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Article de méthode

Identification des Sites de facteur de Transcription Olig2 génomique fixation aiguë purifiée cellules PDGFRα + par immunoprécipitation de la chromatine Low-cellule analyse de séquençage

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DOI :

10.3791/57547

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16 avril 2018

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1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole qui vise à analyser la liaison pangénomique du facteur de transcription oligodendrocyte 2 (Olig2) dans cerveau parfaitement purifiée précurseur oligodendrocytes (OPCs) en effectuant l’immunoprécipitation de la chromatine basse-cellule (ChIP) , préparation de bibliothèque, séquençage haut-débit et des analyses de données bioinformatiques.

Résumé

Dans les cellules de mammifères, transcription génique est régie d’une manière spécifique de type cellulaire par les interactions des facteurs transcriptionnels avec l’ADN génomique. Sont considérés comme des facteurs de transcription spécifiques lignage jouent un rôle essentiel dans la spécification des cellules et la différenciation au cours du développement. Puce, couplé avec le séquençage haut-débit (ChIP-seq) est largement utilisé pour analyser le génome accepteurs de facteurs de transcription (ou son complexe associé) d’ADN génomique. Toutefois, un grand nombre de cellules est nécessaire pour une réaction de puce standard, ce qui rend difficile d’étudier le nombre limité de cellules isolées de primaire ou de populations cellulaires rares. Afin de comprendre le mécanisme de régulation de transcription de lignée spécifique oligodendrocyte facteur Olig2 chez la souris parfaitement purifiée OPCs, une méthode détaillée à l’aide de ChIP-seq pour identifier les sites de liaison pangénomique du Olig2 (ou Olig2 complexe) est montré. Tout d’abord, le protocole explique comment purifier l’alpha du récepteur de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα) positifs OPCs de cerveaux de souris. Ensuite, Olig2 anticorps médiée par puce et construction de la bibliothèque sont effectuées. La dernière partie décrit le logiciel bioinformatique et les méthodes utilisées pour l’analyse Olig2 ChIP-seq. En résumé, cet article présente une méthode pour analyser les liaisons pangénomique du facteur de transcription Olig2 cerveau parfaitement purifiée OPCs.

Introduction

Il est important d’étudier les protéines (ou complexe protéique) liaisons de l’ADN et les marques épigénétiques pour construire des réseaux de régulation transcriptionnelles impliqués dans divers processus biologiques. En particulier, les liaisons des facteurs de transcription de l’ADN génomique peuvent jouer un rôle important dans la régulation des gènes, la différenciation cellulaire et le développement des tissus. Un outil puissant pour l’étude de la régulation transcriptionnelle et mécanismes épigénétiques est immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). En raison des progrès rapides dans la prochaine génération de technologies de séquençage, puces couplé avec le séquençage haut-débit (ChIP-seq) est utilisé pour les analyses des liaisons protéine-ADN et les marques épigénétiques1. Toutefois, un protocole standard de ChIP-seq nécessite environ 20 millions de cellules par réaction, ce qui rend l’application de cette technique difficile lorsque le nombre de cellules est limité, tels que l’isolement de cellules primaires et populations cellulaires rares.

Oligodendrocytes lignée, y compris les cellules de précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) et des oligodendrocytes sont largement distribués dans tout le cerveau et sont essentiels pour le développement et le fonctionnement du cerveau. Comme un type de cellules précurseurs, OPCs sont capables d’auto-renouvellement et de différenciation. OPC non seulement service de progéniteurs d’oligodendrocytes, mais joue également un rôle important dans la propagation de la signalisation neuronale en communiquant avec d’autres types de cellules de cerveau2. Des études antérieures ont suggéré que le développement des oligodendrocytes est régulée par des facteurs de transcription spécifiques lignée telles que Olig2 et Sox103,4. Ces facteurs de transcription ont été trouvés pour lier aux régions promoteur ou exhausteur de certains gènes cruciaux pour influencer leur expression au cours de la spécification de l’oligodendrocyte et la différenciation. Toutefois, il est difficile d’identifier la liaison ADN des protéines (ou complexe protéique) présentant un intérêt en aiguë purifiées OPCs primaires avec un nombre très limité de cellules.

Ce protocole décrit comment examiner systématiquement l’immunoprécipitée ADN génomique par Olig2 en OPCs purifié de la souris à l’échelle du génome en utilisant la technique de ChIP-seq. OPCs de cerveaux de souris ont été intensément purifiées par immunopanning et utilisés dans une expérience de puce sans prolifération in vitro. Un nombre limité de l’OPCs peut être obtenu par immunopanning et est insuffisant pour des expériences de ChIP-seq standards. Dans les présentes, un protocole de ChIP-seq basse-cellule avec aussi peu que 20 mille cellules par réaction de la puce pour les facteurs de transcription est décrit. En bref, réticulé de cellules ont été lysées et sonication par un dispositif de sonication pour cisailler la chromatine. La chromatine cisaillée est incubée avec Olig2 anticorps, mais aussi des protéines A recouvert de perles pour précipiter l’ADN génomique anticorps lié Olig2. Après élution de billes de protéine A revêtu et réticulation inverse, précipitée par les anticorps Olig2 de l’ADN génomique a été purifiée par extraction au phénol-chloroforme. Le produit obtenu a été quantifié et T-tailing, apprêt recuit changement de modèle et de l’extension, l’ajout d’adaptateurs et amplification, sélection de la taille de bibliothèque et de purification les étapes pour la construction de bibliothèque de ChIP-seq.

Après le séquençage, la qualité des lectures brutes de l’échantillon préparé avec de l’anticorps de Olig2 transcription factor et l’échantillon de contrôle a été analysée. Paires de bases de faible qualité et adaptateur contenant lire des fragments ont été taillés. Ensuite, parés de lectures étaient alignés sur le génome de référence de souris. Les régions génomiques qui ont considérablement enrichies pour les lectures de puce, par rapport au témoin, ont été détectés comme des pics. Des pics importants, représentant de potentiels sites de fixation de facteurs de transcription, ont été filtrés et visualisés dans un navigateur de génome.

Notamment, la méthode décrite dans le présent protocole peut être largement utilisée pour ChIP-seq, d’autres facteurs de transcription avec n’importe quel type de cellule d’un nombre limité.

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Protocole

Toute utilisation animale et les protocoles expérimentaux ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par le Comité institutionnel de biosécurité et le Comité sur le bien-être Animal à l’Université du Texas Health Science Center à Houston.

1. purification de PDGFRα positifs Oligodendrocyte lignée cellules de cerveau de souris (modifié d’après immunopanning décrites précédemment protocoles5,6,,7)

  1. Préparation d’une plaque d’immunopanning pour la sélection positive de cellules PDGFRα et 2 plaques pour l’appauvrissement de la couche de cellules endothéliales et les cellules microgliales.
    Remarque : Veuillez noter que boîtes de Pétri, mais pas les récipients de culture cellulaire travaillent pour immunopanning expérience ; Si les cellules purifiées seront utilisés pour la culture, immunopanning étapes doivent être effectuées dans la prévention des risques biotechnologiques armoire
    1. Enduire un 10 cm Pétri avec 30 µL chèvre anti-rat IgG dans 10 mL de pH 9.5, Tris-HCl 50 mM durant la nuit à 4 ° C. Agiter la plaque pour s’assurer que les surfaces des plaques sont uniformément et entièrement couverts par la solution de revêtement.
    2. Préparer PDGFRα anticorps solution en diluant à 40 µL d’anticorps anti-PDGFRα rat avec 12 mL de tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD) contenant 0,2 % de BSA.
    3. Après 3 lavages des IgG enduit plaque 10 ml 1 x DPBS chaque, incuber IgG-enduit plaque avec la solution d’anticorps PDGFRα à température ambiante pendant 4 h.
    4. Laver la plaque de recouverts d’anticorps anti-PDGFRα rat 3 fois 10 ml 1 x DPBS chaque. Ajouter doucement la solution de SPD le long du mur du côté de la plaque et ne pas déranger les surfaces revêtues.
    5. Manteau 2 nouveaux plats de Pétri de 15 cm pour l’appauvrissement de la couche de cellules endothéliales et les cellules microgliales avec 20 mL de SPD contenant 2,3 µg/mL de Banderiaea simplicifolia lectine 1 (BSL-1) pendant 2 h.
    6. Laver que le BSL-1 enduit plaques 3 fois avec 20 mL 1 x DPBS. Ajouter doucement la solution de SPD le long de la paroi latérale des plaques et ne pas déranger les surfaces revêtues.
  2. Purification de PDGFRα positifs oligodendrocytes lignée est modifié à partir de méthodes publiées antérieurement6 , 7 , 8.
    1. Disséquer les tissus corticaux de postnatal 2 jour 7 (P7) cerveaux de souris selon précédemment protocoles publiés5,6.
    2. Dissocier les tissus afin de générer une suspension de cellules individuelles avec dissociation de tissu neural Kit (P) selon les instructions du fabricant détaillée.
    3. En bref, couper les tissus corticaux découpées en morceaux avec un scalpel et les soumettre à une digestion enzymatique à 37 ° C. Après digestion, manuellement dissocier les morceaux avec verre poli feu que pipettes Pasteur dans une suspension de cellules individuelles.
    4. Centrifuger la suspension monocellulaire à 300 x g pendant 10 min à température ambiante et suspendre le culot cellulaire à l’aide de 15 mL de tampon d’immunopanning (immunopanning tampon est SPD avec 0,02 % de BSA et de 5 µg/mL d’insuline).
    5. Incuber la suspension monocellulaire de cerveaux de souris 2 séquentiellement sur 2 plaques de BSL-1 enduit pendant 15 min à température ambiante avec une agitation modérée de la plaque toutes les 5 min afin d’assurer une meilleure déplétion de la microglie et les cellules endothéliales.
    6. Agiter doucement de la plaque afin de recueillir les cellules non adhérentes de la suspension cellulaire et les incuber sur la plaque de recouverts d’anticorps rat-PDGFRα pendant 45 min à température ambiante.
    7. Après l’incubation de la suspension cellulaire sur la plaque de recouverts d’anticorps rat-PDGFRα, doucement agiter la plaque pour collecter la suspension cellulaire et rincer la plaque 8 fois avec SPD pour se débarrasser des cellules non adhérentes. Doucement, ajouter la solution de lavage le long du mur du côté de la plaque et agiter la plaque plusieurs fois pour se débarrasser des cellules non adhérentes.
    8. Détacher les cellules de la plaque de rat-PDGFRα recouverts d’anticorps utilisant un 4 mL de traitement de solution pour le détachement cellulaire pendant 10 min à 37 ° C. Secouer la plaque pour déloger les cellules adhérentes.
    9. Recueillir l’OPCs purifiées par centrifugation à 300 x g à la température ambiante, de suspendre le culot cellulaire avec milieu de culture cellulaire OPC 2 mL et de compter les cellules en utilisant le bleu trypan et un hémocytomètre (milieu de culture cellulaire de 500 mL est un milieu DMEM/F12 contenant 5 mL solution de pénicilline-streptomycine (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 µg/mL d’insuline, 0,1 % de BSA, 20 ng/mL bFGF et 10 ng/mL PDGFRα).
  3. Validation de la pureté de l’OPCs après immunopanning.
    1. Afin d’évaluer l’enrichissement de l’OPCs, après immunopanning, utiliser une partie de l’OPCs purifiées pour l’extraction de l’ARN avec une extraction de thiocyanate basé de guanidium conformément aux instructions du fabricant.
    2. Effectuer qRT-PCR en utilisant le mélange principal colorant vert fluorescent à vérifier pour l’enrichissement de l’expression de PDGFRα dans OPCs purifiées par rapport aux neurones dissociés selon les documents publiés antérieurement4.
    3. Des graines en outre, certains OPCs purifiées dans la Poly-D-Lysine enduite 24 plaques bien immunomarquage avec anti-NG2 chondroïtine sulfate protéoglycane (NG2) anticorps précédemment publié matériaux9.

2. basse-cellule puce préparation et Construction de bibliothèque de puce pour le séquençage haut débit

  1. Préparation puce basse-cellule OLIG2 avec un système de sonication commercialement disponibles et un certain nombre de cellules faible commercialement disponibles puce kit (voir Table des matières) en suivant les procédures standards d’instructions du fabricant.
    1. Après avoir détaché de l’anti-PDGFRα rat plaque revêtus d’anticorps et la cellule de comptage avec le bleu trypan et un hémocytomètre mettent 20 000 OPCs purifiées dans le milieu de culture cellulaire OPC 1 mL pour chaque réaction de puce.
    2. Ajouter 27 µL de 36,5 % de formaldéhyde de fixer la suspension cellulaire pendant 10 min à température ambiante.
      ATTENTION : Veuillez noter que le formaldéhyde doit être utilisé sous la hotte chimique pour des raisons de sécurité.
    3. Arrêter l’ADN-protéines de réticulation avec glycine de M 2,5 µL 50 pendant 5 min à température ambiante.
      NOTE : Tous les étapes doivent être effectuées sur la glace ou dans la chambre froide de 4 ° C de ce point.
    4. Laver les granules cellulaires réticulé avec 1 mL de glacee Hanks Balanced sel Solution (HBSS) avec inhibiteur de protéase cocktail et obtenir des cellules granulés par une centrifugeuse refroidie à 300 x g à 4 ° C.
    5. Lyse le culot cellulaire à 25 µL remplir le tampon de lyse pendant 5 min sur la glace.
      NOTE : Agiter le tube pour suspendre les cellules dans le tampon de lyse.
    6. Compléter la cellule lysate glacee HBSS contenant de cisaillement et inhibiteur de la protéase cocktail la chromatine des lysats de cellules préalablement refroidi système sonication avec 5 cycles de 30 : ON s et 30 s OFF programme 75 µl. Toujours laisser agir 6 tubes ensemble et s’assurer que les tubes de solde contiennent 100 µL d’eau.
    7. Après la tonte, centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min 4 ° C et recueillir le surnageant dans un nouveau tube après centrifugation.
    8. Diluer 100 µL de chromatine cisaillée avec le volume égal de glacée complet puce tampon avec l’inhibiteur de la protéase.
    9. Économisez 20 µL de la chromatine cisaillée diluée comme exemple de contrôle d’entrée.
      Remarque : Exemple de contrôle d’entrée est également nécessaire que la comparaison à échantillon immunoprécipitée Olig2 pour identifier Olig2 anticorps immunoprécipitée ADN.
    10. Ajouter 1 µL d’anticorps de lapin anti-olig2 180 µL du dilué cisaillé la chromatine et incuber le tube de réaction sur une roue rotative à 40 tr/min pendant 16 h à 4 ° C.
      Remarque : Exécutez cette étape dans une chambre froide.
    11. Pour chaque réaction de puce, laver 11 µL protéine magnétique A enduit perles avec 55 µL tampon de lavage de perles et de mettre le talon de granule dans 11 µL de tampon de lavage Perle après 2 lavages.
      Remarque : Exécutez cette étape dans une chambre froide.
    12. Pour chaque réaction de puce, ajouter 10 µL de prélavée perles A revêtu de protéine au tube de réaction de puce. Effectuez cette étape dans une chambre froide.
    13. Incuber le tube de réaction de puce à 4 ° C pour un autre 2 h sur une roue en rotation.
    14. Mettre le tube de réaction de ChIP sur la grille magnétique pendant 1 min.
      Remarque : Exécutez cette étape dans une chambre froide.
    15. Retirez le surnageant et ne pas déloger la pastille de perle.
    16. Laver le culot de perle avec 100 µL de chacune des 4 tampons de lavage respectivement pendant 4 min sur une roue tournante à 4 ° C.
    17. Après lavages, ajouter 200 µL de tampon d’élution au culot perle et incuber le tube de réaction de puce à 65 ° C pendant 4 h inverser les ADN-protéines de réticulation.
    18. En outre, ajouter 180 µL de tampon d’élution de l’exemple de contrôle de 20 µL d’entrée et incuber à 65 ° C pendant 4 h inverser la réticulation protéine-ADN ainsi.
    19. Ajouter 200 µL 25:24:1 (v/v) mélange de phénol chloroforme et isoamylique alcool dans chaque tube de réaction de puce.
    20. Vortex vigoureusement pendant 1 min et centrifuger à 13 000 x g pendant 15 min à température ambiante. Transférer la phase supérieure dans un nouveau tube.
    21. Ajouter la solution d’acétate de sodium 3M µL 40, 1 000 µL d’éthanol à 100 % et 2 µL de glycogène precipitant liées de façon covalente à un colorant bleu dans chaque tube de réaction de ChIP pendant la nuit à-20 ° C.
    22. Centrifuger à 13 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
    23. Jeter le surnageant, laver avec l’éthanol à 70 % froid 500 µL et centrifuger à 13 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
    24. Jeter le surnageant, gardez le granulé air sec pendant 10 min et dissoudre le culot avec 50 µL d’eau.
  2. Construction de bibliothèque de puce pour le séquençage haut débit
    1. Nettoyer et concentrer le DNA ChIP avec un kit de nettoyage selon les instructions du fabricant.
    2. Quantifier l’échantillon de la puce pico-vert selon les instructions du fabricant.
    3. Utiliser un kit de ChIP-seq pour T-tailing, réplication et résidus, changement de modèle et extension, l’ajout d’adaptateurs et amplification, sélection de la taille de bibliothèque et la purification selon les instructions du fabricant.
      1. Après dénaturation de l’ADN double brin, déphosphorylent l’extrémité 3' de l’ADN simple brin de phosphatase alkaline de crevette et ajouter une queue poly (T) à l’ADN simple brin de transférase terminale de deoxynucleotidyl.
      2. Recuire le Primer d’ADN Poly (dA) pour le modèle de l’ADN simple brin pour la réplication de l’ADN et le changement de modèle.
      3. Après le modèle de commutation, amplifient la bibliothèque ChIP-seq par PCR avec des amorces pour l’indexation de l’avant et arrière.
      4. Sélectionnez la PCR amplifiés ChIP-seq bibliothèque avec des fragments allant de 250 à 500 bp par des billes paramagnétiques en option 2 pour la sélection de la taille double.
      5. Analyser la qualité de la bibliothèque de ChIP-seq sélectionnée à l’aide d’un appareil d’électrophorèse capillaire-puce microfluidique.

3. analyse des données

  1. Préparer la structure du répertoire.
    1. Créez un répertoire pour l’analyse de données de ChIP-seq. Dans le répertoire nouvellement créé, créez les six sous-répertoires portant les noms suivants : raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis et des rapports.
  2. Préparer les données et effectuer des analyses de contrôle de la qualité des données de séquence brute.
    1. Déplacer vers le répertoire « raw.files » et téléchargez les fichiers de données de ChIP-seq.
    2. Vérifiez les noms de fichiers. Si le séquençage a été jumelé-fin, il y aura 4 fichiers (deux pour le traitement) et deux pour les entrées avec des noms similaires de base : PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq et PDGFRα_input.read2.fastq. Si les fichiers sont différents, les renommer en utilisant la commande « mv ».
    3. Déplacer vers le répertoire « fastqc.output ».
    4. Obtenir des mesures de contrôle de la qualité des lectures brutes à l’aide d’un fastq fichier contrôle qualité logiciel10. Utilisez la commande Figure S1A pour exécuter le processus de contrôle de la qualité séparément pour chaque fichier de fastq. Le logiciel affiche plusieurs mesures de contrôle de la qualité dans un fichier html.
    5. Ouvrez le fichier de contrôle de la qualité de html et de vérifier le nombre de lectures, de lire la longueur, par la qualité de la séquence de base, par scores de qualité de séquence, contenu en GC séquence, niveaux de duplication de séquences, contenu de l’adaptateur et contenu kmer.
  3. Garniture arrière lectures de faible qualité et le contenu de l’adaptateur.
    1. Respecter les « par la qualité de la séquence de base » et « Adaptateur contenu » parcelles. Déterminez la longueur de coupe pour la tête et la queue de chaque lecture. Une longueur suffisante pour que la suppression est où la qualité de base inférieure à 30 et il n’y a preuve du contenu de l’adaptateur.
    2. Déplacer vers le répertoire « raw.files ».
    3. Téléchargez et installez un logiciel pour le règlage lectures11. Utilisez la commande dans Figure S1B pour tailler le traitement tant l’entrée séparément. Paramètre « Récolte » indique la durée de lecture restante après rognage des bases de la fin et « HEADCROP » spécifie le nombre de bases d’être éliminé dès le début de la lecture.
    4. La commande rognage comprend également le minimum lire longueur pour être accepté après filtrage dans le paramètre « DIFOK ». Si les lectures sont au moins 50 bp, bp utilisation 35 sous le seuil de durée de lecture.
    5. Déplacer vers le répertoire « fastqc.output ».
    6. Effectuer l’analyse de contrôle de la qualité du fichier fastq après la coupe des lectures. Vérifiez que les problèmes de contrôle de la qualité ont été résolus. Utilisez la commande Figure S1C pour obtenir les paramètres de contrôle de la qualité.
  4. Alignez l’extrémité simple ou jumelé-fin ChIP-seq lectures au génome de référence de la souris.
    1. Déplacer vers le répertoire « bowtie.output » pour la cartographie.
    2. Télécharger le génome de référence GENCODE mm10 souris. Renommez le génome de référence mm10 souris comme « mm10.fa ».
    3. Téléchargez un mappeur lire12 et installez-le dans le système.
    4. Créer un fichier d’index du génome référence téléchargés à l’aide de la commande en Figure S2A. Six dossiers sont créés automatiquement : mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 et mm10.rev.2.bt2.
    5. Utilisez la commande en Figure S2B pour exécuter l’alignement et de régler le paramètre «-p » au nombre de cœurs de traitement selon vos paramètres système. Si l’exécution en mode couplé-fin, paramètres « -1 » et « -2 » indiquent les noms des fichiers fastq Paré.
      Remarque : La cartographie est effectuée séparément pour les échantillons de traitement et d’entrée et sortie métriques de journaux sont créés pour chaque échantillon.
    6. Télécharger un logiciel permettant de manipuler des fichiers en format de SAM13 et l’installer dans le système. Convertissez le fichier SAM aligné dans un fichier BAM à l’aide de la commande en Figure S2C.
  5. Obtenir des métriques de contrôle de la qualité de lectures mappés avant l’appel pour les deux échantillons de traitement et de contrôle de jumelé-fin de pic.
    1. Une des plus importantes mesures contrôle qualité à l’adresse est la profondeur de séquençage. Ouvrir les fichiers « log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt » et « log.bowtie.PDGFRα_input.txt » dans le répertoire bowtie.output et vérifiez que le nombre de paires de lecture unique mappés dans chaque échantillon est supérieur à 10 millions.
    2. Déplacer vers le répertoire « homer.output ».
    3. Télécharger un logiciel pour la découverte de motif et séquençage de prochaine génération analyse14 et l’installer dans le système.
    4. Créez un répertoire nommé « tagDir ».
    5. Pour vérifier la clonalité de la balise, utilisez la commande représentée dans la Figure S3A. La commande « makeTagDirectory » va générer des quatre files:tagAutocorrelation.txt de sortie de contrôle de la qualité, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt et tagLengthDistribution.txt.
    6. Déplacer vers le répertoire « tagDir ».
    7. Copiez le fichier « tagCountDistribution.txt » dans le répertoire « rapports ».
    8. Déplacer vers le répertoire « rapports ».
    9. Ouvrez le fichier tagCountDistribution.txt à l’aide d’un tableur et créer une barre de terrain le nombre d’étiquettes par poste génomique. Stockez le fichier histogramme avec le nom « tag.clonality.xlsx ».
    10. Installer R15 de la langue de programmation dans le système.
    11. Dans le terminal, tapez « R » et appuyez sur entrée pour accéder à l’environnement de programmation R.
    12. Télécharger un package R pour le traitement des données de ChIP-seq16 et installez-le à l’aide de la commande représentée dans la Figure S3B.
    13. Utilisez le script de R dans Figure S3C pour tracer la corrélation croisée strand.
  6. Détection de pics en utilisant un mappeur de pointe.
    1. Déplacer vers le répertoire « macs2.output ». Téléchargez et installez un mappeur de crête17 dans votre système.
    2. Utilisez la fonction « callpeak » avec le traitement et contrôler les fichiers BAM générés à l’étape 3.4.6.
      Remarque : Autres paramètres incluent «-f » pour le format de fichier d’entrée, «-g » pour obtenir la taille du génome «-nom » permettant d’indiquer le nom de base de tous les fichiers de sortie, et «-B » pour stocker le carambolage de fragment au format bedgraph. Le pic complet appelant commande est inclus dans la Figure S4A. Utilisez BEDPE pour échantillons appariés en bout.
    3. Vérifiez que le mappeur de pointe généré six dossiers : PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg et PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
    4. Ouvrir le fichier PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls pour voir les pics appelés, localisation, longueur, sommet position, carambolage et Etendue de l’enrichissement de la pointe :-log10(pvalue), plier l’enrichissement et - log10(q-value).
  7. Filtrer et annoter appelés pics.
    1. En utilisant le fichier ouvert dans l’étape précédente, filtre résultant des pointes selon l’enrichissement du pli, la p-valeur et/ou la valeur de q. Pour décider des seuils de filtration adéquates, faire un complot de l’histogramme pour déterminer la densité de chaque indicateur. Filtrer les valeurs inférieures à un seuil sélectionné pour obtenir des pics importants.
    2. Télécharger la blacklist mm10 (régions sont connues pour avoir artificiellement élevé signal) et filtrent le ChIP-seq pics qui sont à l’intérieur de ces régions de l’artefact.
    3. Créez un fichier de lit avec les pics filtrés contenant les colonnes suivantes : chromosome, début, fin, peakID, mock et strand. Remplir la colonne simulée par un point «. » car il n’est pas utilisé. Dans la colonne de brin, définissez toutes les valeurs « + ». Enregistrez le fichier lit comme « filtered.peakData2.bed ».
    4. Copiez le fichier « filtered.peakData2.bed » dans le répertoire « rapports ».
    5. Déplacer vers le répertoire « rapports ».
    6. Pour annoter les pics filtrés à une région de gènes spécifiques, utilisez la fonction « annotatePeaks » avec le fichier lit créé à l’étape précédente. La commande utilisée est illustrée à la Figure S5A.
    7. Ouvrez le fichier « filtered.annotatedPeaks.txt » à l’aide d’un logiciel de statistique.
    8. Filtrer les pics qui en résulte se trouvant dans une région intergénique à une distance supérieure à 5 Ko d’une TSS annoté. Utilise la colonne « Distance à TSS » dans le fichier comme étant la distance pour le filtrage. Stocker les sommets filtrées dans un fichier excel nommé « 5kbup.geneBody.peakData.txt ».
    9. Magasin le résultat filtré pics dans un fichier bedGraph avec colonnes : chromosome, début, fin et - log10(q-value). Nommez le fichier « 5kbup.geneBody.peakData.bedGraph ».
  8. Générer des fichiers de bigwig pour visualisation du navigateur.
    1. Télécharger et installer un logiciel pour génome arithmétique18.
    2. Télécharger un outil pour convertir bedgraph en gros bonnet et installer dans le système. Téléchargez le fichier « mm10.chrom.sizes ».
    3. Utilisez la commande dans Figure S6A pour générer un fichier de gros bonnet.
    4. Téléchargez et installez un navigateur de génome19 dans le système.
    5. Ouvrez le navigateur de génome et charger le fichier « 5kbup.geneBody.peakData.bigwig » pour visualiser les pics significatifs filtrées et leur position en ce qui concerne les gènes connus.
  9. Recherche de motif.
    1. Déplacer vers le répertoire « motif.analysis ».
    2. Télécharger un motif de novo de balayage et le programme d’enrichissement de motif et l’installer dans votre système20.
    3. Télécharger une base de données du motif complet qui comprend les motifs de Olig2.
    4. Obtenir les séquences génomiques de 500 régions bp centrées aux sommets de pointe importante. Stocker les séquences comme peak.sequences.txt. Utilisez la commande en S7 Figure pour rechercher des motifs Olig2 dans chacune des régions PIC bp 500.
    5. Filtrer les motifs résultants à l’aide d’une E-valeur adéquate (par défaut = 0,05).

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Résultats

Basse-cellule ChIP-seq a été réalisée et des analyses bioinformatiques ont été effectuées pour étudier les interactions potentielles de facteur de transcription Olig2 avec l’ADN génomique purifié aiguë cerveau OPCs. La figure 1 montre un flux de travail général d’expérimental et la procédure d’analyse de données. Dans ce protocole, les cerveaux de souris postnatal est dissociés en une suspension de cellules individuelles. Après dissociation tissulaire, immuno...

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Discussion

Réseaux de règlement de gène mammifère sont très complexes. ChIP-seq est une méthode puissante pour étudier les interactions ADN-protéines de génome. Ce protocole comprend comment faire Olig2 ChIP-seq en utilisant un nombre faible de l’OPCs purifiées de cerveaux de souris (aussi bas que 20 mille cellules par réaction). La première étape clée pour que ce protocole est la purification de l’OPCs de cerveaux de souris par immunopanning avec anticorps PDGFRα. Pour la sélection positive de l’OPCs avec plaques PDGFRα enduit, OP...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

JQW, XD, DEDC et YY appuyés par les subventions accordées par les instituts nationaux de santé R01 NS088353 ; 01-NIH grant 1R21AR071583 ; la Fondation Hermann de Staman Ogilvie fonds-Memorial ; l’Initiative de cerveau de UTHealth et le CSTC UL1 TR000371 ; et une subvention de l’Université du Texas système Neuroscience et Institut de neurotechnologie (Grant #362469).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
réactif/équipement
Banderiaea simplicifolia lectine 1Vector Laboratories# L-1100
Anticorps anti-PDGFRa pour ratBD Bioscience# 558774
Kit de dissociation du tissu neural (P)MACS Miltenyi Biotec# 130-092-628
AccutaseTechnologies STEMCELL# 07920
TRIzolThermo Fisher# 15596026
Anti-NG2 Chondroïtine Sulfate ProtéoglycaneAnticorps Millipore# AB5320
Bioruptor Pico sonication dispositifDiagenode# B01060001
True MicroChIP kitDiagenode# C01010130
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1, v/v)Thermo Fisher# 15593031
NucleoSpin Gel et kit de nettoyage PCRMACHEREY-NAGEL# 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA AssayKit Thermo Fisher# P11496
DNA SMART ChIP-Seqkit Clontech Laboratories# 634865
Agencourt AMPure XPBeckman Voulter# A63880
GlycoBlueThermo Fisher# AM9516
pico-greenThermo Fisher# P11496
D-PBSThermo Fisher# 14190-144
SYBR Green master mixBio-Rad Laboratories# 1725124
DMEM/F12Fisher Scientific# 11-320-033
Pénicilline-Streptomycine (P/S)Fisher Scientific# 15140122
N-2 SupplémentFisher Scientific# 17502048
B-27 SupplémentFisher Scientific# 17504044
insulineSigma# I6634Préparez une solution d’insuline à 0,5 mg/ml en dissolvant 5 mg d’insuline dans 10 ml d’eau et 50 &mu ; l de 1 N HCl.
Albumine sérique bovine, adaptée à la culture cellulaire (BSA)Sigma# A4161Préparez une solution de BSA à 4 % en dissolvant 4 g de BSA dans 100 ml de D-PBS et ajustez le pH à 7,4
Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF)EMD Millipore# GF003
HUMAN PDGF-AAVWR# 102061-188
poly-D-lysineVWR# IC15017510Préparez une solution de poly-D-lysine à 1 mg/ml en dissolvant 10 mg de poly-D-lysine dans 10 ml d’eau et diluez 100 fois lors de l’utilisation.
Boîtes de Pétri jetables Falcon, Stérile, Corning, 100x15mmVWR# 25373-100
Boîtes de Pétri jetables Falcon, Stérile, Corning, 150x15mmVWR# 25373-187
HBSS, 10X, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénolFisher Scientific# 14185-052
Trypan BlueStemcell Technologies# 07050
cocktail d’inhibiteur de protéaseSigma# 11697498001
Software
FastQC[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Obtention de métriques de contrôle qualité des lectures brutes et tronquées
Trimmomatic 0.33[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomaticTronquage et filtrage des lectures brutes
GENCODE mm10ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gzGénome de référence de souris
Bowtie2 2.2.4[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtmlAlignement des lectures sur un génome de référence
SAMTools 1.5[13] http://samtools.sourceforge.net/Conversion d’un fichier SAM au format BAM
HOMER 4.9.1[14] http://homer.ucsd.edu/homer/Création d’un répertoire de balises et annotation de régions génomiques enrichies avec des symboles de gènes
R 3.2.2[15] https://www.R-project.org/Programmation de scripts et exécution de fonctions
SPP 1.13[16] https://github.com/hms-dbmi/sppCréation d’un tracé de corrélation croisée
de brins MACS2 2.2.4[17] https://github.com/taoliu/MACSRecherche de régions d’enrichissement ChIP par rapport
au contrôle BEDTools 2.25[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/Arithmétique du génome
bedGraphToBigWighttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/Conversion d’un fichier bedGraph en
navigateur IGV bigwig 2.3.58[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/Visualisation et navigation de pics significatifs ChIP-seq
ExcelSpreasheet programme
Liste noire d’ENCODEhttps://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklistsFiltrage pics
mm10.chrom.sizeshttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.Conversion du fichier bedGraph en
base de données de motifs d’ENCODE[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/Base de données complète de motifs requise pour l’enrichissement des motifs
MEME-ChIP[20] http://meme-suite.org/index.htmlAnalyse de l’enrichissement des motifs et découverte de
motifsPrimer names used for qPCRSéquences d’amorces utilisées pour la qPCR
Mbp-F :CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R :AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F :ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R :GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F :GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R :TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-FATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-RCATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-FTTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-RGATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFR&alpha ;-FAGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFR&alpha ;-RGTCCCTCCACGGTACTCCT
Microsoft

Références

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