de 20 % des BF, 1 % pénicilline/streptomycine, 1,2 mM Na-pyruvate, 25 µg/mL M-CSF humain) dans un flacon de culture cellulaire de2 de 175 cm avec bouchon de filtre.
  17. Jeter la surnageante centrifugation suivante et remettre en suspension le culot cellulaire en douce et descendre de pipetage à l’aide de 5 mL de milieu BMM du flacon.
  18. Transférer la suspension cellulaire dans le flacon de culture et rincer le tube conique deux fois avec moyen BMM du flacon de culture pour assurer le recouvrement de cellulaires maximales. Assurer la suspension cellulaire est bien mélangée dans un milieu et distribuer 30 mL le flacon de culture cellulaire initiale 175 cm2 à un deuxième 175 cm2 flacon de culture cellulaire avec bouchon de filtre.
  19. Incuber les deux flacons contenant de suspension cellulaire 30 mL chaque nuit à 37 ° C, 5 % de CO2 pour permettre la séparation de tout contaminant les fibroblastes, des macrophages résidents et autres cellules adhérentes.
  20. Jour 1 : Transférer le surnageant contenant des cellules indifférenciées de la moelle osseuse de flacons de 100 x 15 mm non traités-TC polystyrène Pétri à environ 10 mL/plat et incuber à 37 ° C, 5 % CO2. Jeter les flacons.
  21. Jour 3 ou 4 : Ajouter un support BMM supplémentaire 5 mL (préalablement chauffé à 37 ° C) pour chaque boîte de Pétri et continuer d’incubation à 37 ° C, 5 % de CO2.

2. électrodéposition BMMs sur lamelles couvre-objet pour l’Infection (jour 7 ou 8)

  1. Préparer les plaques 6 puits culture de tissu en plaçant quatre 4 lamelles de verre stérile 12 mm (stérilisés à l’autoclave et stockées dans un récipient en verre fermés) dans le fond de chaque vide bien.
    NOTE : Ramasser chaque lamelle stérile 12 mm avec un embout d’aspiration monté sur une ligne vide. Placer les lamelles dans les puits sans chevauchement, libérant à la position désirée en pinçant le tube pour interrompre le vide.
  2. Aspirat médias (et toute les cellules non adhérentes) de Pétri recouvertes d’adhérentes la moelle osseuse provenant des macrophages et doucement des cellules adhérentes de rinçage 2 x avec saline tamponnée au Phosphate de Dulbecco stérile sans chlorure de calcium et de magnésium (PBS- / -) préchauffée à 37 ° C.
  3. Ajouter goutte à goutte, 5 mL stérile 1 x PBS- / - avec une concentration finale de 1 mM EDTA à chaque boîte de Pétri et incuber pendant 5 min à 37 ° C, pour détacher adherent BMMs. vérifier que les cellules sont détachent à l’aide d’un microscope.
  4. Prélever des cellules tout détachés suspendus dans du PBS 1 x- / -, additionné de 1 mM EDTA dans un tube conique de 50 mL. Rincer chaque plat 2 x 5 ml de PBS- / - et ajouter au pool de suspension cellulaire.
    NOTE : Suspension cellulaire peut être diluée avec du PBS supplémentaires- / - pour protéger des macrophages de la toxicité de l’EDTA pendant le processus de collecte.
  5. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les macrophages dans 5-10 mL de milieu de BMM de pipetage. Place remis en suspension sur la glace pour éviter la saisie à tubes et agglutination des cellules.
  6. Compter les cellules viables utilisant le bleu Trypan exclusion dans l’hémocytomètre.
    Remarque : Pour compter les cellules BMM resuspendues dans 5 mL de milieu, un mélange de dilution de 25 µL de la suspension cellulaire dans 445 µL PBS- / - et 30 µL de solution de bleu de Trypan 0,4 % généralement permet de quantification facile dans un hémocytomètre (prenant en compte un facteur de dilution 20 x pour le calcul final ). Compter uniquement les cellules qui ne pas tachés avec le bleu de Trypan (cellules viables). Le volume de suspension cellulaire peut être modifié si ce mélange est trop concentré ou dilué. En général, le rendement du BMM par préparation varie entre 2 x 10,7 et 5 x 107 cellules de souris unique.
  7. Préparer la suspension de cellules dans un milieu BMM à concentration de placage désiré (5 x 105/ml) et disperse suspension à 6 plats au milieu de 2 mL par puits, afin que chacun reçoive bien 1 x 106 macrophages.
    NOTE : Ceci est une étape essentielle qui garantit chaque obtient bien le nombre adéquat de macrophages pour couvrir les lamelles uniformément. Vérifiez que les lamelles dans les puits ne sont pas chevauchement ou flottant dans le milieu. Dans l’affirmative, ajuster doucement avec un embout de la pipette stériles.
  8. Incuber une nuit à 37 ° C, 5 % de CO2.

3. purification des formes infectantes de L. amazonensis

NOTE : Préparez Leishmania car les infections - purifier promastigotes métacycliques du stationnaire promastigote cultures8,13, ou différencier promastigotes en culture en forme amastigote, utilisant le standard L. amazonensis différenciation axéniques protocole6,8.

  1. Purification de Leishmania promastigotes métacycliques utilisant media(Materials) gradient de densité 33
    1. Préparer la solution mère de 40 % des médias gradient de densité dans l’eau stérile, exempt d’endotoxine.
    2. Diluer la solution gradient de densité dans un milieu x M199 10 (sans sérum) pour préparer la concentration de 10 % dans le milieu M199.
    3. Toutes les solutions filtrer sur un filtre à 0,22 µm.
      Remarque : Les solutions mères peuvent être stockées à 4 oC dans l’obscurité pour n’est plus d’un mois.
    4. Ajouter 2 mL de solution de médias gradient de densité 40 % dans le fond d’un tube à centrifuger conique de 15 mL.
    5. 2 mL de solution de médias gradient de densité de 10 % dans M199 sur le dessus de la couche de médias gradient de densité de 40 % de couche, soigneusement, à l’aide d’une pipette Pasteur afin d’éviter tout mélange entre les deux couches.
    6. Collecter 1 x 109 parasites de la culture de la phase stationnaire par centrifugation à 1 900 x g pendant 10 min.
    7. Remettre en suspension les cellules dans de 6 mL Dulbecco modifié essentiel (DMEM).
    8. Couche 2 mL de la suspension cellulaire directement sur le dessus de la densité de 10 % dégradé media layer, doucement, à l’aide d’une pipette Pasteur pour éviter le mélange entre les couches.
    9. Centrifuger le dégradé pendant 10 min à 1 300 g à la température ambiante.
      Remarque : En raison de différences de propriétés physiques entre les espèces de Leishmania , conditions de centrifugation pour chacun pourraient avoir à être légèrement ajustée afin d’assurer un rendement maximal.
    10. Recueillir des parasites (enrichis sous forme de promastigotes métacycliques) de la bande formée à la frontière entre le gradient médias haute densité de 10 % (interface entre les couches de médias de gradient de densité 0 % et 10 %).
    11. Diluer les parasites avec un volume de DMEM et recueillir par centrifugation (1 900 x g pendant 10 min à température ambiante).
    12. Remettre en suspension dans 500 µL de milieu DMEM et compter dans un hémocytomètre pour quantifier le rendement.
  2. Génération de L. amazonensis amastigotes dans des conditions de culture axénique (faible pH / température élevée)6,8,13
    1. Mélanger 5 mL de la phase logarithmique promastigote culture (pH 7,4 à 26 oC) avec un volume égal d’amastigotes de milieu (pH 4,5), à l’aide de flacons de 25 cm2 (moyenne totale de 10 mL) et incuber pendant la nuit à 26 ° C.
    2. Passer le ballon entre 26 ° C à 32 ° C.
    3. Après 3 ou 4 jours, rompre la culture 1:5 dans médias amastigote à 32 ° C.
    4. Contrôler les parasites dans les 3-4 jours (maximum 7 jours) pour voir si ils sont prêt à être utilisé dans les infections.
      NOTE : Amastigotes axéniques sain doit avoir une forme ovale, sans flagelles visibles. Les amastigotes partiellement différenciées ont une grande forme ovale avec des flagelles courts. La culture n’ait pas beaucoup de touffes - nombreuses touffes sont une indication de non croissance, parasites en train de mourir. La culture de l’amastigote peut être divisée 1:5 et maintenue pendant un maximum de 3 semaines.

4. l’infection par L. amazonensis

  1. Diluer les suspensions de parasite selon MOI désiré (habituellement promastigotes métacycliques de 3-5 par macrophage [MOI de 1:3 ou 1:5]) et 1 amastigote par macrophage [MOI 1:1]. Ajouter Leishmania dans du PBS- / - dans un volume de 50-100 µL à chaque puits contenant déjà 2 mL de milieu.
  2. BMMs Incuber 1 h avec amastigotes et 3 h avec promastigotes métacycliques à 34 oC pour l’infection.
    Remarque : La température optimale de l’infection peut varier selon les espèces.
  3. Après incubation, soigneusement laver libres parasites dans chaque bien 3 x avec 2 mL de PBS- / - pré chauffé à 37 ° C.
    Remarque : Se dispersent PBS doucement pour s’assurer que les lamelles couvre-objet ne pas flotter sur l’autre. Agiter doucement la plaque et puis aspirer le liquide. Utiliser distinct embout aspiration si vous utilisez plusieurs souches de parasites afin d’éviter la contamination croisée.
  4. Difficulté 1 h ou 3 h-point dans le temps des échantillons en incubant chacun bien avec 1,5 à 2 mL de 2 % PFA dans du PBS- / - pendant environ 10 minutes laver 3 x avec PBS- / -. Ne pas aspirer le dernier lavage et réfrigérer les plaques contenant des lamelles dans du PBS jusqu'à coloration.
  5. Ajouter un milieu frais BMM 2 mL dans chaque cupule sur plaques pour davantage de temps-points et incuber à 34 ° C.
  6. Difficulté des temps-points restants comme souhaité comme indiqué au point 4.3 et réfrigérez plaques jusqu'à coloration.

5. le DAPI coloration et montage de la lamelle couvre-objet

  1. Aspirer les PBS de puits contenant des lamelles et ajouter 1,5 mL de PBS- / - avec 0,1 % de détergent non ionique. Incuber pendant 10 min à température ambiante, suivie de lavage x 3 avec 2 mL de PBS- / -.
  2. Ajouter 1 mL de PBS- / - 2 µg/ml DAPI (dilué de 5 mg/mL de solution dans l’eau) dans les puits contenant des lamelles couvre-objet et incuber pendant encore 1 h à température ambiante.
    Remarque : Le temps d’incubation au DAPI est essentiel pour la bonne visualisation de Leishmania intracellulaire . Noyaux de macrophage teinté rapidement, en raison de leur plus grande taille et l’ADN contenu mais la coloration des noyaux des parasites intracellulaires est plus lent. Ainsi, prolongeant la durée d’incubation au-delà de ce qui est nécessaire pour visualiser les noyaux BMM est nécessaire pour permettre au DAPI de pénétrer à travers et la parasite de la membrane plasmique et la membrane nucléaire de parasite. Avec la bonne coloration DAPI, le kinétoplaste mitochondrial DNA près de la poche flagellaire du parasite peut aussi être visualisé, en plus de l’ADN nucléaire.
  3. Lavez chaque puits contenant des lamelles 3 x avec 2 mL de PBS- / - et puis soulevez-le et clapet lamelles couvre-objet avec une pince pour placer le côté de la cellule vers le bas et monter sur verre microscope slides avec un réactif de montage antifade commercialement disponibles.
    NOTE : Lamelles sont extrêmement fragiles et ont besoin de manipulation prudente. Éviter de mettre la pression sur eux, en particulier contre le flanc des puits lors du levage. Ajouter quelques gouttes de PBS- / - réduit la tension superficielle entre la lamelle et bien et facilite le processus de levage. Une aiguille fine jauge peut servir à aider à écarter les lamelles du fond du puits. Après avoir placé un lamelle couvre-objet sur la diapositive, appuyer doucement avec une pince pour faire sortir les bulles d’air dans les supports de montage. Si un lamelle couvre-objet est cassé ou a peut-être renversé pendant le processus de levage, remonter pas ; Il suffit d’utiliser la rechange lamelle quatrième.
  4. Réfrigérer diapositives jusqu’au dosage.

6. infection Quantification

  1. Examiner les lames DAPI sous un microscope à fluorescence en mettant l’accent sur les macrophages à l’aide de lentille d’objectif X 100 avec de l’huile d’immersion (excitation à 358 nm ; émission optimale à 461 nm).
    Veiller à ce que l’accent est sur la couche des macrophages entre la lame et lamelle.
  2. Quantifier le nombre de macrophages (gros noyaux colorés au DAPI) et le nombre de plus petits noyaux amastigote groupés autour de chaque noyau de macrophages (voir la Figure 2 a, DAPI) pour chaque champ de vision, en utilisant un compteur manuel.
    Remarque : Les noyaux Amastigote seront peut-être pas tous visibles dans un seul plan d’activité en raison de leur petite taille. Compter ceux qui sont visibles lorsque centrée sur le noyau de macrophages et puis utilisez mise au point fine pour vérifier les noyaux de parasite dans les avions au-dessus et en dessous les noyaux de macrophage.
  3. Déplacer vers un autre champ de vision de répéter la quantification. Utiliser une clé séparée compteur pour suivre le nombre de champs comptés. Par le biais de champs visuels en rangées parallèles traversent chaque lamelle, pour empêcher chevauchement de comptage.
  4. Quantifier un minimum de 200 macrophages par lamelle couvre-objet. Quantifier à chaque instant de l’infection en trois exemplaires (3 lamelles). Compter la lamelle quatrième si l’un des précédents n’est pas approprié pour le comptage en raison de la lamelle couvre-objet chevauchement, mauvais montage, bris de verre, etc.
    Remarque : Si 200 macrophages ne peuvent pas compter sur toute une lamelle couvre-objet, compter la roue de secours à la quatrième.
  5. Calculer le taux d’infection comme les macrophages amastigotes/macrophage ou amastigotes/100 et déterminer le pourcentage des macrophages infectés des données brutes de quantification.

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Résultats

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Leishmania a deux formes infectantes - promastigotes métacycliques qui différencient des promastigotes procycliques à la phase stationnaire de la culture et les amastigotes, qui sont les stades intracellulaires (Figure 1). Chez certaines espèces de Leishmania comme L. amazonensis, amastigotes peuvent également être différenciés en culture axénique en déplaçant les cellules promastigote pour abaisser le pH (4.5) et des températures é...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les données quantitatives produites par l’essai d’infection BMM décrit ci-dessus, permet aux enquêteurs d’obtenir des taux d’infection et une détermination fiable des changements dans les propriétés de virulence dans un laps de temps relativement court (maximum 2 semaines, par rapport à la 2 mois nécessaires pour des expériences in vivo ). Cette méthode s’appuie sur le colorant spécifique de l’ADN DAPI, qui précisément les taches noyaux macrophage et parasite et permet une identification rapide et la quantificat...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes,

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de la subvention RO1 AI067979 de la santé à RNF.
YK est récipiendaire de la bourse de premier cycle de l’Howard Hughes Medical Institute de l’Université du Maryland à College Park.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque de culture cellulaire 6 puitsCellstar657160
AdenineAcros OrganicsAC147440250
Pointes de pipette à barrière d’aérosol (100-1000 &mu ; L)Fisherbrand02-707-404
Pointes de pipette à barrière d’aérosol (20-200 &mu ; L)Fisherbrand02-707-430
Pointes de pipette à barrière d’aérosol (2-20 &mu ; L)Fisherbrand02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Lame chirurgicale en acier au carbone #10Aspen Surgical371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL SeringueBecton Dickinson (BD)309604
BD Precisionglide Needle, 25G  ;Becton Dickinson (BD)305124
Boîte de culture cellulaire 35 mm x 10 mmCellstar627 160
Flacon de culture cellulaireCellstar660175
Lunettes de protection : cercles de 12 mmFisherbrand12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate)InvitrogenD1306
D-BiotineJ.T. BakerC272-00
EDTASigma AldrichEDS Alcool éthylique
200 proofPharmco-AAPER111000200
Falcon 100 mm x 15 mm polystyrène non traité TC Boîte de PétriCorning351029
Sérum de veau fœtalSeradigm1500-500
Ficoll400Sigma AldrichF8016
Microscope à fluorescenceNikonE200
Chèvre anti-souris IgG Texas rougeInvitrogenT-862
Chèvre anti-lapin IgG AlexaFluor488InvitrogenA-11034
HeminTokyo Chemical Industry Co. LTDH0008
HEPES (1M)Gibco15630-080
Isoton II DiluantBeckman Coulter
L-GlutamineGemini400-106
Medium 199 (10X)Gibco11825-015
Na pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
ParaformaldéhydeAlfa Aesar43368
Pénicilline/StreptomycineGemini400-109
Saline tamponnée au phosphate (-/-)ThermoFisher14200166
Tubes à centrifuger coniques en polypropyline 15 mLCellstar188 271
Tubes à centrifuger coniques en polypropyline 50 mLCellstar227 261
Réactif anti-décoloration ProLong GoldThermoFisherP36930
Anticorps anti-souris Lamp-1 pour ratEtudes sur le développement Banque d’hybridomes1D4B
Recombinant Humain M-CSFPeproTech300-25
Reichert Bright-Line  ; Hémocytomètre  ;Hausser Scientific1492
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Triton X-100 SurfactantMillipore SigmaTX1568-1
Trypan BlueSigma AldrichT8154
Ciseaux Délicats, 4 1/2"VWR82027-582
Pince à Dissection, Pointe FineVWR82027-386
Lames de microscopeVWR16004-368
Z1 Compteur de particules Coulter, BeckmanCoulter6605699
8546719

Références

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