Toutes les espèces pathogènes de Leishmania résident et répliquent à l’intérieur de macrophages de leurs hôtes vertébrés. Nous présentons ici un protocole pour infecter les macrophages dérivés de la moelle osseuse souris dans la culture avec la Leishmania, suivie d’une quantification précise de la cinétique de croissance intracellulaire. Cette méthode est utile pour l’étude des facteurs individuels qui influencent l’interaction hôte-pathogène et la virulence de Leishmania .
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Article de méthode
Quantification de la croissance à l’intérieur de Macrophages intracellulaire est un rapide et une méthode fiable pour évaluer la Virulence de Leishmania
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cycle de vie de Leishmania, l’agent causal de la leishmaniose, alterne entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et vertébrés hôtes, respectivement. Alors que les symptômes pathogènes de la leishmaniose peuvent varier considérablement, de lésions cutanées bénignes aux formes hautement mortelle maladie viscérale selon l’espèce infectieux, toutes les espèces de Leishmania résident à l’intérieur de macrophages de l’hôte pendant l’étape de vertébrés du leur cycle de vie. Leishmania infectiosité est donc directement liée à sa capacité à envahir, de survivre et de répliquer dans les vacuoles parasitophore (PVs) à l’intérieur des macrophages. Ainsi, évaluer la capacité du parasite à répliquer intracellulairement sert une méthode fiable pour déterminer la virulence. Étudier le développement de la leishmaniose à l’aide de modèles animaux est long, fastidieux et souvent difficile, en particulier avec les formes viscérales rôle importants. Nous décrivons ici une méthodologie pour suivre le développement intracellulaire de Leishmania dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs). Nombre de parasites intracellulaires est déterminés à intervalles de 24 h pour 72-96 h après l’infection. Cette méthode permet une détermination fiable des effets de divers facteurs génétiques sur la virulence de Leishmania . À titre d’exemple, nous montrons comment une délétion seul allèle du gène Mitochondrial transporteur de fer Leishmania (LMIT1) porte atteinte à la capacité de la souche mutante de Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 à pousser à l’intérieur de BMMs, soit une réduction drastique dans la virulence par rapport au type sauvage. Ce dosage permet également un contrôle précis des conditions expérimentales, qui peuvent être manipulés individuellement pour analyser l’influence de divers facteurs (nutriments, espèces réactives de l’oxygène, etc.) sur l’interaction hôte-pathogène. Par conséquent, l’exécution appropriée et la quantification des études d’infection BMM fournissent une alternative non invasive, rapide, économique, sécuritaire et fiable pour les études sur des modèles animaux conventionnels.
Introduction
La leishmaniose se réfère à un large éventail de maladies humaines causées par les espèces de protozoaire parasite du genre Leishmania. Environ 12 millions de personnes sont actuellement infectées par Leishmania dans le monde entier, et plus de 350 millions sont menacés. La pathologie de la maladie dépend de l’espèce de Leishmania et facteurs de l’hôte, et symptômes varient d’innofensif auto guérison des lésions cutanées aux formes visceralizing mortelles. Si non traitée, viscérale de la leishmaniose est fatale, rang seulement après le paludisme comme la plus meurtrière maladie humaine causée par une infection par un protozoaire parasite
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Protocole
Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux recommandations du guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire par le National Institutes of Health et ont été approuvés par l’Université du Maryland IACUC. Toutes les étapes décrites dans les sections 1 à 4 devraient être effectués aseptiquement à l’intérieur des hottes à flux laminaire biologique. Protection individuelle doit être utilisée, et il faut être prudent lors de la manipulation de Leishmania vivants pendant toutes les étapes d’expérimentation .
1. isolement et différenciation des Macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs)
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Résultats
Leishmania a deux formes infectantes - promastigotes métacycliques qui différencient des promastigotes procycliques à la phase stationnaire de la culture et les amastigotes, qui sont les stades intracellulaires (Figure 1). Chez certaines espèces de Leishmania comme L. amazonensis, amastigotes peuvent également être différenciés en culture axénique en déplaçant les cellules promastigote pour abaisser le pH (4.5) et des températures é.......
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Discussion
Les données quantitatives produites par l’essai d’infection BMM décrit ci-dessus, permet aux enquêteurs d’obtenir des taux d’infection et une détermination fiable des changements dans les propriétés de virulence dans un laps de temps relativement court (maximum 2 semaines, par rapport à la 2 mois nécessaires pour des expériences in vivo ). Cette méthode s’appuie sur le colorant spécifique de l’ADN DAPI, qui précisément les taches noyaux macrophage et parasite et permet une identification rapide et la quantificat.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes,
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de la subvention RO1 AI067979 de la santé à RNF.
YK est récipiendaire de la bourse de premier cycle de l’Howard Hughes Medical Institute de l’Université du Maryland à College Park.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaque de culture cellulaire 6 puits | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Pointes de pipette à barrière d’aérosol (100-1000 &mu ; L) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Pointes de pipette à barrière d’aérosol (20-200 &mu ; L) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Pointes de pipette à barrière d’aérosol (2-20 &mu ; L) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Lame chirurgicale en acier au carbone #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Seringue | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G ; | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Boîte de culture cellulaire 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Flacon de culture cellulaire | Cellstar | 660175 | |
| Lunettes de protection : cercles de 12 mm | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotine | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS Alcool éthylique | |
| 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm polystyrène non traité TC Boîte de Pétri | Corning | 351029 | |
| Sérum de veau fœtal | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Microscope à fluorescence | Nikon | E200 | |
| Chèvre anti-souris IgG Texas rouge | Invitrogen | T-862 | |
| Chèvre anti-lapin IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluant | Beckman Coulter | ||
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldéhyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Gemini | 400-109 | |
| Saline tamponnée au phosphate (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Tubes à centrifuger coniques en polypropyline 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Tubes à centrifuger coniques en polypropyline 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| Réactif anti-décoloration ProLong Gold | ThermoFisher | P36930 | |
| Anticorps anti-souris Lamp-1 pour rat | Etudes sur le développement Banque d’hybridomes | 1D4B | |
| Recombinant Humain M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line ; Hémocytomètre ; | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Ciseaux Délicats, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Pince à Dissection, Pointe Fine | VWR | 82027-386 | |
| Lames de microscope | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Compteur de particules Coulter, Beckman | Coulter | 6605699 |
Références
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al.
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Réimpressions et autorisations
