Nous présentons ici des protocoles pour la collecte et microinjecting maïs precellular embryons de la chrysomèle des racines du afin d’effectuer des analyses génomiques fonctionnelles telles que la transformation de la lignée germinale et CRISPR/Cas9-génome édition.
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Article de méthode
Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9
Dans cet article
Résumé
Résumé
La chrysomèle des racines du maïs (BFR) est un important ravageur du maïs et est bien connu pour sa capacité à s’adapter rapidement aux stratégies de lutte antiparasitaire. Bien que l’interférence ARN (ARNi) s’est avéré pour être un outil puissant pour étudier la biologie de la région des Caraïbes, il a ses limites. Plus précisément, Arni elle-même est transitoire (c'est-à-dire n’entraîne pas une hérédité mendélienne à long terme du phénotype associé), et il exige la connaissance de la séquence d’ADN du gène cible. Ce dernier peut être limitant si le phénotype d’intérêt est contrôlé par des gènes mal conservés, ou encore roman, parce que l’identification des cibles utiles serait difficile, voire impossible. Par conséquent, le nombre d’outils dans la boîte à outils génomique de WCR devrait être élargi par le développement de méthodes qui pourraient être utilisés pour créer des souches mutantes stables et activer les sondages indépendants de séquence du génome du BFR. Dans les présentes, nous détaillons les méthodes utilisées pour recueillir et microinject des embryons de WCR precellular avec les acides nucléiques. Alors que les protocoles décrits dans les présentes visent à la création de WCR transgénique, CRISPR/Cas9-génome réaliser un montage pourrait aussi en utilisant les mêmes protocoles, avec la seule différence étant la composition de la solution injectée dans les embryons.
Introduction
La chrysomèle du maïs (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, est un important ravageur du maïs1. Fait intéressant, WCR semble surmonter contrôle mesure plus rapidement que les parasites agricoles plus car ils ont non seulement s’adapter physiologiquement, mais aussi sur le plan comportemental2,3,4,5, 6. au cours de la dernière décennie, l’interférence ARN (ARNi), un outil puissant de la génomique fonctionnel, a été étudiée comme une méthode de contrôle possibles pour WCR7,8et a également été utilisé comme un moyen pour étudier les gènes fonction9. Cependant, alors que l’ARNi est fréquemment effectuée par microinjection d’ARN double brin (dsRNA) chez d’autres espèces, Arni axée sur l’injection est rare dans la région des Caraïbes. En fait, il y a seulement quelques rapports d’Arni par microinjection d’ARNdb dans WCR9. La raison en est que WCR peut atteindre des hauts niveaux de gène knockdown par ingestion de dsRNA7,10, permettant même l’étude des effets embryonnaires en se nourrissant de dsRNA à la mère de11. Tandis que cette méthode rend WCR un excellent sujet pour l’analyse génomique fonctionnelle par Arni, il a ralenti le progrès sur l’élaboration de méthodologies pour la microinjection embryonnaire chez cette espèce.
Malgré la puissance de l’ARNi, il y a quelques inconvénients. Par exemple, pas de tous les gènes répondent également à Arni. Cette variabilité peut faire interpréter les résultats d’un essai de génomique fonctionnelle plus difficile. En outre, Arni est transitoire et ne génère pas de mutations héréditaires. En revanche, la transformation de cellules germinales, un autre outil génomique fonctionnelle, peut générer des mutations héréditaires par insertion d’un élément transposable marqué dans le génome12,13. Cela rend la transformation de la lignée germinale un excellent outil pour la création de souches mutantes pour utilisation dans les études génétiques à long terme. Transformation peut également être utilisée pour secourir une mutation en remettant une copie fonctionnelle du gène d’un génome mutant14. En outre, la transformation de la lignée germinale est la pierre angulaire d’une grande variété de techniques de génétique moléculaire. En plus assommant et/ou la fonction du gène de sauvetage, transformation de la lignée germinale peut être utilisée pour enhancer piégeage15, gène piégeage16, axée sur la famille Gal4 l’expression ectopique17et pangénomique mutagénèse18.
Plus récemment, des outils qui permettent le montage sophistiqué du génome ont été développés. Ces outils comprennent la Transcription Activator-Like effecteur nucléases (TALEN) et les CRISPR/Cas9-nucléase système19,20. L’avantage de ces nouveaux outils est qu’ils offrent aux chercheurs la capacité d’induire une rupture d’ADN double-brin à presque n’importe quel endroit dans presque n’importe quel génome. Une fois que l’induit, ces pauses peuvent être réparés par le biais de deux extrémités non homologue rejoindre, qui peuvent introduire des suppressions ou insertions dans le gène ciblé, ou réparation axés sur l’homologie, qui, en présence d’une construction machinée, peut catalyser la remplacement de gènes ensemble ou régions génétiques21,22. Cependant, ces méthodes nécessitent microinjection de DNA, RNA et/ou de protéine dans des embryons de très jeunes.
Ce qui est important, contrairement à l’ARN doubles brins utilisé pour Arni, les acides nucléiques et les protéines utilisées pour la lignée germinale transformation et la modification du génome ne peut pas franchir facilement les membranes cellulaires. Par conséquent, microinjection de plasmide DNAs, ARNm et/ou protéines doit avoir lieu pendant l’étape du blastoderme syncytial (c'est-à-dire avant que l’embryon insecte cellularizes). Ce qui rend le moment des injections un facteur critique. Par exemple, chez Drosophila melanogaster, embryons doivent être injectés dans les deux heures après que les oeufs poser12. Par conséquent, élaboration d’un protocole de microinjection embryonnaires réussie pour la région des Caraïbes doit tenir compte les meilleures conditions pour la pose d’ovule de la femme, ainsi que la meilleure méthode pour recueillir des quantités suffisantes d’embryons precellular.
Un effort pour apporter un large éventail d’outils génétiques moléculaires sur la biologie de la WCR exige l’élaboration de méthodes de collecte et de microinjecting precellular embryons WCR. Ici, nous fournissons des instructions détaillées, ainsi que des trucs et astuces, pour aider les autres à utiliser des techniques axées sur la transformation dans la recherche de la région des Caraïbes. En plus d’étendre des technologies transgéniques à WCR devant servir à des études de génomique fonctionnelles, ces techniques permettent aussi puissant nouvelles stratégies de contrôle de ravageurs comme gène lecteur23,24 à tester dans ce économiquement important lutte antiparasitaire.
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Protocole
1. colonie-niveau élevage des adultes de la région des Caraïbes
- Obtenir une quantité suffisante d’adultes de la région des Caraïbes (500-1 000) d’un laboratoire de recherche ou entreprise fiable (voir Table des matières pour obtenir un exemple) et les placer dans une cage de 30 cm3 .
Remarque : L’utilisation d’une souche non diapause est fortement recommandée. - Préparer l’alimentation artificielle WCR, suivant le protocole du fabricant et versez une couche de 1 cm d’épaisseur dans un récipient de 38 oz (voir Table des matières). Après avoir mélangé, stocker nourriture inutilisée, à 4 ° C pendant 2 mois.
- Mettre une boîte de Pétri (100 x 15 mm) avec alimentation adulte (10-15 g) dans une cage de 30 cm3 . Ajouter l’alimentation plus lorsque la nourriture est faible ou sec.
- Mettre un ballon (300 mL) avec de l’eau, recouvert d’une boule de coton, qui sert à maintenir en place un rouleau de coton (6 "x 3/8"), pour servir comme une source d’eau. Changez l’eau quand elle s’épuise.
- A 14:10 lumière cycle un insecte incubateur d’élevage et de maintenir WCR à 26 ° C avec une humidité de 60 %.
2. l’alignement et la collecte des embryons
- Faire une couveuse de collection à l’aide de 1 % d’agar dans de l’eau dans un stérile 100 x 15 mm2 boîte de Pétri. Conserver à 4 ° C après que l’agar se solidifie.
- Pour ramasser les œufs nouvellement posées, placer une seule couche de papier filtre, suivie de 4 couches d’étamine (chaque coupe à la taille) sur la surface de la gélose (Figure 1 a).
NOTE : Étamine peut être réutilisé, après avoir été lavé à l’eau de Javel et stérilisés à l’autoclave, mais il n’est pas nécessaire de procéder à la première utilisation. Papier filtre ne doivent pas être réutilisé et ne doit pas être stérilisé. - Placer les oeuf collection plaque en cage WCR plus tard dans la journée que possible (fin de journée de travail) et couvrir d’une tente de feuille d’étain. Laisser une nuit.
Remarque : Avoir les lumières de 10:00 à 12 h 00 (14 h) retards de Ponte, ce qui facilite la collecte des oeufs plus jeunes pour microinjection sans exiger du personnel de laboratoire d’y placer la chambre de collection cage tard dans la nuit. - Supprimer la couveuse de collection autour de 8 ou de 09:00
- Utiliser forceps pour ramasser 1 couche de gaze en temps et lieu dans un bécher (500 mL) d’eau. Laver les œufs hors de fromage en remuant doucement (Figure 1 b et 1c).
- Utiliser une pipette de l’ampoule pour transférer les oeufs dans un autre bécher (500 mL) d’eau. Répéter 2-3 x pour nettoyer les oeufs.
- Utilisez la pipette de l’ampoule pour transférer des oeufs sur papier filtre (Figure 1) tout en minimisant le montant du report de l’eau.
- Couper le papier filtre noir en lanières larges comme une lame de verre et de la bande fermement sur la diapositive pour s’assurer que le document repose à plat (Figure 2 a).
NOTE : Papier filtre noir permet d’améliorer la visibilité sous le microscope en réduisant la quantité de lumière réfléchie. - Appliquez de la colle non toxique (voir Table des matières pour obtenir un exemple) pour le papier filtre dans les ridules (Figure 2 b). Garder les lignes de colle plus mince que le diamètre d’un ovule afin d’éviter les œufs recouvert de colle.
- Utilisez un pinceau fin pour déplacer doucement les oeufs WCR un de leur papier de filtre à la ligne de colle. Essayez du pondre sur la colle avant il se dessèche et garder distance au moins un œuf entre chaque oeuf.
- Maximiser l’efficacité de l’injection en plaçant plusieurs lignes d’oeufs sur un papier filtre diapositive (Figure 3).
- Une fois tous les oeufs sont disposés sur le papier filtre, attendez jusqu'à ce que toute la colle sèche avant microinjection.
Remarque : Pour transformation de la lignée germinale et génome CRISPR/Cas9-mediated édition, injecter tous les embryons avant midi (12:00) afin que le plus ancien embryon est vieux de pas plus de 19 h. Toutefois, pour RNAi, il n’y a aucun délai de prescription parce que, dans la région des Caraïbes, dsRNA peut se déplacer entre les cellules. En fait, pour RNAi, meilleurs taux de survie peuvent entraîner des embryons de vieillissement.
3. préparation du plasmide DNAs et aiguilles d’Injection
- Préparer l’ADN de plasmide surenroulé haute qualité à l’aide d’une endotoxine-free FM commerciale nécessaire (voir la Table des matières pour obtenir un exemple).
- Pour préparer la solution injectable, vérifier la concentration de chaque plasmide et ensuite combiner plasmides d’assistance (concentration finale de 250 ng/µL), plasmide donneur (concentration finale de 750 ng/µL) et tampon rouge de phénol (concentration finale de 20 %). Vortex la solution brièvement et centrifuger pendant 3 min à la vitesse maximale à précipiter les particules qui peuvent boucher l’aiguille.
- Tirez sur les aiguilles de verre borosilicate (D.I. 0,58 mm, longueur 10 cm, 1 mm de diamètre extérieur) à l’aide d’un extracteur de micropipette de type Flaming/Brown. Pour le stockage, fixer les aiguilles a tiré sur la bande adhésive double-face dans une boîte de Pétri ou autre contenant transparent.
Remarque : Pour le système d’extracteur de micropipette, les paramètres utilisés ont été : chaleur = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Remblayez l’aiguille d’injection à l’aide d’un micro-chargeur Astuce (voir Table des matières) pour pipette 0,5 - 1,0 µL vers le bas à l’intérieur de l’aiguille, près de l’extrémité effilée. Enlever les bulles de la pointe de l’aiguille si un quelconque se produit.
- Insérer l’aiguille d’injection dans le porte aiguille.
- Ouvrir la pointe de l’aiguille en coupant délicatement avec une belle paire de pinces, doucement toucher/glisser la pointe sur la lame de verre ou de la lamelle couvre-objet.
Remarque : L’objectif est d’avoir l’ouverture plus petite qui permet encore le mélange de l’injection de sortir (petites ouvertures exigent généralement la pression d’injection plus élevée). Biseauté aiguilles ne nécessitent pas cette étape car ils sont déjà ouverts.
4. la microinjection et soins après l’injection
- À l’aide d’un pinceau fin, soigneusement mouiller la surface de 1 à 3 oeufs à l’eau stérile, introduire l’aiguille et injecter la solution. Injecter chaque œuf avant que la surface ne sèche. Vous recherchez l’apparence une petite quantité de couleur rouge à l’intérieur des oeufs pendant l’injection pour indiquer la microinjection réussie. Écraser ou supprimer des œufs qui semblent endommagés, vide, ou dans le cas contraire, ne peut pas être injectés.
Remarque : Bien que la pression d’injection varie en fonction de l’aiguille perce, 10-13 psi est un bon point de départ. - Après que tous les oeufs sont injectés, retirez le papier filtre la lame de verre.
- Placer le filtre en papier sur la surface d’un plat de 1 % d’agar (décrit ci-dessus).
- Film plastique paraffine permet de sceller le plat et mettre dans un insecte de 26 ° C, incubateur d’élevage pendant 12 jours.
NOTE : Le film de paraffine afin de prévenir la contamination croisée des moisissures entre les plats. Cependant, tout autre traitement pour empêcher la croissance bactérienne pourrait réduire la survie des embryons injectées.
5. mise en culture et l’éclosion des embryons
- Commencez à regarder les embryons 12 jours après l’injection pour les larves nouvellement écloses et continuer tous les jours pendant les 2 prochaines semaines.
- Le transfert de larves, à l’aide d’une brosse fine, à une boîte d’élevage avec maïs germé et le sol.
NOTE : Moule peut s’étendre dans le plat d’agar, mais les larves écloront encore dans la plupart des cas. Recherchez les larves délicatement dans le moule pour les attraper tous. Certaines larves peuvent déplacer dans le couvercle du plat et pourraient se coincer dans la condensation. - Arrière des larves à 26 ° C, suivant la norme WCR élevage méthodes25.
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Résultats
Une considération importante lors de l’élaboration de ce protocole était le stade de développement embryonnaire à l’époque de microinjection. Transformation de la lignée germinale exige expressément, microinjection d’ADN avant cellularisation embryonnaire. C’est parce que l’ADN ne peut facilement traverser les membranes cellulaires. Tentatives pour visualiser les étapes du développement embryonnaire de BFR en utilisant un colorant nucléaire ont échoué parce que les dechorionation d’embryo...
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Discussion
Même si la microinjection de WCR avec ARN doubles brins aux fins de l’ARNi a été signalé9, il s’agit du premier protocole à établir des pratiques exemplaires pour microinjecting precellular embryons WCR, un processus essentiel pour mener la transformation de la lignée germinale et/ou CRISPR/Cas9 génome de montage chez cette espèce. Microinjection réussie d’embryons WCR est tributaire de nombreux facteurs, comme c’est l’efficacité de la transformation. Ci-dessous sont quelques-unes des principales ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention du programme de recherche connaissances Corn Rootworm Monsanto, accorde un numéro AG/1005 (pour le MDL et YC) et fonds d’amorçage au MDL de NCSU. FC a été pris en charge par des subventions du programme de recherche de Monsanto Corn Rootworm connaissances (AG/1005) et la National Science Foundation, accorder numéro MCB-1244772 (au MDL). Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés. FC et MDL conçu et créé les expériences ; FC, PW et SP effectuaient les expériences ; FC et MDL ont analysé les résultats ; et FC, NG et le MDL a écrit le manuscrit. Nous remercions Teresa O'Leary, William Klobasa et Stephanie Gorski pour leur assistance d’experts en dépistage WCR. Nous remercions également m. Wade Français (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) pour des envois d’oeufs d’établir des colonies de laboratoire et en fournissant les protocoles d’élevage.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Papier filtre qualitatif (noir) | Ahlstrom | 8613-0900 | Pour micro-injection d’œufs |
| Contenants de 1 oz ; | Anny’s Vaisselle en plastique | ASET101 | Récipient à œufs |
| Gélose Drosophile Type II | Apex | 66-103 | Substrat pour plat de ponte WCR |
| Pince poids plume ; | Bioquip | 4748 | Manipulation des larves et des nymphes |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Laver le maïs et la vaisselle |
| Trucker’s Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Maïs pour l’alimentation Système |
| micro-injection WCR (fait maison) | NA | Pièces et instructions disponibles sur demande | Contrôle la pression d’injection (0-20 psi) |
| Colle non toxique Elmer’s | Products, Inc. | E304 | Coller des œufs sur du papier filtre |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Remplissage des aiguilles |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Maïs germé /150 x 25 mm |
| Fisherbrand ; Cercles de papier filtre de qualité quantitative | Fisher Scientific | S47576C | Fabrication d’une gélose pour la ponte d’œufs/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Laver la vaisselle |
| Lames de microscope ordinaire | Fisher Scientific | 12-549-3 | Maintien du papier filtre et des œufs pour micro-injection |
| Chrysomèle des racines du maïs de l’Ouest sans substitut de pollen | Frontier Agricultural Sciences ; | F9766B | WCR régime artificiel adulte |
| Boules de coton, Grand | Genesee Scientific | 51-101 | Fermer la fiole |
| Globe Scientific 3.0 mL Pipettes de transfert à petite ampoule | Globe Scientific | 137035 | Collecter et transférer des œufs |
| Leica M165 FC Stéréomicroscope à fluorescence ; | Leica | M165 FC ; | Dépistage du BFR |
| DsRed Set de filtres pour stéréomicroscope à fluorescence | Leica | DSR | Filtre d’excitation : 510-560 nm, filtre d’émission : 590-650 nm |
| Filtre EGFP | Leica | GFP2 | Filtre d’excitation : 440&ndash ; 520 nm, filtre anti-émissions : 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage pour colonie adulte |
| Pinceau miniature | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 ; |
| Micromanipulateur à manette | Narishige | MN-151 | Micromanipulateur et porte-aiguille |
| Microscope Platine XY Platine | Olympus | 265515 | Scène de microscope (adaptée pour une utilisation avec stéréoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | Pour la ponte |
| Film de paraffine en plastique ; | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Sceller la guérisse après microinjection/Rouleau 4 po x 125 pi |
| Incubateur | Percival Percival ; | I41VLH3C8 | WCR chambre de culture (incubateur d’élevage d’insectes) |
| Erlenmeyer à bouche étroite Flacons | VWR | 4980-300-PK | Réservoir d’eau pour colonie d’adultes ; |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | Pour la dorure à l’œuf |
| Rouleaux de coton tressé | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Utilisation dans l’approvisionnement en eau d’une colonie d’adultes |
| Boîtes de Pétri (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | Pour plaques diététiques |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Tampon de micro-injection |
| Extracteur de micropipiette à base laser | Instrument Sutter | P-2000/G | Extracteur d’aiguille/Chaleur = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Couche arable | The Scotts Company | 71130758 | Sol pour la culture |
| du cronReloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Sac de gélose après microinjection/5x7 |
| Boîtes de Pétri (100x15m) | VWR | 89038-968 | Fabrication de gélose pour la ponte d’œufs/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR chambre d’accouplement à paire unique ; |
| Conteneurs de 38 oz | Webstaurantstore | 128NC888 | Boîte d’élevage de larves/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Conteneur de charcuterie en plastique translucide micro-ondable | Webstaurantstore | 128HRD16 | Boîte d’élevage de larves/16 oz |
| Portée de micro-injection ; | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Lunette de micro-injection équipée d’une platine XY |
| Standard Capillaires en verre | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Aiguilles de micro-injection |
| Chrysomèles adultes du maïs occidental Recherche | centrale nord Laboratoire | Souche non diapase | Demande du laboratoire du Dr Bryan Wade French |
| Kit Midi ADN plasmidique | Qiagen | 12143 | Purification d’ADN plasmidique prêt à l’injection |
Références
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Réimpressions et autorisations
