Nous présentons ici un protocole qui vise à analyser la liaison pangénomique du facteur de transcription oligodendrocyte 2 (Olig2) dans cerveau parfaitement purifiée précurseur oligodendrocytes (OPCs) en effectuant l’immunoprécipitation de la chromatine basse-cellule (ChIP) , préparation de bibliothèque, séquençage haut-débit et des analyses de données bioinformatiques.
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Article de méthode
Identification des Sites de facteur de Transcription Olig2 génomique fixation aiguë purifiée cellules PDGFRα + par immunoprécipitation de la chromatine Low-cellule analyse de séquençage
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans les cellules de mammifères, transcription génique est régie d’une manière spécifique de type cellulaire par les interactions des facteurs transcriptionnels avec l’ADN génomique. Sont considérés comme des facteurs de transcription spécifiques lignage jouent un rôle essentiel dans la spécification des cellules et la différenciation au cours du développement. Puce, couplé avec le séquençage haut-débit (ChIP-seq) est largement utilisé pour analyser le génome accepteurs de facteurs de transcription (ou son complexe associé) d’ADN génomique. Toutefois, un grand nombre de cellules est nécessaire pour une réaction de puce standard, ce qui rend difficile d’étudier le nombre limité de cellules isolées de primaire ou de populations cellulaires rares. Afin de comprendre le mécanisme de régulation de transcription de lignée spécifique oligodendrocyte facteur Olig2 chez la souris parfaitement purifiée OPCs, une méthode détaillée à l’aide de ChIP-seq pour identifier les sites de liaison pangénomique du Olig2 (ou Olig2 complexe) est montré. Tout d’abord, le protocole explique comment purifier l’alpha du récepteur de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα) positifs OPCs de cerveaux de souris. Ensuite, Olig2 anticorps médiée par puce et construction de la bibliothèque sont effectuées. La dernière partie décrit le logiciel bioinformatique et les méthodes utilisées pour l’analyse Olig2 ChIP-seq. En résumé, cet article présente une méthode pour analyser les liaisons pangénomique du facteur de transcription Olig2 cerveau parfaitement purifiée OPCs.
Introduction
Il est important d’étudier les protéines (ou complexe protéique) liaisons de l’ADN et les marques épigénétiques pour construire des réseaux de régulation transcriptionnelles impliqués dans divers processus biologiques. En particulier, les liaisons des facteurs de transcription de l’ADN génomique peuvent jouer un rôle important dans la régulation des gènes, la différenciation cellulaire et le développement des tissus. Un outil puissant pour l’étude de la régulation transcriptionnelle et mécanismes épigénétiques est immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). En raison des progrès rapides dans la prochaine génération de technologies de séquençage, puces couplé avec le ....
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Protocole
Toute utilisation animale et les protocoles expérimentaux ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par le Comité institutionnel de biosécurité et le Comité sur le bien-être Animal à l’Université du Texas Health Science Center à Houston.
1. purification de PDGFRα positifs Oligodendrocyte lignée cellules de cerveau de souris (modifié d’après immunopanning décrites précédemment protocoles5,6,,7)
- Préparation d’une plaque d’immunopanning pour la sélection positive d....
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Résultats
Basse-cellule ChIP-seq a été réalisée et des analyses bioinformatiques ont été effectuées pour étudier les interactions potentielles de facteur de transcription Olig2 avec l’ADN génomique purifié aiguë cerveau OPCs. La figure 1 montre un flux de travail général d’expérimental et la procédure d’analyse de données. Dans ce protocole, les cerveaux de souris postnatal est dissociés en une suspension de cellules individuelles. Après dissociation tissulaire, immuno.......
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Discussion
Réseaux de règlement de gène mammifère sont très complexes. ChIP-seq est une méthode puissante pour étudier les interactions ADN-protéines de génome. Ce protocole comprend comment faire Olig2 ChIP-seq en utilisant un nombre faible de l’OPCs purifiées de cerveaux de souris (aussi bas que 20 mille cellules par réaction). La première étape clée pour que ce protocole est la purification de l’OPCs de cerveaux de souris par immunopanning avec anticorps PDGFRα. Pour la sélection positive de l’OPCs avec plaques PDGFRα enduit, OP.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
JQW, XD, DEDC et YY appuyés par les subventions accordées par les instituts nationaux de santé R01 NS088353 ; 01-NIH grant 1R21AR071583 ; la Fondation Hermann de Staman Ogilvie fonds-Memorial ; l’Initiative de cerveau de UTHealth et le CSTC UL1 TR000371 ; et une subvention de l’Université du Texas système Neuroscience et Institut de neurotechnologie (Grant #362469).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| réactif/équipement | |||
| Banderiaea simplicifolia lectine 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Anticorps anti-PDGFRa pour rat | BD Bioscience | # 558774 | |
| Kit de dissociation du tissu neural (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | Technologies STEMCELL | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroïtine Sulfate Protéoglycane | Anticorps Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication dispositif | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel et kit de nettoyage PCR | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Kit Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq | kit Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Pénicilline-Streptomycine (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplément | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplément | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insuline | Sigma | # I6634 | Préparez une solution d’insuline à 0,5 mg/ml en dissolvant 5 mg d’insuline dans 10 ml d’eau et 50 &mu ; l de 1 N HCl. |
| Albumine sérique bovine, adaptée à la culture cellulaire (BSA) | Sigma | # A4161 | Préparez une solution de BSA à 4 % en dissolvant 4 g de BSA dans 100 ml de D-PBS et ajustez le pH à 7,4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Préparez une solution de poly-D-lysine à 1 mg/ml en dissolvant 10 mg de poly-D-lysine dans 10 ml d’eau et diluez 100 fois lors de l’utilisation. |
| Boîtes de Pétri jetables Falcon, Stérile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Boîtes de Pétri jetables Falcon, Stérile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| cocktail d’inhibiteur de protéase | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtention de métriques de contrôle qualité des lectures brutes et tronquées | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Tronquage et filtrage des lectures brutes | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Génome de référence de souris | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Alignement des lectures sur un génome de référence | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Conversion d’un fichier SAM au format BAM | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Création d’un répertoire de balises et annotation de régions génomiques enrichies avec des symboles de gènes | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programmation de scripts et exécution de fonctions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Création d’un tracé de corrélation croisée | |
| de brins MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Recherche de régions d’enrichissement ChIP par rapport | |
| au contrôle BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Arithmétique du génome | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Conversion d’un fichier bedGraph en | |
| navigateur IGV bigwig 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualisation et navigation de pics significatifs ChIP-seq | |
| Excel | Spreasheet programme | ||
| Liste noire d’ENCODE | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtrage pics | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Conversion du fichier bedGraph en | |
| base de données de motifs d’ENCODE | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Base de données complète de motifs requise pour l’enrichissement des motifs | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Analyse de l’enrichissement des motifs et découverte de | |
| motifsPrimer names used for qPCR | Séquences d’amorces utilisées pour la qPCR | ||
| Mbp-F : | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R : | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F : | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R : | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F : | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R : | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFR&alpha ;-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFR&alpha ;-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
Références
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsi....
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Réimpressions et autorisations
