Nous présentons ici des protocoles pour la collecte et microinjecting maïs precellular embryons de la chrysomèle des racines du afin d’effectuer des analyses génomiques fonctionnelles telles que la transformation de la lignée germinale et CRISPR/Cas9-génome édition.
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Article de méthode
Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9
Dans cet article
Résumé
Résumé
La chrysomèle des racines du maïs (BFR) est un important ravageur du maïs et est bien connu pour sa capacité à s’adapter rapidement aux stratégies de lutte antiparasitaire. Bien que l’interférence ARN (ARNi) s’est avéré pour être un outil puissant pour étudier la biologie de la région des Caraïbes, il a ses limites. Plus précisément, Arni elle-même est transitoire (c'est-à-dire n’entraîne pas une hérédité mendélienne à long terme du phénotype associé), et il exige la connaissance de la séquence d’ADN du gène cible. Ce dernier peut être limitant si le phénotype d’intérêt est contrôlé par des gènes mal conservés, ou encore roman, parce que l’identification des cibles utiles serait difficile, voire impossible. Par conséquent, le nombre d’outils dans la boîte à outils génomique de WCR devrait être élargi par le développement de méthodes qui pourraient être utilisés pour créer des souches mutantes stables et activer les sondages indépendants de séquence du génome du BFR. Dans les présentes, nous détaillons les méthodes utilisées pour recueillir et microinject des embryons de WCR precellular avec les acides nucléiques. Alors que les protocoles décrits dans les présentes visent à la création de WCR transgénique, CRISPR/Cas9-génome réaliser un montage pourrait aussi en utilisant les mêmes protocoles, avec la seule différence étant la composition de la solution injectée dans les embryons.
Introduction
La chrysomèle du maïs (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, est un important ravageur du maïs1. Fait intéressant, WCR semble surmonter contrôle mesure plus rapidement que les parasites agricoles plus car ils ont non seulement s’adapter physiologiquement, mais aussi sur le plan comportemental2,3,4,5, 6. au cours de la dernière décennie, l’interférence ARN (ARNi), un outil puissant de la génomique fonctionnel, a été étudiée comme une méthode de contrôle possibles pour WCR
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Protocole
1. colonie-niveau élevage des adultes de la région des Caraïbes
- Obtenir une quantité suffisante d’adultes de la région des Caraïbes (500-1 000) d’un laboratoire de recherche ou entreprise fiable (voir Table des matières pour obtenir un exemple) et les placer dans une cage de 30 cm3 .
Remarque : L’utilisation d’une souche non diapause est fortement recommandée. - Préparer l’alimentation artificielle WCR, suivant le protocole du fabricant et versez une couche de 1 cm d’épaisseur dans un récipient de 38 oz (voir Table des matières). Après avoir mélangé, stocker nourriture inutilisée, à 4 ° C pendant 2 mois....
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Résultats
Une considération importante lors de l’élaboration de ce protocole était le stade de développement embryonnaire à l’époque de microinjection. Transformation de la lignée germinale exige expressément, microinjection d’ADN avant cellularisation embryonnaire. C’est parce que l’ADN ne peut facilement traverser les membranes cellulaires. Tentatives pour visualiser les étapes du développement embryonnaire de BFR en utilisant un colorant nucléaire ont échoué parce que les dechorionation d’embryo.......
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Discussion
Même si la microinjection de WCR avec ARN doubles brins aux fins de l’ARNi a été signalé9, il s’agit du premier protocole à établir des pratiques exemplaires pour microinjecting precellular embryons WCR, un processus essentiel pour mener la transformation de la lignée germinale et/ou CRISPR/Cas9 génome de montage chez cette espèce. Microinjection réussie d’embryons WCR est tributaire de nombreux facteurs, comme c’est l’efficacité de la transformation. Ci-dessous sont quelques-unes des principales .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention du programme de recherche connaissances Corn Rootworm Monsanto, accorde un numéro AG/1005 (pour le MDL et YC) et fonds d’amorçage au MDL de NCSU. FC a été pris en charge par des subventions du programme de recherche de Monsanto Corn Rootworm connaissances (AG/1005) et la National Science Foundation, accorder numéro MCB-1244772 (au MDL). Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés. FC et MDL conçu et créé les expériences ; FC, PW et SP effectuaient les expériences ; FC et MDL ont analysé les résultats ; et FC, NG et le MDL a écrit le manuscrit. Nous remercions Teresa O'Leary, William Klobasa et Stephanie Gorski pour leur ....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Papier filtre qualitatif (noir) | Ahlstrom | 8613-0900 | Pour micro-injection d’œufs |
| Contenants de 1 oz ; | Anny’s Vaisselle en plastique | ASET101 | Récipient à œufs |
| Gélose Drosophile Type II | Apex | 66-103 | Substrat pour plat de ponte WCR |
| Pince poids plume ; | Bioquip | 4748 | Manipulation des larves et des nymphes |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Laver le maïs et la vaisselle |
| Trucker’s Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Maïs pour l’alimentation Système |
| micro-injection WCR (fait maison) | NA | Pièces et instructions disponibles sur demande | Contrôle la pression d’injection (0-20 psi) |
| Colle non toxique Elmer’s | Products, Inc. | E304 | Coller des œufs sur du papier filtre |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Remplissage des aiguilles |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Maïs germé /150 x 25 mm |
| Fisherbrand ; Cercles de papier filtre de qualité quantitative | Fisher Scientific | S47576C | Fabrication d’une gélose pour la ponte d’œufs/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Laver la vaisselle |
| Lames de microscope ordinaire | Fisher Scientific | 12-549-3 | Maintien du papier filtre et des œufs pour micro-injection |
| Chrysomèle des racines du maïs de l’Ouest sans substitut de pollen | Frontier Agricultural Sciences ; | F9766B | WCR régime artificiel adulte |
| Boules de coton, Grand | Genesee Scientific | 51-101 | Fermer la fiole |
| Globe Scientific 3.0 mL Pipettes de transfert à petite ampoule | Globe Scientific | 137035 | Collecter et transférer des œufs |
| Leica M165 FC Stéréomicroscope à fluorescence ; | Leica | M165 FC ; | Dépistage du BFR |
| DsRed Set de filtres pour stéréomicroscope à fluorescence | Leica | DSR | Filtre d’excitation : 510-560 nm, filtre d’émission : 590-650 nm |
| Filtre EGFP | Leica | GFP2 | Filtre d’excitation : 440&ndash ; 520 nm, filtre anti-émissions : 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage pour colonie adulte |
| Pinceau miniature | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 ; |
| Micromanipulateur à manette | Narishige | MN-151 | Micromanipulateur et porte-aiguille |
| Microscope Platine XY Platine | Olympus | 265515 | Scène de microscope (adaptée pour une utilisation avec stéréoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | Pour la ponte |
| Film de paraffine en plastique ; | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Sceller la guérisse après microinjection/Rouleau 4 po x 125 pi |
| Incubateur | Percival Percival ; | I41VLH3C8 | WCR chambre de culture (incubateur d’élevage d’insectes) |
| Erlenmeyer à bouche étroite Flacons | VWR | 4980-300-PK | Réservoir d’eau pour colonie d’adultes ; |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | Pour la dorure à l’œuf |
| Rouleaux de coton tressé | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Utilisation dans l’approvisionnement en eau d’une colonie d’adultes |
| Boîtes de Pétri (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | Pour plaques diététiques |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Tampon de micro-injection |
| Extracteur de micropipiette à base laser | Instrument Sutter | P-2000/G | Extracteur d’aiguille/Chaleur = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Couche arable | The Scotts Company | 71130758 | Sol pour la culture |
| du cronReloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Sac de gélose après microinjection/5x7 |
| Boîtes de Pétri (100x15m) | VWR | 89038-968 | Fabrication de gélose pour la ponte d’œufs/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR chambre d’accouplement à paire unique ; |
| Conteneurs de 38 oz | Webstaurantstore | 128NC888 | Boîte d’élevage de larves/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Conteneur de charcuterie en plastique translucide micro-ondable | Webstaurantstore | 128HRD16 | Boîte d’élevage de larves/16 oz |
| Portée de micro-injection ; | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Lunette de micro-injection équipée d’une platine XY |
| Standard Capillaires en verre | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Aiguilles de micro-injection |
| Chrysomèles adultes du maïs occidental Recherche | centrale nord Laboratoire | Souche non diapase | Demande du laboratoire du Dr Bryan Wade French |
| Kit Midi ADN plasmidique | Qiagen | 12143 | Purification d’ADN plasmidique prêt à l’injection |
Références
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W.
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Réimpressions et autorisations
