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Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

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DOI :

10.3791/57518

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30 avril 2018

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1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.

Résumé

Les répétitions de palindromes régulièrement intercalées en cluster (CRISPR) - CRISPR - protéine 9 (Cas9) système de défense immunitaire adaptative procaryotes a été coopté comme un outil puissant pour l’ingénierie des génomes eucaryotes précise associée. Nous présentons ici une méthode rapide et simple à l’aide de guide unique chimérique RNAs (sgRNA) et CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines (RNP) pour la production efficace et précise de génomique des mutations ponctuelles chez c. elegans. Nous décrivons un pipeline pour sélection cible sgRNA, conception de modèle de réparation axés sur l’homologie (HDR), complexants CRISPR-Cas9-RNP et livraison et une stratégie de génotypage permettant l’identification rapide et fiable des animaux correctement édité. Notre approche non seulement permet la génération facile et l’identification du point désiré de génomique des animaux mutants, mais facilite également la détection d’autres allèles indel complexe en environ 4-5 jours avec un rendement élevé et une charge de travail réduite.

Introduction

Les progrès technologiques récents ont radicalement transformé et accéléré la capacité à précisément les génomes ingénieur. En particulier, le système CRISPR-Cas9, qui repose sur l’endonucléase guidée RNA Cas9 pour induire une rupture double brin (DSB) près de la séquence cible des intérêts, a été largement utilisé à l’ingénieur avec précision le génome de la plupart des organismes modèles utilisés en recherche biomédicale1,2,3,4. Significativement, l’utilisation de CRISPR-Cas9 a débloqué génome édition même en difficiles espèces comme c. elegans5. Peu importe l’espèce, générant des mutations ponctuelles avec le génome CRISPR-Cas9 basé système d’édition s’appuie sur trois éléments de base : 1) Cas9 endonucléase, 2) un seul guide d’ARN (sgRNA) qui dirige l’endonucléase Cas9 à une séquence cible et 3) un utilisateur conçu modèle de réparation axés sur l’homologie (HDR) contenant l’edit(s) désiré d’intérêt2.

Il existe plusieurs méthodes qui peuvent servir à introduire le ciblage sgRNA et Cas9 nucléase dans les cellules, y compris le plasmide, d’ARN et de méthodes de prestation virale6. Récemment, livraison directe de pre-complexé sgRNA-Cas9 ribonucléoprotéines (RNP) a émergé comme un outil puissant et efficace dans le génome CRISPR dotés de Cas9 édition7. La prestation directe de pre-complexé CRISPR-Cas9 RNP a plusieurs avantages distincts, à savoir : 1) RNP contourner la nécessité pour la transcription cellulaire et de traduction, RNP 2) sont rapidement éliminé, ce qui peut augmenter la spécificité en réduisant le temps disponible pour hors-cible clivage et 3) RNP ne contenir aucun élément d’ADN/ARN étranger qui contourne l’introduction des séquences non indigènes dans le génome hôte grâce à l’intégration au hasard. Ensemble, ces attributs susceptibles de fournissent une courte rafale de sur-cible CRISPR édition tout en minimisant les effets hors cible.

Les auteurs décrivent un protocole simple et efficace pour introduire des changements génomiques chez c. elegans. Ce protocole comprend ciblage sgRNA et unique oligonucléotide échoués (ssODN) HDR modèle conception, complexants RNP sgRNA-Cas9 et livraison et une stratégie de génotypage pour l’identification sans équivoque des animaux bien édité. En utilisant cette stratégie, non seulement les modifications spécifiques souhaitées peuvent être récupérées, mais autres mutations non-spécifiques indel peuvent aussi être récupérées. Ainsi, notre stratégie permet la génération d’une série allélique à l’aide d’une stratégie unique, où les deux allèles mono, bi-alléliques et indel mutants peuvent être générés dans la génération de1 F.

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Protocole

Tous les soins des animaux et des procédures expérimentales a suivi la ligne directrice de la National Institutes of Health et l’Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) à l’Université du Michigan. Utiliser des solutions sans RNase et Pipeter conseils tout au long du protocole. Nettoyer la zone de travail, pipettes, tubes et centrifugeuse avec solution de décontamination de RNase en suivant les directives du fabricant (voir Table des matières).

1. sgRNA sélection de la cible

  1. À l’aide d’un navigateur web, ouvrez la page Web : http://crispor.tefor.net8
    1. Entrée ~ 60 paires de bases (PB) de séquence flanquant la modification désirée d’intérêt (c.-à-d. 30 bp 5' et 3' de l’édition souhaitée).
    2. Dans le menu déroulant, sélectionnez le génome de Caenorhabditis elegans .
    3. Sélectionnez le Motif Adjacent de Protospacer (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) dans le menu déroulant.
    4. Cliquez sur soumettre. Dans la page de résultats, choisissez la séquence cible de rang supérieur le plus proche de l’édition d’intérêt. S’il n’y a aucun site cible approprié au sein de la séquence d’entrée bp 60 flanquement, développez la séquence requête jusqu'à 100 bp (edit de part et d’autre de la désiréec'est-à-dire 50 bp).
  2. Provenant d’une source disponible, par exemple synthego, obtenir un 20-mer cible sgRNA avec les caractéristiques suivantes : 3 nmol ; aucune modification.
  3. Dès réception, centrifuger sgRNA lyophilisé contenant un tube à > 12 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Ajouter 60 µL de TE exempte de nucléase dans le tube et doucement une nouvelle suspension de pipetage et descendre de 15 à 20 fois à l’aide d’une pipette de P200. La concentration finale est 50 µM.

2. conception de modèle de réparation homologie dirigée

  1. Concevoir un ssODN HDR modèle contenant : 1) la mutation d’intérêt, 2) un site unique dans le cadre l’endonucléase de restriction, 3) une mutation silencieuse d’un ou deux de la Gs au sein de la séquence NGG PAM et 4) 50 bp 5' et 3' homologie armes flanquant la première et la dernière mutation. (Figure 1) 9 , 10.
    1. Si la mutation de la séquence NGG PAM n’est pas possible, introduire 5-6 silence mutations au sein de la séquence cible de reconnaissance de sgRNA pour empêcher le clivage induite par le sgRNA du modèle HDR ssODN.
  2. Provenant d’une source disponible, par exemple idtdna, obtenir un « oligonucléotide ADN Ultramer » avec les paramètres suivants : échelle : 4 nmol ; Formulation : None ; Purification : Standard dessalage.
  3. Dès réception, centrifuger ssODN lyophilisé contenant un tube à > 12 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Doucement une nouvelle suspension ssODN à une concentration finale de 100 µM dans ddH exempte de nucléase2O en pipettant également, haut et bas de 15 à 20 fois à l’aide d’une pipette de P200.

3. conception des amorces génotypage

  1. Concevoir une amorce réglée flanquant la modification du génome pour déclencher un ~ 400-700 bp PCR amplicon11.
  2. Optimiser les conditions de cyclisme de PCR pour produire un amplicon unique et spécifique à11.

4. préparer le mélange de l’Injection

  1. Centrifuger 1 Table réactifs à vitesse maximale pendant 2 min à 4 ° C.
  2. Dans l’ordre indiqué, ajouter 1 Table réactifs dans un tube PCR exempte de nucléase.
  3. Bien mélanger par doucement pipetage haut en bas 10 fois avec une pipette P20.
  4. Incuber le mélange d’injection pendant 10 min à température ambiante.

5. protocole d’injection

  1. Charger la micropipette d’injection avec environ la moitié du mélange injection12. Sauver le restant de mélange d’injection dans le cas où l’aiguille d’injection obstrue ou se brise.
  2. Casser la pointe une micropipette afin qu’environ 20-30 lb/po2 produise une progressive de la solution fluide12.
    NOTE : Conseils de diamètre plus grands négativement affectent la santé animale et diminuent le rendement des descendances F1 .
  3. Injecter 10 à 15 jeunes adultes vers de terre dans les deux bras gonadiques si possible12. Si ce n’est pas le cas, l’injection dans un bras gonadique est suffisante.
  4. Qu’injecté animaux (P,0) puissent récupérer pendant 1-2 h à température ambiante sur une plaque de médias (NGM) croissance nématode graines OP50 35 mm. Par la suite, injecté P0 animaux aux plaques de NGM individuels graines OP50 35 mm à l’aide d’un ver fil de platine choisir12.

6. écran P0 plaques et unique mCherry(+) F1s

  1. Deux jours après injection, identifier les plaques de0 P contenant des descendants de1 F exprimant mCherry dans le pharynx à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent (Figure 1, jour 2 - 3). Choisissez des plaques de0 3 P qui contiennent les plupart des mCherry(+) F1 animaux.
  2. Dans chacune des trois sélectionnés P0 plaques, unique 8-12 mCherry(+) F1 animaux pour un total de 24-36 mCherry(+) F1s à l’aide d’un ver prélever (Figure 1, jour 2 - 3).
    Remarque : mCherry(-) animaux peut également être distingué de ces plaques de0 P, mais la probabilité d’identifier correctement édité animaux est beaucoup inférieur (Figure 2 a).
  3. Permettre aux individuels F1s pour auto-fécondent et pondent leurs œufs pendant 1 à 2 jours à température ambiante.

7. simple ver PCR et génotypage

  1. Après 1 à 2 jours de la ponte, transférer la F1s dans les couvercles sur le tube de barrette de la PCR individuels contenant 7 µL de tampon de lyse ver à l’aide d’une pique de ver (tableau 2, Figure 1, jour 4-5).
  2. Tubes à centrifuger PCR à vitesse maximum pendant 1 min à température ambiante pour apporter des animaux jusqu’au fond du tube et geler les tubes à-80 ° C pendant 1 h.
    Remarque : Les vers peuvent être stockés indéfiniment à-80 ° C.
  3. Lyse vers congelés dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant : 60 ° C pendant 60 minutes, 95 ° C pendant 15 min, 4 ° C tenir.
  4. Set-up PCR mastermix comme indiqué dans le tableau 3.
  5. Ajouter 21 µL de mastermix PCR dans des tubes PCR clean et puis ajoutez 4 µL de la lyse de la vis sans fin de l’étape 3. Mélangez bien à l’aide d’une pipette et exécuter le programme PCR en suivant les directives du fabricant (voir Table des matières).
  6. Purifier les réactions de PCR à l’aide d’un kit ADN pur et concentré, suivant les instructions du fabricant (voir Table des matières). Éluer ADN en ajoutant 10 µL d’eau à la colonne.
  7. Mastermix d’enzyme de restriction mise en place comme indiqué dans le tableau 4.
  8. Ajouter 10 µL de l’enzyme de restriction mastermix dans chaque réaction de PCR nettoyée et incuber pendant 1-2 h à 37 ° C13.
  9. Separate digérés produits PCR sur un gel d’agarose de 1,5 % à 120 V à l’aide de 1 x du tampon Tris-acétate-EDTA (TAE)14.

8. identification et vérification de la séquence des animaux édité

  1. Examiner des échantillons d’enzyme de digestion pour la présence de bandes qui indiquent le potentiel édité animaux14 (Figure 1, jour 4-5).
    Remarque : Placez un contrôle N2 pour identifier les mutations indel potentiels qui peuvent être observées comme des changements dans la taille de bande et/ou inattendue et complexe enzyme de restriction digestion, profils de bandes.
  2. Après avoir identifié les éventuels animaux édité, utiliser le reste 3 µL de lyse ver et répétez la réaction PCR. Ne pas nettoyer ou restriction enzyme digérer la réaction PCR, une fois le programme terminé. Charger la réaction PCR sur un gel d’agarose à 1 %, séparé et extraire la bande en utilisant un gel extraction kit15 (voir Table des matières).
  3. Gel de Sanger séquence16 extrait l’ADN à l’aide de l’apprêt de F1 pour identifier les animaux correctement modifié (Figure 1 a)
    NOTE : Hétérozygote lectures contiendra recouvert de pics en raison de la présence de la souche sauvage et machiné allèle.
  4. Pour obtenir animaux homozygotes vérifiées animaux hétérozygotes édité, unique 8-122 animaux et effectuez les étapes 7 et 8.

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Résultats

Mutations humaines superoxyde dismutase 1 (SOD1) représentent environ 10 à 20 % de genetique latérale amyotrophique, une maladie neurodégénérative dévastateur qui mène invariablement à la paralysie et la mort de17. SOD-1 humain est une protéine évolutivement conservée partage 55 % d’identité et 70 % de similarité avec la protéine de SOD-1 c. elegans (Figure 1 b). Afin de démontrer la simplicité, la faisabilité et l’ef...

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Discussion

Le système CRISPR-Cas9 est un outil puissant et efficace pour justement modifier le génome d’organismes modèles. Ici, nous démontrons que chimérique sgRNAs20 couplé avec ssODN HDR modèles permettent la génération très efficace de génomique des mutations ponctuelles chez c. elegans. Ce qui est important, nous démontrons que livraison RNP produit haute efficacité édition lorsque la fluorescence est utilisé comme marqueur de sélection Co, mettant en évidence la facilité et la fiabilité de la...

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Déclarations de divulgation

Nous remercions les membres du laboratoire Beg pour une lecture critique de ce manuscrit. Les souches ont été fournis par le centre de génétique de Caenorhabditis , qui est financé par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Recherche dans le laboratoire de Beg est pris en charge par des subventions du NIH (R01 NS094678) et Muscular Dystrophy Association (MDA382300) à A.A.B.

Remerciements

Il n’y a aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CRISPRevolution sgRNA  ; EZ KitSynthego Inc.ARNsg chimérique
sans nucléase TESynthego Inc.fourni avec le kit sgRNA EZ kit
Eau sans nucléaseSynthego Inc.fourni avec le kit sgRNA EZ kit
4 nmole Ultramer DNA OligoIntegrated DNA TechnologiesssODN HDR template
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies1078728Cas9 protein
pCFJ90  ;Addgene19327Pmyo-2 ::mCherry Marker Plasmide
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
ADN Clean & ConcentrateurZymo ResearchD4004
Zymoclean Gel Kit de récupération d’ADNZymo ResearchD4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BiolabsM0494L
Proteinase KSigmaP2308
Verre Borosilicate MicropipettesSutter InstrumentsBF100-78-10OD : 1.0mm. ID : 0.78mm
Chlorhydrate TrizmaSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNaseZap Solution de décontaminationFisher ScientificAM9780

Références

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Mots-clés

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