Article de méthode

Toeprinting analyse de Translation Initiation complexe formé sur l’ARNm chez les mammifères

DOI :

10.3791/57519

⸱

10 mai 2018

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Alberta RNA Research and Training Institute, University of Lethbridge, 2Department of Neuroscience and the Canadian Centre for Behavioral Neuroscience (CCBN), University of Lethbridge, 3Arnie Charbonneau Cancer Institute, University of Calgary

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toeprinting a pour but de mesurer la capacité de in vitro transcrit RNA pour former des complexes initiation traduction de ribosomes dans une variété de conditions. Ce protocole décrit une méthode pour toeprinting ARN chez les mammifères et peut être utilisé pour étudier la traduction fois cap-dépendante et pilotée par l’IRES.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Initiation de la traduction est l’étape limitante de la synthèse protéique et représente un point essentiel au cours de laquelle les cellules régulent leur production de protéines. Régulation de la synthèse de la protéine est la clé de la réponse cellulaire au stress, et le dérèglement est au cœur de nombreux états pathologiques, comme le cancer. Par exemple, bien que le stress cellulaire entraîne l’inhibition de la traduction globale par atténuation dépendante de PAC initiation, certaines protéines de la réponse au stress sont sélectivement traduits d’une manière indépendante du cap. Discrets éléments régulateurs de RNA, tels que les sites d’entrée cellulaire ribosome interne (IRESes), permettant la traduction de ces ARNm spécifiques. Identification de ces ARNm et la caractérisation de leurs mécanismes de régulation, ont été un domaine essentiel en biologie moléculaire. Toeprinting est une méthode pour l’étude de structure d’ARN et de la fonction en ce qui touche à l’initiation de la traduction. Toeprinting vise à évaluer la capacité du in vitro transcrit RNA pour former des complexes stables avec des ribosomes dans une variété de conditions, afin de déterminer quelles séquences, éléments structuraux ou accessoires facteurs sont impliqués dans les ribosomes lie — un précurseur pour l’initiation de la traduction efficace. Aux côtés d’autres techniques, telles que l’analyse occidentale et le polysome profilage, toeprinting permet une caractérisation fiable des mécanismes de la régulation de l’initiation de la traduction.

Introduction

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Comme traduction consomme de l’énergie plus cellulaire, il est logique que la traduction est étroitement réglé1. À l’inverse, le dérèglement de la traduction- et les altérations qui en résulte dans la production de protéine-est souvent observée aux réponse au stress et la maladie, comme le cancer1,2. Un avantage majeur de contrôle de la traduction est la vitesse avec laquelle les cellules peuvent modifier leur production de protéines afin de répondre aux divers stimuli3. Règlement de traduction représente donc un mécanisme important qui peut influer sur la survie des cellules et la mort1,2,3. Les étapes de la traduction, l’initiation est la plupart très réglementé et complexe3. Brièvement, l’ARNm eucaryotes plus contiennent une 5' m7G PAC est presque toujours indispensable pour leur traduction. Initiation PAC-dépendant nécessite initiation eucaryote facteurs eIF4E, eIF4G et eIF4A (le complexe de cap-reconnaissance) pour interagir avec l’extrémité 5' de l’ARNm. 43 s pré-initiation ribosome complex, qui contient eIF2 lié aux initiateur tRNA et eIF3, est recruté à l’extrémité 5' de l’ARNm via une interaction entre eIF4G et eIF3. La complexe de pré-initiation est pensée pour numériser des ARNm, aidé par eIF4A (une hélicase de RNA) jusqu'à ce que le codon de début (AUG) se trouve. La complexe d’initiation de 48 s est formée par la suite et l’ARNt est livré dans le site P du ribosome. Enfin, les sous-unités de ribosomes 60 s et 40 s sont Unies pour former la complexe, d’initiation 80 s suivi de translation élongation1,3,4. En revanche, les sites d’entrée des ribosomes interne (IRESes) contournement l’exigence pour un plafond de 5' en recrutant la sous-unité ribosomique 40 s directement à l’initiation codon3. Conditions de stress physiologique atténuent traduction ARNm globale en raison de modifications des facteurs d’initiation eucaryote générales clés (SIFE). Cependant, mécanismes d’initiation de traduction non canoniques permettant la traduction sélective de certains ARNm qui souvent codent pour des protéines de la réponse au stress, et le dérèglement de l’initiation de la traduction non canonique est impliqué dans des États de maladie comme le cancer 1 , 2. éléments régulateurs RNA discrets, tels que IRESes cellulaires, permettant la traduction de ces ARNm2,3.

Un aspect particulièrement intéressant de contrôle de la traduction est de comprendre les mécanismes de canonique versus non canonique traduction d’un ARNm donnée. Toeprinting est une technique qui permet l’étude mécanistique détaillée d’initiation de la traduction de l’ARN spécifique in vitro. L’objectif global du toeprinting consiste à évaluer la capacité d’un ARN d’intérêt de nucléée la formation d’une complexe avec le ribosome dans une variété de conditions, d’initiation de traduction afin de déterminer quelles séquences, éléments structuraux ou accessoire facteurs sont requis pour l’initiation de la traduction efficace. Par exemple, recrutement du ribosome pourrait être entravé en l’absence d’un plafond de 5' mais stimulé par la présence d’une IRES.

Le principe de la technique est à in vitro transcrire un ARN d’intérêt, il incuber en présence des extraits cellulaires contenant des composants de translation (ou les composantes purifiées) permettant de transcrivent les complexes de l’initiation à la forme et d’inverser l’ARN avec une amorce spécifique. Des complexes stables de RNA-ribosome provoquera la transcription inverse à caler au bord 3' du ribosome, le soi-disant « toeprint »5,6,7.

Dans ce protocole, les sous-unités ribosomiques, SIFE, ARNt et IRES trans-des facteurs (ITAFs) sont idéalement fournis par lysate de reticulocyte de lapin (RRL). Un autre avantage de ce protocole est l’utilisation d’une amorce marquée fluorescent et imageur de gel à base de fluorescence, plutôt qu’un apprêt radiomarqué. Cela permet d’éliminer des étapes supplémentaires, y compris le radiomarquage l’amorce, ainsi que le gel de séchage et exposer à un écran renforçateur. Les bandes fluorescentes sont enregistrés en temps réel, comme les essais de gel, ce qui permet une plus grande résolution. Non plafonné liée à le X inhibiteur de l’apoptose protéine (XIAP) IRES ARN est utilisé comme un exemple ici, bien que plafonnés ARNm peut également être analysés par cette technique8.

Contrairement à l’analyse de l’Ouest, qui mesure la production finale de la traduction dans les lysats cellulaires, toeprinting est une approche in vitro pour mesurer la formation du complexe initiation traduction de l’ARN. Cette approche réductrice permet l’étude très détaillée des substrats ou facteurs qui régulent l’initiation de la traduction (e.g., plafonnés ou non plafonnés ARNm, IRES structure, présence ou absence de queue polyA, disposition des facteurs protéiques spécifiques, " etc..). Par conséquent, toeprinting peut être utilisé pour étudier les différents modes de traduction8 ou les effets de structures de l’ARNm, comme IRESes, sur la synthèse de protéines9,10.

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Protocole

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Remarque : L’ARN est très sensible à la dégradation par des ribonucléases (RNases). Prendre des précautions standards pour garder l’ARN intact. Changer fréquemment. Utiliser des pointes de pipette filtrée, exempte de nucléase de contenants de plastique et de produits chimiques exempte de nucléase dans toutes les étapes du protocole. Utilisation exempte de nucléase ou diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-traiter l’eau pour toutes les solutions.

1. préparation des Solutions

  1. Préparer Toeprinting tampon : 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KACO, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5 % (p/v) de sucrose, la spermidine le dithiothréitol (DTT) et 0,5 mM de 2 mM.
    1. Stocker la TNT et la spermidine dans jetables aliquotes à-20 ° C pour éviter les cycles de gel-dégel répétés.
      NOTE : TNT et la spermidine devraient être ajoutées au tampon de toeprinting juste avant l’emploi. Une solution manque de TNT et la spermidine peut être conservée à-20 ° C.
  2. Préparer des aliquotes de 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) et 91 mM l’adénosine triphosphate (ATP). Stocker les aliquotes à-20 ° C.
  3. Préparez 450 mL de mélange de gel de 6 % polyacrylamide - 7M urée : 67,5 mL de 40 % acrylamide:bis-acrylamide (19:1), 189 g d’urée, 112,5 mL de 5 x TBE (Tris/borate/thylenediaminetetraacetic acide (EDTA)) et 120 mL d’eau. Dissoudre l’urée en chauffant au bain-marie à 37 ° C ou sur une plaque chauffante en agitant. Filtrer la solution (e.g., 0,2 μm filtre à vide nitrocellulose).
    Remarque : La solution peut être conservée à 4 ° C pendant au moins un mois.
    ATTENTION : L’acrylamide monomère est une neurotoxine qui peut être absorbée par la peau. Prendre grand soin d’éviter le contact avec la peau (i.e., porter des gants, une blouse de laboratoire et lunettes de protection). Polyacrylamide doit également être manipulé avec soin, car la polymérisation ne peut procéder à l’achèvement de 100 %.
  4. Préparer la formamide chargement colorant : 95 % formamide, 18 mM EDTA, 0.025 % (p/v) dodécylsulfate de sodium (SDS), le bleu de bromophénol 0.025 % (p/v), 0.025 % (p/v) de xylène cyanol. Conserver à-20 ° C.
  5. Dissoudre 1 nmol d’apprêt (5' CTCGATATGTGCATCTGTA ; 5' fin marquées avec IRDye 800) dans 100 μL d’eau pour une concentration de travail de 10 pmol/μL. Conserver à-20 ° C en aliquotes à usage unique (environ 10 µL), abri de la lumière.

2. préparation de l’ARNm

  1. Amplifier les matrices d’ADN pour la synthèse de l’ARNm par polymerase chain reaction (PCR) de modèles appropriés (i.e., ADN génomique ou l’ADN plasmidique, selon le cas). Utiliser une haute fidélité ADN polymérase conformément aux instructions du fabricant, avec les conditions de la réaction suivante (35 cycles) : faire fondre, 98 ° C, 10 s ; recuire, 53 ° C, 20 s ; étendre, 72 ° C, 30 s.
    NOTE : L’amorce vers l’avant (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpore la séquence du promoteur T7 permettant la transcription de l’ARN ; l’apprêt inverse (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) comprend 51 résidus thymine afin de fournir une queue poly-A pour l’ARN transcrit. Notez que RNA peut également en vitro transcrit de l’ADN de plasmide.
  2. Utiliser un kit de transcription appropriée à in vitro transcrire RNA contenant IRES ou RNA plafonné de la matrice d’ADN. Suivez les instructions du fabricant. Préparation des échantillons de RNA standard 20 volumes de réaction μL. Traiter l’ARN nouvellement synthétisé avec 2 unités de DNase RNase-libre pendant 30 min à 37 ° C.
  3. Diluer l’ARN imprégnées de DNase pour 110 µL d’eau exempte de nucléase ajouter 110 µL acide phénol, le vortex 5 s et centrifuger pendant 3 min à 20 000 x g à la température ambiante. Supprimer 100µl de la phase aqueuse dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 10 µL d’acétate de sodium 3M et vortex 2 s. Ajouter, 3 volumes d’éthanol à 100 %, vortex, 5 s et précipiter l’ARN à-20 ° C pendant la nuit.
  4. Centrifuger à > 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Laver le culot avec 500 µL d’éthanol à 70 % (v/v) glacée et répétez la centrifugation. Aspirer aussi bien de surnageant possible et sécher le culot pour 5-10 min. faites attention de ne pas déloger la pastille.
  5. Remettre en suspension l’ARN dans le volume approprié d’eau exempte de nucléase pour produire une travail concentration de 0,5 μg/μL. Cela peut être conservé à-80 ° C ou utilisé immédiatement.

3. réaction de Toeprinting

  1. Mix 15 μL de lapin Reticulocyte Lysate (RRL, nucléase non traités), 1 μL (40 unités) de l’inhibiteur de RNase, 1 µL de 91 mM ATP (1,82 mM final) et 1 μL de 85 mM GMP-PNP (1,7 mM final) dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Incuber à 30 ° C pendant 5 min.
    Remarque : La RRL doit être aliquoté à usage unique éviter le gel-dégel répété. Un contrôle critique est une réaction manque RRL, afin d’élucider les pauses naturelles de transcription inverse en raison de la structure secondaire de l’ARN. Ajouter toeprinting tampon pour remplacer RRL pour ce contrôle.
  2. Ajouter 0,5 µg (1 µL) de l’ARN et incuber à 30 ° C pendant 5 min.
  3. Ajouter 22 µL de tampon de Toeprinting et incuber à 30 ° C pendant 3 min.
  4. Ajouter 0,5 µL (5 pmol) d’apprêt IRDye marqués et incuber sur glace pendant 10 min.
  5. Ajouter 2 µL de 25 mM dNTPs (concentration finale : 1 mM chacun), 2 µL de 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL d’aviaire myéloblastose Virus Reverse Transcriptase (AMV-RT) et 3,5 µL de tampon de Toeprinting. Le volume final est 50 μL.
  6. Incubez la réaction à 30 ° C pendant 45 min.
  7. Ajouter 200 µL d’eau exempte de nucléase et extraire immédiatement avec 250 µL de 25:24:1 phénol : chloroforme : isoamylique alcool (pH environ 8,0). Vortex 5 s et centrifuger à 20 000 x g pendant 3 min à température ambiante. Éliminer la phase aqueuse dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 3 volumes d’éthanol à 100 %, vortex, 5 s et précipiter à-20 ° C durant la nuit.
  8. Centrifuger à > 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Laver le culot d’ADN avec 500 µL d’éthanol à 70 % (v/v) glacée. Centrifuger à > 20 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Aspirat surnageant autant que possible et de sécher que le culot pour 5-10 min. faites attention de ne pas déloger la pastille à l’air.
  9. Dissoudre le culot dans 6 μL d’eau exempte de nucléase et ajouter 3 μl du formamide colorant de chargement.

4. les réactions de séquençage

  1. Utilisez la matrice d’ADN de 2,1 et l’apprêt IRDye marquée de l’étape 3.4 pour les réactions de séquençage standard, à l’aide de didéoxynucléotide (ddNTPs) comme indicateurs de fin de chaîne. Utiliser un kit de séquençage ADN approprié et suivez les instructions du fabricant.
  2. Mix 6 μL de chaque réaction de séquençage avec 3 μl de formamide colorant de chargement.

5. préparation du séquençage Gel et électrophorèse

Remarque : Ce protocole utilise un imageur de gel à base de fluorescence et une 21 cm x 23 cm x 0,2 gel de mm, mais peut être adapté pour d’autres séquenceurs ou gel-tailles, si nécessaire.

  1. Bien nettoyer les entretoises de 0,2 mm ainsi que les courtes (23 × 25 cm) et longues plaques de verre (30 × 25 cm) avec 100 % d’éthanol. Sécher à l’air.
  2. Mélanger 30 mL de 6 % gel de polyacrylamide - 7M urée mélanger avec 200 μL de persulfate d’ammonium 10 % (p/v) (APS) et 20 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED). Verser le gel, en prenant soin d’éviter les bulles et insérer le peigne de gel « dent de requin ». Laisser le gel polymériser pendant 1 h à température ambiante.
  3. Assembler l’appareil de séquençage et de remplir les réservoirs de 1 x TBE.
  4. Avant courir pendant 15 min à 1500 V jusqu'à atteindre la température optimale de 55 ° C.
  5. Faire chauffer le mélange colorant échantillon/chargement (à partir de mesures 3.9 ou 4.2) à 85 ° C pendant 5 min. charge 1 μL sur le gel de séquençage.
  6. Exécutez le gel à 1500 V pendant 8 h. La machine lit les bandes en temps réel.
  7. Démonter l’appareil et de disposer le gel d’acrylamide et le tampon en cours d’exécution.

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Résultats

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Nous avons déjà décrit la capacité de l’IRES XIAP pour soutenir la traduction chapeau-indépendante initiation in vitro8,10. Toeprinting est la technique clée pour interroger les détails mécanistiques de la complexe d’initiation de XIAP IRES. Une construction d’ADN codant un ARNm contenant l’IRES XIAP (Figure 1A) a été en vitro transcrit et soumis à l’analyse de toepr...

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Discussion

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Toeprinting est une technique puissante pour mesurer directement la capacité d’un ARN d’intérêt pour soutenir la formation de translation initiation complexes dans une situation très contrôlée. Ce protocole décrit une technique simplifiée pour toeprinting ARN chez les mammifères. Lysat de reticulocyte de lapin (RRL) est utilisé comme une source commode de ribosomes, SIFE, initiateur tRNA et IRES trans-agissant de facteurs (ITAFs). L’expérimentateur fournit leur ARN de choix et peut également compléter la réactio...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été financé par les Sciences naturelles et ingénierie recherche Conseil de Canada-subvention à la découverte (RGPIN-2017-05463), la Fondation canadienne pour l’Innovation-John R. Evans Fonds des Leaders (35017), le programme Campus Alberta Innovates et le ministère de l’Alberta Développement économique et du commerce.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DEPC (Pyrocarbonate de diéthyle)SigmaD5758-100ML
Base TRIS, UltrapureJT Baker4109-01
KOAc (Acétate de potassium)Bio BasicPB0438
Mg(OAc)2 (Acétate de magnésium tétrahydraté)Bio BasicMB0326
Saccharose, grade de biologie moléculaireCalbiochem573113-1KG
SpermidineSigma85558
GMP-PNP (Guanosine 5&prime ;-[&beta ;,&gamma ;-imido]triphosphate trisodique sel hydraté) 0,1 M solutionSigmaG0635
ATP (adénosine 5&prime ;-triphosphate) sel disodique, 100 mM solutionSigmaA6559
19:1 Acrylamide :bis-acrylamide, 40 %Bio BasicA0006
UreaBio BasicUB0148
500mL unités de filtration sur flacon, 0.2 & micro ; mSarstedt83.1823.101
FormamideSigmaF9037-100ML
EDTA (sel disodique, dihydraté)Bio BasicEB0185
SDSBio BasicSB0485
Bleu de bromophénolBio BasicBDB0001
Xylène cyanol FFBio BasicXB0005
MEGAshortscript T7 kit de transcriptionAmbionAM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 kit de transcriptionAmbionAM1344
Phénol acide :Chloroforme (5:1)AmbionAM9722
25:24:1 Phénol :Chloroforme :Alcool isoamyliqueInvitrogen15593-049
Lysat de réticulocyte de lapin (RRL). Ne doit PAS être traité par nucléase.Green Hectares, États-UnisContactez Green Hectares, demandez 1:1 RRL :water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µ ; L)Thermo FisherE00382
100 mM dNTPsInvitrogen56172, 56173, 56174, 56175Mélanger à parts égales pour un stock de 25 mM chacun.
AMV-RT, 10 U/µ ; LPromegaM5101
Sequenase Version 2.0 Kit de séquençage de l’ADNThermo Fisher707701KT
Modèle 4200 Analyseur d’ADN IR2LI-CORLe produit n’est plus fabriqué
APS (Persulfate d’ammonium)Bio BasicAB0072
TEMEDBio BasicTB0508
Phusion Polymérase Haute FidélitéNouveau Angleterre BiolabsM0530
Turbo DnaseThermo FisherAM2238

Références

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Mots-clés

Traduction m di e par l IRESpurification de l ARNtranscription inverselectrophor se sur gel de polyacrylamideimagerie fluorescenteliaison du ribosomeinitiation d pendante de la coiffe

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