Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

Summary

Nous décrivons l’isolement immunomagnetic des oligodendrocytes principal de la souris, qui permet d’isoler des cellules in vitro culture rapide et spécifique.

Abstract

L’isolement efficace et robuste et la culture des oligodendrocytes primaires (MCO) est un outil précieux pour l’étude in vitro de l’élaboration des oligodendrocytes ainsi que la biologie des maladies comme la sclérose en plaques démyélinisantes et Maladie de Pelizaeus-Merzbacher-like (PMLD). Ici, nous présentons un simple et méthode de sélection efficace pour l’isolation immunomagnetic de stade trois O4⁺ cellules preoligodendrocytes de petits souris néonatales. Comme OL immature constituent plus de 80 % de la matière blanche de cerveau de rongeurs à jour après la naissance 7 (P7) cette méthode d’isolement assure non seulement le cellulaire à haut rendement, mais aussi l’isolement spécifique du BSL déjà engagé envers la lignée oligodendrogliale, diminuant la possibilité d’isoler les cellules contaminantes telles que les astrocytes et les autres cellules du cerveau de souris. Cette méthode est une modification des techniques rapportées antérieurement et assure une pureté préparation oligodendrocyte au-dessus de 80 % en environ 4 h.

Introduction

Oligodendrocytes (OLs) sont les cellules myélinisantes du système nerveux central (SNC)¹. L’isolement et la culture des oligodendrocytes primaires dans un environnement fortement réglementé est un outil précieux pour l’étude in vitro de l’élaboration des oligodendrocytes ainsi que la biologie des maladies telles que la sclérose^{2 démyélinisantes} . Cela nécessite un oligodendrocyte efficace et robuste d’isolement et de la culture la méthode³. Dans cette étude, nous avons profité de l’expression d’un marqueur de surface de cellule oligodendrocyte distinctif pour mettre en œuvre une technique d’isolation modifiée qui est rapide et précis.

Quatre étapes distinctes de la maturation des oligodendrocytes ont été identifiés, chacun caractérisé par l’expression des marqueurs de surface de cellules distinctes pour chaque stade de développement (Figure 1). Ces marqueurs de surface cellulaire peuvent être reconnus par des anticorps spécifiques^4,5et peuvent être utilisés pour isoler les langues officielles à des étapes spécifiques. Dans un premier temps, cellules de précurseurs d’oligodendrocytes (OPCs) ont la capacité à proliférer, de migrer et de façon explicite de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-Rα) de récepteur⁶, ganglioside A2B5, protéoglycane NG2^7,8 , polysialic acide-neural cell adhesion molécule⁹ et gras-acid-binding protein 7 (FABP7)¹⁰. OPCs ont une morphologie bipolaire avec peu de processus abrégé émanant des pôles opposés du corps cellulaire, qui est caractéristique des précurseurs neuronaux de cellules¹¹.

Figure 1 : Expression de marqueurs de surface cellulaire lors du développement d’oligodendrocyte souris. Opération survie cellulaire marqueurs de surface tels que A2B5, GalC (O1), NG2, O4 et PDGF-Rα peuvent servir à isoler spécifiquement les oligodendrocytes au stade de développement spécifique en utilisant des anticorps spécifiques.   Veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans un deuxième temps, OPCs donnent lieu à la preoligodendrocytes et exprimer à la membrane cellulaire non seulement des marqueurs OPC, mais aussi le Sulfoglycosphingolipides (un galactolipide sulfatée) reconnu par le O4 anticorps^12,13et la protéine de GPR17¹⁴, qui persiste jusqu’au stade d’oligodendrocytes immatures (OL). À ce stade, preoligodendrocytes étendre les processus abrégés multipolaires. Preoligodendrocytes sont l’étape majeure d’OL à jour après la naissance 2 (P2) dans la substance blanche cérébrale de rat et de souris avec une population mineure d’immatures OLs¹⁵.

Au cours de la troisième phase, OLs immatures continuent à exprimer O4, perdre l’expression des marqueurs A2B5 et NG2 et commencent à exprimer les galactocérébrosides C¹⁶. À ce stade, opération Survie au Soudan se sont engagés à la lignée oligodendrocyte et deviennent des cellules post-mitotiques avec des branches bien ramifiées^17,18. À cette époque les premières cellules MBP⁺ on observe^15,19,20,21et OL immature constituent plus de 80 % de la matière blanche rongeur à P7. Par conséquent, isolement des langues officielles à P7 pourrait garantir cellulaire à haut rendement.

Dans la finale et quatrième étape du développement de l’OL, OLs matures expriment myélinisantes protéines (la protéine basique de la myéline (MBP), protéine protéolipidique (PLP), glycoprotéine myéline associée (MAG) et la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)^{22,23 ,24,25,26}. À ce stade, OLs matures s’étendent les membranes ce compact de forme Envellopants gaines autour des axones et peuvent myéliniser. Cela coïncide avec l’observation que, dans le cerveau de rat et de souris, les cellules MBP⁺ deviennent plus en plus abondantes à P14^19,20,21.

Depuis le premier isolement des oligodendrocytes par fifi et ses collègues en 1967²⁷, plusieurs méthodes pour l’isolement des langues officielles de la CNS du rongeur ont été appliquées, y compris immunopanning^28,29,30, cellule activée par fluorescence triant (FACS) exploitant cell surface spécifique antigènes^28,31, centrifugation en gradient différentiel^32,33,34,35 et secouant méthode fondée sur l’adhésion différentielle des différents CNS glia^36,37. Cependant, les méthodes existantes de la culture ont des limites, notamment en termes de pureté, de rendement et de temps requis pour exécuter les procédures³⁸. Par conséquent, des méthodes d’isolation plus efficaces pour les oligodendrocytes sont nécessaires.

Dans cet article, nous présentons un simple et méthode de sélection efficace pour l’isolation immunomagnetic de stade trois O4⁺ cellules preoligodendrocytes de petits souris néonatales. Cette méthode est une modification des techniques signalées par Emery et al. ³⁹ et Dincman et al. ⁴⁰ et assure une oligodendrocyte préparation une pureté supérieure à 80 % en environ 4 h.

Protocol

Les souris utilisées dans cette étude ont été pris en charge conformément aux directives de la numéro de protocole de SUNY Downstate Medical Center Division du laboratoire Animal Resources (DLAR) 15-10492.

Remarque : Les oligodendrocytes primaires ont été isolées de néonatale (P5-P7 sauvage C57Bl/6N) souris. À ce stade, OLs immatures constituent plus de 80 % de la matière blanche rongeur assurant un rendement cellulaire élevé. Tous les tampons et les compositions de réactif sont disponibles à la fin de la Table des matières.

1. préparation de lamelles couvre-objet

NOTE : Poly-D-lysine (PDL) / laminin enduit lamelles doivent être préparés avant l’isolement de l’OL.

1. Lieu #1 allemand lamelles couvre-objet en verre dans un tube conique de 50 mL et ajouter 35 mL de 70 % EtOH à les nettoyer.
2. Fermer le tube, placez-le dans un mélangeur oscillant et incuber à température ambiante pendant au moins 30 min, tout en poussant doucement. Lamelles couvre-objet peut être incubées pendant la nuit.
3. Jeter l’EtOH 70 %.
4. Laver les lamelles 3 fois avec de l’eau désionisée, retirez l’eau chaque fois à l’aspiration intra-utérine.
5. Ajouter 30-35 mL de PDL 50 µg/mL pour les lamelles dans le tube de 50 mL, assez pour couvrir les lamelles couvre-objet.
6. Placer le tube de 50 mL contenant les lamelles couvre-objet sur une table de mixage oscillant et incuber à température ambiante pendant au moins 30 min tout en berçant doucement.
7. Laver les lamelles 3 fois avec de l’eau désionisée, élimination de l’eau chaque fois à l’aspiration intra-utérine.
8. Transférer les lamelles dans 60 mm plats de Pétri contenant de l’eau désionisée.
9. Utilisez une pointe de pipette P200 pour disposer les lamelles comme une couche qui recouvre toute la surface de la boîte de Pétri.
10. Soigneusement, enlever l’eau de la vaisselle à l’aspiration intra-utérine.
11. Enlever l’excès d’eau autour les lamelles et les laisser sécher pendant la nuit avec le couvercle ouvert et sous ultraviolets dans le capot.
    Remarque : Lamelles de verre PDL enduit peuvent être stockés à 4 ° C dans des plats de Pétri stérile jusqu'à trois mois.
12. Placer les lamelles en plaques 24 puits, un par puits, à l’aide de pinces fines.
13. Déplacez les lamelles vers le centre du bien faire que les bords ne touchent pas la paroi du puits.
14. Ajouter 100 µL de 10 µg/mL laminine dilué dans B27NBMA (voir la Table des matières) à partir du centre de chaque lamelle et se déplaçant de façon circulaire vers les bords pour couvrir toute la région.
    Remarque : Puisque laminine participe au maintien de l’OL et favorise la différenciation en MCO mature, c’est un important facteur de survie OL pour in vitro culture^41,42,43,44.
15. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO₂ pendant au moins 1 h ou jusqu'à ce que le BSL est prêt pour le placage.

2. souris cerveau Cortex Dissociation

1. Sacrifier postnatale 5-7 jours vieux C57Bl/6N souriceaux par décapitation rapide avec des ciseaux préalablement nettoyés dans l’éthanol à 70 %.
   NOTE : cortex cérébraux de 5-6 petits de souris néonatales ont été utilisés pour chaque préparation. En moyenne, un cerveau de souris donne 1-1. 5 x 10⁶ langues officielles.
2. Couper la peau du cuir chevelu, le long de la ligne médiane avec des petits ciseaux de dissection et rétracter pour exposer le crâne.
3. Couper le crâne soigneusement le long de la ligne médiane à partir de l’ouverture à l’arrière du crâne vers la zone frontale, tirant vers le haut avec les ciseaux pour éviter d’endommager le cerveau. Puis, à l’aide de l’ouverture à l’arrière du crâne coupé vers chaque orbite le long de la base du crâne.
4. Utiliser des pinces fines doucement taquiner le cortex du mésencéphale et les transférer dans un plat de vitroplants de 60 mm contenant 7 mL de B27NBMA. Répétez les étapes 2.2 à 2.4 pour chaque cerveau, mettre en commun les cortex disséqués.
5. Le cortex de transfert à une autre boite de culture de tissus de 60 mm contenant 5 mL de tampon de dissociation (B27NBMA, 20-30 U/mL papaïne et 2 500 U DNase I).
6. Couper en dés le cortex en petits morceaux d’environ 1 mm³ à l’aide d’une lame de bistouri #15 et incuber pendant 20 min dans un 37 ° C, 5 % CO₂ incubateur.
7. Ajouter 1 mL de sérum bovin croissance (BGS) pour arrêter la réaction enzymatique.
8. Transfert du cortex ainsi que les médias de dissociation d’un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
9. Doucement commencer à dissocier le tissu cérébral par pipetage lentement vers le haut et vers le bas de 6 à 8 fois à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, à l’aide de soin de réduire les bulles.
10. Laisser les morceaux de tissus pour se contenter de 2-3 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube.
11. Ajouter 3 mL de B27NBMA contenant 10 % BGS/2500 U DNase I le tissu-pellet.
12. Utiliser une pipette sérologique de 5 mL de dissocier doucement le tissu cérébral lors de pipetage de haut en bas 6 - 8 fois. Veillez à réduire au minimum les bulles.
13. Laisser les morceaux de tissu se contenter de 2-3 min.
14. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 3 mL de B27NBMA contenant 10 % BGS/DNase I le tissu-pellet.
15. Doucement dissocier le tissu cérébral en utilisant un embout de pipette P1000, tout en pipettant également le mélange des médias et le tissu cérébral de haut en bas. Répétez les étapes 2.13 et 2.14 suivant jusqu'à ce qu’aucun gros morceaux de tissu ou jusqu’au B27NBMA contenant 10 % BGS/DNase I est épuisé, selon la première éventualité. Veillez à réduire au minimum les bulles.
16. Suspension cellulaire de piscine avec des surnageants précédentes.
17. Crépine de cellule place 70 µm dans un tube de 50 mL. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, passer doucement la suspension de cellules regroupées sur la crépine de cellule de 70 µm.
18. Lavez le tamis de la cellule en ajoutant 1 mL de B27NBMA contenant 10 % BGS/DNase I.
19. Jeter la crépine de la cellule. Porter le volume à 30 mL avec B27NBMA contenant 10 % BGS/DNase I.
20. Transférer la suspension cellulaire à deux tubes coniques 15 mL. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 200 x g.
21. Retirez le surnageant sans quitter les cellules exposées à l’air. Le surnageant sera nuageux à cause de débris cellulaires. Ajouter 3 mL de B27NBMA contenant 10 % BGS au culot.
22. Soigneusement se dissocient le culot cellulaire à l’aide d’une pipette P1000. Compléter le volume à 15 mL par B27NBMA contenant 10 % BGS.
23. Passer un frais 40 µm cellule/filtre de la suspension cellulaire.
24. Lavez le tamis de la cellule en ajoutant 1mL de B27NBMA contenant 10 % BGS. Jeter la crépine de la cellule.
25. Compléter le volume à 30 mL par B27NBMA contenant 10 % BGS.
26. Transférer la suspension cellulaire à tubes coniques de 2 x 15 mL. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 200 x g.
27. Enlever la plupart de surnageant sans quitter les cellules exposées à l’air. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 5 mL de cellule magnétique froid de glace tri tampon (MCS).

3. détermination du nombre de cellules et de la viabilité

1. Diluer 100 µL de la suspension cellulaire avec 400 µL de Solution de bleu de Trypan dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour réaliser une dilution de 1 / 5 à 0,4 % (p/v).
2. Centrer une lamelle couvre-objet sur un hémocytomètre chambre et remplir les deux chambres avec 10 µL de la dilution de la cellule à l’aide d’une pipette de P10 et d’éviter de surcharger. La solution passera sous le couvercle en verre par capillarité.
3. Placez l’hémocytomètre sur la platine du microscope et ajuster le foyer à l’aide d’un grossissement de 40 X.
   Remarque : Les globules sont enregistrées en utilisant un compteur à main dans chacun des cinq carrés (quatre coins et un centre). Uniquement les cellules non viables absorbent le colorant et apparaissent en bleus, tandis que direct et cellules saines apparaissent ronds et réfractive et n’absorbent pas le colorant de couleur bleue, permettant de déterminer le nombre de cellules viables et totales par millilitre.

4. isolement de O4⁺ Oligodendrocytes

1. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 10 min.
2. Soigneusement, éliminer le surnageant à l’aide d’aspiration intra-utérine, éviter l’exposition des cellules à l’air.
3. Resuspendre le culot dans 90 µL de tampon MCS par 1 x 10⁷ cellules total, suivie de l’addition de 10 µL d’anti-O4 perles par 1 x 10⁷ cellules.
4. Mélanger la suspension cellulaire et des perles en doucement effleurer le tube conique de 15 mL avec le doigt 4 - 5 fois.
5. Incuber le mélange pendant 15 min à 4 ° C, effleurant le tube conique de 15 mL avec le doigt 4-5 timesevery 5 min.
6. Laver le mélange en ajoutant doucement 2 mL de tampon MCS par 1 x 10⁷ cellules au tube. Centrifuger le mélange à 200 x g pendant 10 min.
7. Jeter le surnageant soigneusement à l’aide d’aspiration intra-utérine, éviter l’exposition des cellules à l’air. Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon MCS pour chaque 1 x 10⁷ éléments.
8. Fixer un séparateur magnétique sur un stand de séparateur magnétique. Fixer une colonne de sélection sur le séparateur magnétique et placez une passoire de cellule de 40 µm sur le dessus de la colonne. Placer deux 15 mL ou un tube conique de 50 mL sous la colonne de séparation pour recueillir l’écoulement à travers.
9. Rincez d’abord la colonne 40 µm cellulaire crépine et séparation avec 3 mL de tampon MCS et laissez la mémoire tampon par le biais de la colonne sans laisser sécher.
10. Ajouter le mélange de perles et de la suspension cellulaire à la crépine de la cellule et dans la colonne de la sélection.
11. Lavez le tamis de cellule 40 µm avec 1 mL de tampon MCS.
12. Jeter la crépine de la cellule et laisser le mélange des cellules, des perles et des tampons traversent la colonne sans laisser sécher.
13. Laver la colonne de séparation 3 fois avec 3 mL de tampon MCS et 1 fois avec les médias de prolifération OL.
14. Retirer la colonne de séparation du séparateur magnétique, placez-le rapidement dans un tube conique de 15 mL et immédiatement ajouter 5 mL de médias de prolifération OL.
15. Placez un plongeur sur le dessus de la colonne et fermement pousser pour débusquer les cellules marquées dans le tube conique de 15 mL.
16. Déposer 100 µL de la suspension cellulaire pour déterminer le nombre de cellules et de la viabilité en utilisant le bleu Trypan et hémocytomètre comme indiqué à l’article 3.
    Remarque : La viabilité des cellules au-dessus de 80 % est considérée comme acceptable de procéder avec la culture des langues officielles, mais plus de 90 % de la viabilité est optimale.

5. électrodéposition de O4 isolé⁺ Oligodendrocytes

1. Diluer la suspension cellulaire au désir d’électrodéposition densité (5 x 10⁵ cellules par lamelle) en utilisant les médias de prolifération OL.
   NOTE : OL, densité de semis est très important, donc la densité cellulaire appropriée doit être confirmée en utilisant un microscope de culture de tissus avant de procéder. Ensemencement de densité inférieure à 10 000 cellules/lamelles couvre-objet peut conduire à la survie des cellules pauvres. Densité à 10 000 à 25 000, OL d’électrodéposition différenciation morphologique est lent⁴⁵. Nous plaque OLs avec une densité de semis d’au moins 50 000 cellules/lamelles couvre-objet pour assurer la survie des cellules.
2. Déplacer les plaques 24 puits contenant des lamelles couvre-objet recouvert de laminine, de l’incubateur à la hotte de la culture de tissus.
3. Retirez chaque lamelle de laminine et remplacez-le par 100 µL de la suspension de l’OL.
4. Incuber les OLs dans un incubateur 37 °C/5% CO₂ pour un maximum de 45 min pour favoriser l’adhérence OL pour les lamelles couvre-objet.
5. Après l’incubation, retirer les plaques 24 puits de l’incubateur. Inonder chaque puits de la plaque 24 puits avec 500 µL de médias de prolifération OL.
6. Replacez le BSL dans l’incubateur de₂ °C/5% CO 37 pour 24h supplémentaire.
7. 24 h après le placage d’OLs, retirez les supports de prolifération et remplacer par des médias de différenciation OL pour induire la différenciation.
8. Replacez l’OLs dans l’incubateur et ne l’enlevez pas jusqu'à ce que les cellules sont prêtes pour la fixation.
   NOTE : Variations de pH sont préjudiciables pour les langues officielles et réduire la viabilité des cellules, donc retrait inutile des cultures langues officielles de l’incubateur doit être évité.

6. immunofluorescence souillant

1. Pour la détection des cellules des marqueurs de surface (NG2, O1 et O4) Retirez le support des puits.
2. Ajouter 250 µL de surnageants d’hybridome de souris contenant des anticorps primaires contre O1 (non dilué)¹³ et O4 (non dilué)¹³ et lapin polyclonaux contre NG2 (1 : 150 dilué dans B27NBMA).
   Remarque : Si des anticorps anti-O1 et anti-O4 commercialement disponibles doivent être utilisées, il est conseillé d’utiliser des dilutions suggérées par le fabricant.
3. Incuber les cellules avec l’anticorps primaire maximale dans une étuve à₂ °C/5% CO 37 45 min.
4. Laver deux fois avec 0,05 % de Tween-20/1 X PBS. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % (4 % PFA) pendant 10 min à température ambiante.
5. Laver trois fois de 5 min chacun, avec 0,05 % de Tween-20/1 X PBS.
6. Diluer le conjugué Alexa 488 chèvre anti-souris IgM ou anticorps secondaire IgG anti-lapin (1 : 400) dans B27NBMA.
7. Retirez les 0,05 % Tween-20/1 X PBS les lamelles couvre-objet. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
8. Laver trois fois de 5 min chacun, avec 0,05 % de Tween-20/1 X PBS.
9. Pour la double coloration pour la détection des marqueurs internes (GFAP), enlever les 0,05 % Tween-20/1 X PBS et bloc/permeabilize des cellules avec le tampon de bloc/perméabilisation pendant 15 min à température ambiante. Dans le cas contraire, passez à l’étape 6.17.
10. Retirer le tampon de bloc/perméabilisation et ajouter 250 µL poulet anti-GFAP (1/100) dilué dans un tampon bloc/perméabilisation.
11. Incuber les cellules avec anti-GFAP pendant 1 h à température ambiante. Laver trois fois de 5 min chacun, avec 0,05 % de Tween-20/1 X PBS.
12. Diluer le conjugué Alexa 594 chèvre anti-poulet IgG anticorps secondaire (1 : 400) dans B27NBMA.
13. Retirez les 0,05 % Tween-20/1 X PBS les lamelles couvre-objet. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
14. Laver trois fois de 5 min chacun, avec 0,05 % de Tween-20/1 X PBS.
15. Contre-coloration avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et monter les cellules avec antifade montage média contenant DAPI.
16. Laissez les lamelles guérir du jour au lendemain dans l’obscurité à température ambiante.
17. Images de cellules colorées avec un microscope à épifluorescence.
    Remarque : Dans le présent protocole, les cellules ont été imagées grossissement de 40 X à l’aide d’un temps d’exposition uniforme.

Results

Le but de cette étude était d’établir une méthode d’isolation améliorée pour O4⁺ oligodendrocytes souris primaire nécessitant la moins possible manipulation des cellules cibles. L’ensemble de la procédure de l’euthanasie des petits au bordé des cellules en lamelles prend environ 4 h et les données présentées ici représentent trois expériences indépendantes. Après dissociation tissulaire, une moyenne de 4,3 ± 0,46 x 10⁷ cellules ont été isolées pour chaque étude indép...

Discussion

Dans cette communication, nous présentons une méthode pour l’isolation efficace des cultures d’oligodendrocytes immatures hautement purifié de la souris. Par rapport aux protocoles précédemment publiés^39,40, cette méthode a donné un degré de pureté supérieur à un niveau bien inférieur des astrocytes GFAP-positive et un très faible pourcentage des autres cellules non caractérisée. Il est important de souligner que ce sont immatures OLs déjà investis dans la lignée...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipettes sérologiques de 10 ml	Fisher Scientific	13-676-10J
Seringue de 10 ml Luer-Loc tip	BD, Becton Dickinson	309604
de 15 ml Falcon		352097
plaques de culture tissulaire à 24 puits	Falcon	353935
40µ ; passoire à cellules m	Fisher Scientific	22368547
50ml tubes coniques	Falcon	352098
5ml pipettes sérologiques	Fisher Scientific	13-676-10H
60mm plaques de culture tissulaire	Falcon	353002
70µ ; passoire à cellules m	Fisher Scientific	22363548
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (H+L) anticorps secondaire	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgM (H+L) anticorps secondaire	Invitrogen	A21042
Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgM (H+L) anticorps secondaire	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 594 chèvre anti-poulet IgG (H+L) anticorps secondaire	Invitrogen	A11042
Perles anti-O4- Anti-O4Microbilles	Miltenyi Biotec	130-094-543
Apo-Transferrin humain	Sigma	T1147
Autofil ensemble complet de filtre de bouteille, filtre 0,22um, 250ml	USA Scientific	6032-1101
Filtre complet de bouteille Autofil assemblage, filtre 0,22 μm, 250 ml	USA Scientific	6032-1102
B27 Supplément	Invitrogen	17504-044
Acide borique	Sigma	B7660
Sérum de croissance bovine (BGS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30541.03
BSA	Fisher Scientific	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
d-Biotin	Sigma	B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I)	Worthington	LS002007
EDTA	Fisher Scientific	S311
Microscope à épifluorescence avec une caméra Olympus DP70	Olympus	Bx51
Feather Scalpels jetables	Andwin Scientific	EF7281C
Forskolin	Sigma	F6886
Lamelles en verre allemand, épaisseur #1, 12mm de diamètre rond	NeuVitro	GG-12-oz
GFAP anticorps	Aves	GFAP
Glucose	Fisher Scientific	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
Insuline	Invitrogen	12585-014
Pied séparateur magnétique - MACS multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Séparateur magnétique-Séparateur MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex PES 0.22µ ; Unité de filtration m	Millipore	SLG033RS
Média de montage- Prolong Gold avec DAPI	Thermo Fisher	P36930
N-acétyl-cystéine (NAC)	Sigma	A8199
Laminine de souris naturelle	Invitrogen	23017-015
Milieu neurobasal A	Invitrogen	10888-022
Neurotrophine-3 (NT-3)	Peprotech	450-03
NG2	anticorps Millipore	AB5320
Papain	Worthington	LS003126
PBS sans Ca2+ et Mg2+	Sigma	D5652
PDGF	Peprotech	100-13A
Boîtes de Pétri	Falcon	351029
Poly-D-Lysine	Sigma	P6407
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Progestérone	Sigma	P8783
Putrescine	Sigma	P5780
Sélection colonne-LS colonnes	Miltenyi Biotec	130-042-401
Sélénite de sodium	Sigma	S5261
Oligo-éléments B	Corning	25-000-CI
Triiodothyronine (T3)	Sigma	T6397
Triton-X	Sigma	T8787
Trypan Blue Solution	Corning	25-900-CI
Tween 20	Sigma	P1379
B27NBMA			487,75 mL de milieu neurobasal A ; 10 mL de supplément B27 ; 1 mL de Primocine ; 1,25 mL de glutamax ; Filtrer, stériliser et stocker à 4 ° ; C jusqu’à l’utilisation.
B27NBMA + 10 % BGS			27 mL B27NBMA ; 3 mL de sérum de croissance bovine
CNTF solution stock (10 & micro ; g/ml ; 1000X)			Commande chez Peprotech (450-50). Compléter à 0,1 à 1 mg/ml selon le fabricant. (peut varier d’un lot à l’autre) dans la mémoire tampon (p. ex. DPBS + 0,2 % BSA). Stocker à -80 ° ;C. Solution de travail (10 µ ; g/ml, 1000X) 1. Appliquer 0,2 % de BSA (Fisher scientific BP-1600-100) dans une solution DPBS et filtrer la stérilisation. 2. Diluer l’aliquote de la pâte maîtresse à 10µ ; g/ml dans un BSA/DPBS. 3 stérile et réfrigéré BSA/DPBS.br/ 3. Aliquote (20µ ; L/tube) et la congélation instantanée dans l’azote liquide 4. Stocker les aliquotes à -80 °C.
solution mère de d-biotine (50 & micro ; g/ml ; 5000X)			Mettre en suspension la d-Biotine (Sigma-B4639) dans du H2O doublement distillé à 50 & micro ; g/ml (par exemple 2,5 mg dans 50 ml de ddH2O). La remise en suspension peut nécessiter une bonne dose d’agitation/vortex, ou un léger réchauffement brièvement à 37°C. Si la d-biotine ne se solubilise toujours pas, il est bon de constituer un moins concentré (par exemple 10µ ; g/ml), et d’ajouter un volume plus élevé à la B27NBMA (1/1000), au lieu de 1/5000). Conserver à 4°C.
		mère DNase I	1. Dissoudre à 12 500 U de désoxyribonucléase I/ml dans HBSS refroidi sur glace. 2. Filtre stériliser sur glace 3. Aliquote à 200 µ ; l et congeler toute la nuit à -20°C. 4. Stocker les aliquotes entre -20 et -30°C.
Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (sans Ca2+ et Mg2+)			Dissoudre le sachet dans 1 litre d’eau pour produire 1 litre de milieu à 9,6 grammes de poudre par litre de milieu. Conserver à 2-8 °C.
Solution mère de forskoline (4,2 mg/ml ; 1000X)			Ajouter 1 ml de DMSO stérile à 50 mg de forskoline dans un flacon (Sigma-F6886) et pipeter jusqu’à ce qu’il soit remis en suspension. Transvaser dans un tube à centrifuger de 15 ml et ajouter 11 ml de DMSO stérile pour porter à 4,2 mg/ml. Aliquote (par exemple 20 & micro ; l) et se conserver à -20°C.
Hank' s sels équilibrés (HBSS) (Sigma			1. Mesurer 900 ml d’eau (température 15-20 ° ; C) dans un cylindre et remuer délicatement. 2. Ajouter la puissance et remuer jusqu’à dissolution. 3. Rincez l’emballage d’origine avec une petite quantité d’eau pour éliminer toute trace de poudre. 4. Ajoutez à la solution à l’étape 2. 5. Ajouter 0,35 gr de bicarbonate de sodium (7,5 % p/v) pour chaque litre de volume final. 6. Continuez à remuer jusqu’à ce qu’il soit dissous. 7. Ajustez le pH du tampon tout en remuant à 0,1-0,3 unité en dessous du pH = 7,4 car il peut augmenter pendant la filtration. L’utilisation de 1N HCl ou 1N NaOH est recommandée pour ajuster le pH. 8. Ajoutez de l’eau supplémentaire pour porter le volume final à 1L. 9. Stériliser par filtration à l’aide d’une membrane d’une porosité de 0,22 microns. 10. Conserver à 2-8 °C.
Solution mère d’insuline (4000 & micro ; g/ml)			Décongeler la bouteille et aliquote 25 µ ; l par tube de microcentrifugation et stocker à -20° ;C.
		de laminine	Décongeler lentement la laminine à froid (2° ; C à 8° ; C) pour éviter la formation de gel. Ensuite, aliquote dans des tubes en polypropylène. Magasin à 5° ; C à -20° ; C dans les aliquotes (par exemple 20 & micro ; l) et ne pas geler/décongeler à plusieurs reprises. La laminine peut être stockée à ces températures jusqu’à six mois.
		tri cellulaire magnétique (MCS)	Préparez la solution contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2 et 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,5 mM d’EDTA, 5µ ; g/ml d’insuline, 1 g/L de glucose. Stériliser et dégazer par filtration le tampon en le faisant passer à travers un 0,22 µ ; m Filtre Millex. Stockez le tampon à 4° ; C jusqu’à ce que j’utilise
solution mère de N-acétyl-L-cystéine (NAC) (5 mg/ml ; 1000X)			Dissoudre la N-acétyl-L-cystéine (Sigma-A8199) à 5 mg/ml dans du DMEM (par exemple 50 mg de NAC dans 10 ml de B27NBMA). Filtrer, stériliser et aliquote (par ex. 20 & micro ; l). Stocker à -20° ;C.
Solution mère NT3 (1 & micro ; g/ml ; 1000X)			Stock principal : Commander auprès de Peprotech (450-03). Compléter à 0,1 à 1 mg/ml selon le fabricant. (peut varier d’un lot à l’autre), en mémoire tampon (par exemple DPBS + 0,2 % BSA). Stocker à -80° ;C. Stock de travail (1µ ; g/ml ; 1000X) : 1. Appliquer 0,2 % de BSA dans une solution DPBS et filtrer la stérilisation. 2. Diluer l’aliquote de la pâte maîtresse à 1 & micro ; g/ml dans un BSA/DPBS. 3 stérile et réfrigéré BSA/DPBS.br/ 3. Aliquote (par exemple 20µ ; L/tube) et la congélation instantanée dans l’azote liquide 4. Stocker les aliquotes à -80° ;C.
Solution mère PDGF (10 & micro ; g/ml ; 1000X)			Stock principal : Commande auprès de Peprotech (100-13A). Compléter à 0,1 à 1 mg/ml selon le fabricant. (peuvent varier d’un lot à l’autre) en mémoire tampon (par exemple DPBS) + 0,2 % BSA). Stocker à -80° ;C. Stock de travail (1µ ; g/ml ; 1000X) : 1. Appliquer 0,2 % de BSA dans une solution DPBS et filtrer la stérilisation. 2. Diluer l’aliquote de la pâte maîtresse à 1µ ; g/ml dans un BSA/DPBS. 3 stérile et réfrigéré BSA/DPBS.br/ 3. Aliquote (par exemple 20µ ; L/tube) et la congélation instantanée dans l’azote liquide 4. Stocker les aliquotes à -80° ;C.
Poly-D-lysine (1 mg/ml ; 100X)			Remise en suspension de la poly-D-lysine, poids moléculaire 70-150 kD (Sigma P6407) à 0,5 mg/ml dans de l’acide borique 0,15M pH 8,4 (par exemple 50 mg dans un tampon de borate de 50 ml). Filtrer, stériliser et aliquote (par exemple, 100µ ; l/tube). Conserver à -20° ;C. Avant utilisation, diluer le stock 100X (1mg/ml) à 50° ;; g/ml dans de l’eau stérile.
		prolifération des oligodendrocytes	voir Tableau supplémentaire 1
Milieux			voir Tableau supplémentaire 1
Supplément Sato (100X)			voir Tableau supplémentaire 1
Références : la liste des réactifs et des recettes a été adoptée à partir des protocoles précédemment décrits par Emery et al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification des cellules de la lignée des oligodendrocytes à partir de cortex de souris par immunopanoramique. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi :10.1101/pdb.prot073973, (2013)) et Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolement des cellules précurseurs d’oligodendrocytes de souris corticales. J Méthodes Neurosci. 209 (1), 219-226, doi :10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))