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Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

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DOI :

10.3791/57514

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22 mai 2018

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1Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, 2Tianjin Agricultural University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à décrire l’isolement vésicules extracellulaires (EVs) en milieu de cultivés in vitro des adultes Schistosoma japonicum.

Résumé

Vésicules extracellulaires (EVs) sont des vésicules membranaires libérés par une variété de cellules dans le microenvironnement extracellulaire. Véhicules électriques représentent une population de vésicules hétérogènes, dont calibre compris entre 40 et 1 000 nm. Données accumulées ont indiqué que EVs jouent un rôle réglementaire important dans les interactions hôte-pathogène. Une compréhension profonde du schistosome SVE doit donner un aperçu les mécanismes qui sous-tendent les interactions de schistosomes-hôte, permettant ainsi le développement de nouvelles stratégies de lutte contre la schistosomiase. Ici, nous visons à étudier davantage les fonctions EVs dans schistosomes en présentant un protocole pour l’isolement et la caractérisation des véhicules électriques du adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs ont été isolées in vitro milieu de culture par centrifugation, combinée avec un kit d’isolation exosome commerciale. L' isolé S. japonicum EVs (SjEVs) généralement posséder un diamètre de 100 à 400 nm et sont caractérisées par la microscopie électronique à transmission et transfert Western. L’utilisation de PKH67 dye-labeled SjEVs a démontré que les SjEVs sont internalisés par les cellules réceptrices. Dans l’ensemble, notre protocole fournit une méthode alternative pour isoler l’EVs de schistosomes adultes ; la SjEVs isolée peut être adapté à l’analyse fonctionnelle.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont une population de petites vésicules membranaires encapsulé avec diverses protéines, lipides et acides nucléiques. Des études récentes ont démontré que EVs jouent un rôle crucial dans la communication de cellule-cellule et sont impliquées dans la régulation de nombreux processus physiologiques, y compris le développement cellulaire, régulation immunitaire, angiogenèse et cell migration2, 3,4,5. Accumulation de preuves indique que EVs, diffuser les exosomes et leur cargaison de miRNA représentent des biomarqueurs potentiels de certaines maladies6.

Plusieurs des protozoaires tels que Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziet Leishmania spp., auraient dû être divulgués pour pouvoir sécréter EVs ; helminthes ont en outre été découverts à sécréter des EVs en vie accueille7. EVs parasitaires ont démontré d’être impliqués dans le maintien de l’infection, pathogénicité8et9de la régulation immunitaire. Récentes études sur les schistosomes deux Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 et S. japonicum12 ont indiqué que les schistosomes adultes sécrètent exosome-comme des vésicules qui peuvent être impliqués dans la réglementation fonctionnelle des processus biologiques spécifiques.

A ce jour, plusieurs méthodes ont été utilisées pour isoler des vésicules extracellulaires, telles que l’ultracentrifugation, ultrafiltration13, l’utilisation de réactifs à base de polymère, chromatographie d’exclusion et l’isolement d’immuno-affinité. Ces différentes méthodes possèdent leurs propres avantages et limitations14. En règle générale, ultracentrifugation est considérée comme la méthode de l’étalon-or pour l’isolement de la vésicule. Toutefois, cette méthode souffre de la limitation de potentiel EV agrégation14.

Dans schistosomes, deux méthodes ont été signalés pour l’isolement de l’EV : il s’agit d’ultracentrifugation11,12,10 et l’utilisation commerciale EV isolation kit16 pour plusieurs stades (œufs,16, schistosomula11, schistosomes adultes10,12,,17). Étant donné que microvésicules sont d’une large gamme de taille de quelques nanomètres de cent à mille nanomètres, nous avons développé une méthode alternative qui associe l’utilisation d’un kit d’isolation commercial EV pour isoler le SVE de centrifugeuse de paillasse et ultrafiltration adultes de Schistosoma japonicum. Le SVE isolé en général possède un diamètre de 100 à 400 nm et ont été avec succès internalisé par les cellules réceptrices.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité d’éthique local de l’Institut de recherche vétérinaire de Shanghai, Académie chinoise des Sciences agricoles (numéro de permis : SHVRIAU-14-0101).

1. la Culture in Vitro des Schistosomes

Remarque : Schistosomes représentent un danger biologique. Travailleurs devraient porter des gants en latex à tous les temps quelle manipulation vers, des suspensions faites ou autres associés biomatériaux. Lapins de Nouvelle-Zélande abritaient des cercaires ~ 2 000 via abdominale exposition. Schistosomes au stade hépatique ont été recueillis de lapins infectés par S. japonicum cercaires à 28 jours après l’infection par la perfusion du foie et les veines mésentériques. Les procédures de collecte de ver ont été référencés dans des publications antérieures, rapports d’études chez la souris18.

  1. Recueillir les parasites dans un bécher de 500 mL. Laver soigneusement et doucement 3 x 200 ml de réchauffé (37 ° C) PBS (pH 7,4).
  2. Séparer les paires de ver ~ 200 pour chaque boîte de Pétri 90 mm. Puis laver les parasites soigneusement et doucement 2 x avec 50 mL de réchauffé RPMI 1640 milieu de culture contenant 100 U de pénicilline et de 100 mg/mL de streptomycine (37 ° C).
  3. Maintenir les parasites dans 40 mL de milieu de culture RPMI 1640 préchauffé sans antibiotiques à 37 ° C, moins de 5 % de CO2 à une densité de ver ~ 5 paires/ml pendant 2 h à 90 mm Petri dish.
    Notes : Le milieu RPMI 1640 ne doit pas contenir sérum, sinon des vésicules extracellulaires exogène seront mis en place.

2. pré-traité Condition Media

  1. Récupérer le milieu de culture et puis centrifuger le milieu à 4 ° C à 2 000 × g pendant 30 min retirer les œufs et les débris tegmentale à vis sans fin.
  2. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et puis filtrer la solution à l’aide d’une seringue-filtre de 0,22 µm.
  3. Recueillir la solution filtrée dans un sac dialysée (seuil de poids moléculaire : 3.5kD) et puis dialyser la solution en utilisant la solution 8 % PEG8000 à 4 ° C durant la nuit.
    Notes : Cette étape est importante pour enrichir SjEVs pour augmenter le rendement d’isolement SjEVs.

3. isolement de SjEVs

  1. Transférer la solution dialysée dans un nouveau tube et puis ajouter 0,5 volumes du réactif exosome total isolement.
  2. Mélanger la solution bien de Vortex ou de pipetage de haut en bas afin de garantir l’homogénéité de la solution.
  3. Incuber le mélange à 2 ° C à 8 ° C pendant la nuit.
  4. Centrifuger le mélange à 15 000 × g pendant 1 h à 2 ° C à 8 ° C.
  5. Aspirer et éliminer le surnageant.
    Notes : SVE figurent dans le culot en bas du tube (non visible dans la plupart des cas).
  6. Resuspendre le culot d’EVs dans 2 mL de PBS et ensuite stocker la solution EVs à-80 ° C jusqu'à ce qu’une analyse plus approfondie.

4. caractérisation des EVs Western Blot

  1. Déterminer la concentration de protéines de l’échantillon de SjEVs, par exemple, par dosage de la BCA.
  2. Préparer 10 à 20 µg d’EVs à 22,5 µL de tampon de RIPA. Puis ajouter 7,5 µL de 4 x chargement de tampon et la chaleur pendant 5 min à 95 ° C.
  3. Séparer des protéines SjEVs par 12 % sur gel SDS-PAGE.
  4. Transférer les protéines de membrane de PVDF et puis sonde avec anticorps anti-CD63 (1:1, 000 dilution), suivis en sondant avec anti-lapin IgG-HRP (1:5, 000 de dilution).
  5. Utiliser le réactif de détection ECL pour le développement de la membrane et détecter les signaux par une système d’imagerie de la chimiluminescence.

5. caractérisation des EVs par microscopie électronique à Transmission

  1. Ajouter 2 µL de SjEVs isolé à 200 mesh enduit formvar grilles et puis laissez-les sécher à température ambiante.
  2. Tache avec 2 % d’acide phosphotungstique pendant 1 min et puis laissez-les sécher à température ambiante.
  3. Charger les grilles sur le porte-échantillon du microscope électronique à transmission et exposé à un faisceau d’électrons 80 kV pour la capture d’image.

6. SjEVs Label avec PKH67 et analyse de l’absorption de cellules

Notes : Toutes les étapes subséquentes ont été effectuées à température ambiante (20-25 ° C), sauf indication contraire.

  1. Transférer 5 µg SjEVs solution dans un tube en polypropylène à fond conique et régler le volume à 12 mL par adjonction de ce milieu RPMI 1640.
  2. Centrifuger le SjEVs à 110 000 × g pendant 90 min à 4 ° C pour SjEVs à pellets.
  3. Après centrifugation, soigneusement aspirer le surnageant.
    Remarque : Le colorant dans l’éthanol de PKH67 ne doit pas être ajouté directement au culot chadhouli, comme cela se traduirait par une coloration hétérogène et la viabilité cellulaire réduite.
  4. Préparer une solution de Suspension EV 2 x en ajoutant 1 mL de diluant C au culot chadhouli ; pour assurer la dispersion totale, resuspendre avec douceur de pipetage.
  5. Juste avant la coloration en diluant C, préparer une douce 2 x Solution de colorant en ajoutant 2 µL de la solution éthanolique de colorant de PKH67 à 1 mL de diluant C dans un tube à centrifuger en polypropylène et en mélangeant bien pour disperser.
  6. Rapidement ajouter le 1 mL x 2 EV Suspension (étape 6.4) à 1 mL de 2 x Solution de colorant (étape 6.5) et immédiatement mélanger l’échantillon de pipetage.
  7. Incuber le mélange à température ambiante pendant 4 min.
  8. Arrêter la coloration en ajoutant 4 mL de FBS et puis incuber pendant 1 min.
  9. Ajouter RPMI1640 moyen pour régler le volume à 12 mL et puis centrifuger à 110 000 × g à 4 ° C pendant 90 min.
  10. Retirez le surnageant et ajouter RPMI1640 moyen pour remettre en suspension les PKH67 étiqueté chadhouli granulés.
  11. Centrifuger à 110 000 × g à 4 ° C pendant 90 min laver une fois puis ajouter PBS pour remettre en suspension les granules de SjEVs.

7. analyse de l’absorption de cellules SjEVs

  1. Cellules de mammifères de graines comme le NCTC cloner 1469 cellules ou cellules HEK293T en plaques 6 puits (2 × 105 cellules / puits) et culture les cellules pendant la nuit.
  2. Ajouter 5 µg SjEVs PKH67 marqué et ensuite la culture des cellules à 37 ° C pendant 2 à 4 h.
  3. Après incubation, enlever le milieu et laver les cellules avec du PBS.
  4. Fixer les cellules avec une solution de formaldéhyde de 4 % pendant 15 minutes et laver deux fois plus avec du PBS.
  5. Tacher les noyaux des cellules au 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
  6. Observer les cellules à l’aide de la microscopie de fluorescence.

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Résultats

Afin de quantifier le rendement de SjEVs isolé en utilisant le protocole décrit, nous avons utilisé dosage protéique BCA pour accéder le taux protéique de la SjEVs isolée de schistosomes adultes de 28 jours. Comme indiqué dans le tableau 1, la concentration de protéine chadhouli variait entre 208 µg et 250 µg / 100 mL de milieu (tableau 1). La taille des particules, tel que déterminé par analyse de nanoparticules de Malvern, a indiqué que le SjEVs isolés ...

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Discussion

Des études récentes sur les EVs ont démontré que schistosome Qu'evs jouent un rôle important dans host-pathogen interactions3,9,12,16. Afin de répondre leurs fonctions de régulation, il est essentiel d’isoler le SVE de schistosomes. Nous décrivons ici une autre méthode d’isolement chadhouli. Cette méthode génère une taille de large gamme de SjEVs, de 100 nm à 400 nm, en adulte S. japonicum<...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été, en partie ou en totalité, soutenu par la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (31472187 et 31672550) et The Agricultural Science et Technology Innovation Program de l’Académie chinoise des Sciences agricoles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Material
Réactif d’isolement total des exosomes (à partir de milieux de culture cellulaire)ThermoFisher SCIENTIFIC4478359Pour isoler les vésicules extracellulaires de S. japonicum
PKH67Sigma-aldrichMINI67Pour l’étiquetage Evs
RPMI 1640 MediumThermoFisher SCIENTIFIC11875119Pour la culture de parasites
Pénicilline-streptomycineThermoFisher SCIENTIFIC15140122
0,22&mu ; m filtre pour seringueMerckSLGP033RB
SnakeSkin Tube de dialyseThermo SCIENTIFIC68035
PEG8000Sangon BiotechA100159  ;
RIPABeyotimeP0013B
EMD Millipore&trade ; Immobilon & commerce ; Substrat HRP chimiluminescent occidental (ECL)Fisher scientificWBKLS0100  ;
DAPICell Signaling Technology4083
BCA kitBeyotimeP0010
CD63 anticorpsSangon BiotechD160973-0025
PVDFBio-Rad1704273
Formvar/Carbon 400 meshTed Pella01754-F
Acide phosphotungstiqueTed Pella19402
anti-souris IgG-HRPCWBIOCW0102
NCTC clone 1469 cellulesATCCATCC® ; CCL-9.1 et commerce ;
FBSHyCloneSV30087.02
Equipments
GE Système d’imagerie par chimioluminescanceGEImageQuant LAS4000mini
Microscopie électronique à transmissionHitachiH-7600
Milli-Q eau Milli-QMilli-Q Elix
Eppendor Centrifugeuse  ;Centrifugeuse Eppendorf5804R
Zetasizer NanoMalvernZetasizer Nano ZS  ;
UltracentrifugeuseBeckmanOptima L-100 XP Incubateur d’ultracentrifugeuses
ESCOCCL-107B
MicroscopeZeissZeiss Axin Observer Z1

Références

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