Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.
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Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.
Les répétitions de palindromes régulièrement intercalées en cluster (CRISPR) - CRISPR - protéine 9 (Cas9) système de défense immunitaire adaptative procaryotes a été coopté comme un outil puissant pour l’ingénierie des génomes eucaryotes précise associée. Nous présentons ici une méthode rapide et simple à l’aide de guide unique chimérique RNAs (sgRNA) et CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines (RNP) pour la production efficace et précise de génomique des mutations ponctuelles chez c. elegans. Nous décrivons un pipeline pour sélection cible sgRNA, conception de modèle de réparation axés sur l’homologie (HDR), complexants CRISPR-Cas9-RNP et livraison et une stratégie de génotypage permettant l’identification rapide et fiable des animaux correctement édité. Notre approche non seulement permet la génération facile et l’identification du point désiré de génomique des animaux mutants, mais facilite également la détection d’autres allèles indel complexe en environ 4-5 jours avec un rendement élevé et une charge de travail réduite.
Les progrès technologiques récents ont radicalement transformé et accéléré la capacité à précisément les génomes ingénieur. En particulier, le système CRISPR-Cas9, qui repose sur l’endonucléase guidée RNA Cas9 pour induire une rupture double brin (DSB) près de la séquence cible des intérêts, a été largement utilisé à l’ingénieur avec précision le génome de la plupart des organismes modèles utilisés en recherche biomédicale1,2,3,4. Significativement, l’utilisation de CRISPR-Cas9 a débloqué génome édition même en difficiles espèces comme c....
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Tous les soins des animaux et des procédures expérimentales a suivi la ligne directrice de la National Institutes of Health et l’Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) à l’Université du Michigan. Utiliser des solutions sans RNase et Pipeter conseils tout au long du protocole. Nettoyer la zone de travail, pipettes, tubes et centrifugeuse avec solution de décontamination de RNase en suivant les directives du fabricant (voir Table des matières).
1. sgRNA sélection de la cible
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Mutations humaines superoxyde dismutase 1 (SOD1) représentent environ 10 à 20 % de genetique latérale amyotrophique, une maladie neurodégénérative dévastateur qui mène invariablement à la paralysie et la mort de17. SOD-1 humain est une protéine évolutivement conservée partage 55 % d’identité et 70 % de similarité avec la protéine de SOD-1 c. elegans (Figure 1 b). Afin de démontrer la simplicité, la faisabilité et l’ef.......
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Le système CRISPR-Cas9 est un outil puissant et efficace pour justement modifier le génome d’organismes modèles. Ici, nous démontrons que chimérique sgRNAs20 couplé avec ssODN HDR modèles permettent la génération très efficace de génomique des mutations ponctuelles chez c. elegans. Ce qui est important, nous démontrons que livraison RNP produit haute efficacité édition lorsque la fluorescence est utilisé comme marqueur de sélection Co, mettant en évidence la facilité et la fiabilité de la.......
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Nous remercions les membres du laboratoire Beg pour une lecture critique de ce manuscrit. Les souches ont été fournis par le centre de génétique de Caenorhabditis , qui est financé par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Recherche dans le laboratoire de Beg est pris en charge par des subventions du NIH (R01 NS094678) et Muscular Dystrophy Association (MDA382300) à A.A.B.
Il n’y a aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| CRISPRevolution sgRNA ; EZ Kit | Synthego Inc. | ARNsg chimérique | |
| sans nucléase TE | Synthego Inc. | fourni avec le kit sgRNA EZ kit | |
| Eau sans nucléase | Synthego Inc. | fourni avec le kit sgRNA EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 ; | Addgene | 19327 | Pmyo-2 ::mCherry Marker Plasmide |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| ADN Clean & Concentrateur | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel Kit de récupération d’ADN | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Verre Borosilicate Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD : 1.0mm. ID : 0.78mm |
| Chlorhydrate Trizma | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Solution de décontamination | Fisher Scientific | AM9780 |
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