Ce protocole décrit une méthode nouvellement créée pour la livraison de virus à la prostate murine. Utilisant la technologie CRISPR/Cas9, surexpression du gène ou livraison recombinase Cre, la technique permet l’orthotopic altération de l’expression génique et implémente un modèle de souris roman pour cancer de la prostate.
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Article de méthode
Livraison de virus de CRISPR Guides pour la Prostate Murine pour modifications géniques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Avec une incidence croissante du cancer de la prostate, l’identification de nouveaux pilotes de tumeur ou modulateurs est cruciale. Modèles de souris génétiquement modifiées (GEMM) pour cancer de la prostate sont entravés par l’hétérogénéité tumorale et sa dynamique de microévolution complexes. Modèles murins de cancer de la prostate traditionnels comprennent, entre autres, la lignée germinale et masquages conditionnels, transgénique expression d’oncogènes et des modèles de xénogreffes. Génération de mutations de novo dans ces modèles est complexe, fastidieux et coûteux. En outre, la plupart des modèles traditionnels cible la majorité de l’épithélium de la prostate, tandis que le cancer de la prostate humain est bien connu d’évoluer comme un événement isolé dans un petit sous-ensemble de cellules. Précieux modèles doivent simuler non seulement de début de cancer de la prostate, mais aussi de progression vers la maladie avancée.
Nous décrivons ici une méthode pour cibler quelques cellules de l’épithélium de la prostate par transduction des cellules par des particules virales. La livraison d’un virus machiné pour la prostate murine permet l’altération de l’expression génique dans l’épithélium de la prostate. Quantité et le type de virus par les présentes définira le nombre de cellules ciblées pour modifications géniques de transduction quelques cellules pour le déclenchement du cancer et nombreuses cellules pour la thérapie génique. Par injection à la chirurgie dans le lobe antérieur, distale de la voie urinaire, la tumeur dans ce modèle peut se développer sans nuire à la fonction urinaire de l’animal. En outre, en ciblant uniquement un sous-ensemble de cellules épithéliales prostatiques la technique permet une expansion clonale de la tumeur et imite donc tumorales humaines initiation, progression, ainsi que l’invasion à travers la membrane basale.
Cette nouvelle technique constitue un modèle de cancer de la prostate puissant avec pertinence physiologique améliorée. Souffrance animale est limitée, et puisqu’aucune reproduction supplémentaire n’est requise, nombre d’animaux dans l’ensemble est réduit. Dans le même temps, l’analyse des voies et de nouveaux gènes candidats est accélérée, qui à son tour est plus rentable.
Introduction
Détection et le traitement du cancer de la prostate ont considérablement amélioré au cours de la dernière décennie. Pourtant, l’incidence du cancer de la prostate augmente, l’espérance de vie à la suite. Avec environ 1,1 millions nouveaux cas dans le monde entier, il est parmi les causes les plus fréquentes de décès liés au cancer chez les hommes 1. Cancer de la prostate est lent dans son développement, mais lorsque le cancer a progressé à un stade avancé métastatique, le pronostic est médiocre en raison des possibilités de traitement limitée. Jusqu’ici, seulement quelques gènes ont été identifiés comme les pilotes courants dans ce cancer, et son hétérogénéité et multifocality empêche la détection des biomarqueurs et maladie targetable pilotes2,3.
Les techniques classiques de production edged sont souvent affaiblies par leur complexité, les frais en temps opportun et coûts. Modèles knock-out conditionnel ont été employé couramment pour étudier les gènes candidats de cancer de la prostate, qui donnent lieu à une létalité embryonnaire lorsque inactivés dans les cellules germinales4. Les modèles plus courants comportent une recombinase de Cre spécifique de la prostate conduit par soit un Probasin mis à jour le5 ou un promoteur de6 PSA intégrés dans le GEMM de croisement supplémentaire. Dans ces modèles, le gène d’intérêt est ciblé dans la plupart des cellules épithéliales prostatiques, générant une hyperplasie dans l’organe entier, ce qui peut nuire à l’animal de fonction urinaire7.
Livraison viral de la protéine Cre par injection dans le lobe antérieur de la prostate murine peut résoudre ce problème en ciblant seulement quelques cellules8. Pré-requis techniques de laboratoires, d’expertise et objectifs tenant compte, les avantages de la méthode d’un large éventail de variations possibles. Les approches réussies utilisant des adénovirus ciblant JunB et Pten9 ou Lentivirus ciblant le gène Pten et Trp5310 auraient dû être divulgués parmi d’autres. Ajout de transgènes, tels que de la luciférase, la construction virale ou le GEMM permettra en outre une surveillance non invasive de la progression de la maladie par l’intermédiaire de bioluminescence imagerie11.
Génome montage basé sur la technologie CRISPR/Cas9 révèle une occasion nouvelle et rapide pour étudier le cancer grâce à la génération rapide des débouchures somatique12. Livraison virale d’ARN guide unique (sgRNAs) dirigé vers le lobe antérieur de la prostate murine établit un modèle physiologiquement plus pertinent de cancer de la prostate. Par ce moyen, cellules individuelles porteuses de mutations choisies peuvent former des clones capables d’expansion et d’invasion. En outre, utilisation du guide ARN pour plusieurs gènes cibles va générer des clones de cellules avec des altérations dans différents gènes. Cela permettra l’hétérogénéité tumorale et une pression de sélection naturelle sur la progression du cancer, qui peut révéler l’importance de chaque modification génique ou mécanismes épistatiques.
Nous présentons ici une méthode pour délivrer des particules virales à la prostate murine pour altération de l’expression génique. Par une petite incision abdominale, la murin lobe antérieur de la prostate est exposé et les particules virales sont injectées dans le lobe. Cinq jours après la chirurgie, chirurgies clips peuvent être retirés de la peau et le cancer prostatique peut être analysé de 8 semaines après. Dans l’ensemble, il s’agit d’une procédure rapide et rentable, qui a peu d’impact sur la souris et permet la plus grande tumeur de développer sans compromettre la souris.
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Protocole
Ce protocole implique une intervention chirurgicale chez les souris de laboratoire. Toutes les expériences animales doivent être individuellement examinés et approuvés par un Comité de l’emploi (IACUC) et d’institutionnels animalier. Car l’approche repose sur la survie et de récupération de l’animale, s’assurer anesthésie appropriée, gestion de la douleur et un environnement chirurgical aseptique en tout temps. Utiliser un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie pendant l’intervention et jusqu'à la guérison de l’anesthésie.
1. à partir de considérations
- Selon le virus utilisé, exigences titre différentes peuvent s’appliquer ; diluer le virus en conséquence.
Remarque : Dans cet exemple, un virus Adeno-associé, dilué dans du PBS est injecté à un titre de 1 x 1012 UI/mL. Le virus a sérotype 9 et contient le guide RNA Pten et expression de la protéine Cre sous un promoteur d’ubiquitine (Figure 1). Perte du gène Pten augmenté pAKT et la prolifération de l' épithélium prostatique13. - Utilisez la souris mâles à l’âge de 8 semaines au moment de la chirurgie pour assurer le développement adéquat de la prostate.
NOTE : Souris montrés dans cette expérience sont Rosa26-LSL-Cas9-EGFP knockin souris C57BL/6J fond12 (Figure 1). - Fraîchement préparer un mélange d’anesthésie générale et si possible garder stérile.
Remarque : Pour une meilleure récupération animale après la chirurgie, antidote de l’anesthésie est fortement recommandé.- Pour préparer un volume total de 5 mL d’anesthésique, mélanger 0,15 mL médétomidine chlorhydrate (1 mg/mL), midazolam 0,4 mL (5 mg/mL) et 0,25 mL butorphanol (10 mg/mL) avec 4,2 mL eau saline stérile.
NOTE : Anesthésie autre méthodes, telles qu’isoflurane inhalable, peuvent être utilisées conformément aux directives de soins institutionnels des animaux. - Pour inverser l’effet de médétomidine chlorhydrate après chirurgie, mélanger Atipamézole 0,1 mL (5 mg/mL) avec 4,9 mL eau saline stérile.
- Pour préparer un volume total de 5 mL d’anesthésique, mélanger 0,15 mL médétomidine chlorhydrate (1 mg/mL), midazolam 0,4 mL (5 mg/mL) et 0,25 mL butorphanol (10 mg/mL) avec 4,2 mL eau saline stérile.
- Préparer un milieu aseptique chirurgical de stérilisation et de désinfection appropriées. Instruments chirurgicaux de autoclave avant utilisation.
2. virus-livraison à la Prostate Murine
- Anesthésier l’animal par injection intrapéritonéale avec une seringue stérile 1 mL et une aiguille de 27 x ½". Utiliser une dose d’anesthésie de 0,01 mL/g de poids corporel. Si la procédure dure plus de 30 min, maintenir l’anesthésie en injectant la dose de 1/3 de la mise en marche toutes les 30 minutes.
- Examiner la profondeur anesthésique en évaluant la relaxation musculaire, retrait de pédale et réflexes palpébrales. Lorsqu’on observe de perte des réflexes, se raser le bas ventre de l’animal.
- Couvrir soigneusement les yeux de l’animal avec l’Onguent ophtalmique vétérinaire, à l’aide d’un coton-tige stériles pour prévenir la cécité due à l’absence de réflexe cornéen.
- Essuyez l’abdomen rasé avec 70 % d’éthanol et 10 % polyvidone iodée pour désinfecter la zone chirurgicale. Frotter la zone chirurgicale du centre de la zone chirurgicale vers la périphérie.
- Effectuer une incision verticale de la peau à la basse-abdominale médiane d’environ 1 cm à l’aide de ciseaux chirurgicaux stérile.
- Soulevez le péritoine en utilisant une pince pointe fine pour éviter d’endommager les organes qui permettent de poser sous. Faites une incision < 8 mm à l’aide de ciseaux chirurgicaux par le péritoine.
NOTE : Contrairement à l’homme, la glande de la prostate un rongeur se compose de quatre lobes distincts. Le lobe antérieur est attaché à la vésicule séminale. - Déplacez doucement le tissu graisseux côté pour découvrir la vésicule séminale. À l’aide d’une pince anneau, soulever délicatement la vésicule séminale, jusqu'à ce que la prostate antérieure peut être identifiés (Figure 1).
- Injecter un volume total de 30 µL de solution de virus (3 x 1010 particules virales) dans l’épithélium antérieure de la prostate à l’aide d’une seringue d’insuline de 0,5 mL avec une aiguille de 30 x 8 mm. Minimiser les fuites et s’assurer que le liquide est absorbé dans les tissus, formant une petite bulle. Replacez la vésicule séminale dans la cavité abdominale.
- Suture du péritoine avec 2-3 points interrompus simples à l’aide de sutures résorbables 6-0 avec un 13 mm, 3/8 cercle et une aiguille à pointe conique.
- Agrafez la peau avec 3 agrafes stérile 4,8 x 6,5 mm, soulevant la peau avec une pince pour éviter d’endommager le péritoine.
- Pour une meilleure récupération, appliquez l’antidote de l’anesthésie en dose de 0,01 mL/g de poids corporel par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue stérile 1 mL et une aiguille de 27 x ½". Placez soigneusement le dos animal dans sa cage.
3. après chirurgie
- Gardez la cage avec la souris qui a été opéré sur un coussin chauffant pendant 1 h après l’intervention, pour éviter l’hypothermie jusqu'à ce que complètement guéri. Si l'on applique l’antidote, l’animal devrait être éveillé quelques minutes après l’injection.
- Surveiller les animaux tous les jours pour les indications de la guérison et la douleur approprié. Si nécessaire, administrer les antalgiques supplémentaires conformément aux directives institutionnelles de soins aux animaux.
- Retirez les clips de peau après 4-5 jours, une fois que la plaie est fermée.
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Résultats
Afin d’évaluer la prestation de virus à la prostate murine, les échantillons ont été analysés trois mois après la chirurgie. Le Rosa26-LSL-Cas9-EGFP souris12 express GFP dans des cellules qui ont été exposés à la Cre protéine exprimée par le virus. Les échantillons de la prostate ont été examinés avec une microscopie à fluorescence pour cerner avec signal GFP (Figure 2 a). Le signal GFP indique l’activité Cre dans l’épithélium de la pr...
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour modifier l’expression des gènes dans le lobe antérieur de la prostate murine par injection de virus, en créant un nouveau modèle de souris puissante pour cancer de la prostate (Figure 2). L’administration réussie d’un adénovirus a été décrite par Leow et coll. 20058. Nous avons déjà montré comment un adénovirus codant pour une protéine de recombinase Cre peut remplacer des croisements fastidieux d’un allèle d...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Monsieur a été financée par une bourse de la société danoise de cancer (R146-A9394-16-S2). MFB et MKT étaient financés par AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). M. et MFB ont cofinancé par la Graduate School, la santé, AU. Le laboratoire E.F.W. est pris en charge par des subventions du ministère espagnol de l’économie (SAF2015-70857, cofinancé par le FEDER-UE) et un ERC advanced grant (741888 - CSI-Fun).
Nous tenons à remercier Liliana Fajardo Mellor (gènes, le développement et la maladie ; National Cancer Research Center) pour une lecture critique du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J souris | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 seringue à insuline | BD | 324825 | pour injection de virus |
| ml seringue | BD | 300013 | pour injection d’anesthésie |
| 30 G 1/2' ' aiguille | BD | 304000 | pour l’injection d’anesthésie |
| 6-0 Suture Polysorb | Medtronic | GL889 | pour fermer le péritoine |
| Champ de chirurgie stérilisé jetable | plusieurs fournisseurs | ||
| Coussin chauffant | plusieurs fournisseurs | ||
| Coussin de préparation à l’iode Povidone Fisher | Scientific | 06-669-70 | |
| Parage machine | Aesculap | GT415 | pour raser l’abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Ciseaux à iris | F.S.T | 14094-11 | |
| Pince à motif étroit | F.S.T | 11002-12 | |
| Pince à anneau | F.S.T | 11106-09 | |
| Système de clip de plaie Poignée avec clips | F.S.T | 12030-01 | pour fermer la peau |
| Système de clip de plaie Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | Différents modèles ont été utilisés | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisédan | obtenu de l’animalerie | ||
| Butorphanol | obtenu de l’animalerie | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtenu de l’animalerie | ||
| Midazolam | obtenu de l’animalerie | ||
| 100 % Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Pommade oculaire | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | plusieurs fournisseurs | virus utilisé dans ce protocole est une production interne | |
| d’anticorps pAKT | CST | 4060 | utilisé 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | utilisé 1:100 dillution |
Références
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Réimpressions et autorisations
