Identification des Sites de facteur de Transcription Olig2 génomique fixation aiguë purifiée cellules PDGFRα + par immunoprécipitation de la chromatine Low-cellule analyse de séquençage

Il est important d’étudier les protéines (ou complexe protéique) liaisons de l’ADN et les marques épigénétiques pour construire des réseaux de régulation transcriptionnelles impliqués dans divers processus biologiques. En particulier, les liaisons des facteurs de transcription de l’ADN génomique peuvent jouer un rôle important dans la régulation des gènes, la différenciation cellulaire et le développement des tissus. Un outil puissant pour l’étude de la régulation transcriptionnelle et mécanismes épigénétiques est immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). En raison des progrès rapides dans la prochaine génération de technologies de séquençage, puces couplé avec le séquençage haut-débit (ChIP-seq) est utilisé pour les analyses des liaisons protéine-ADN et les marques épigénétiques¹. Toutefois, un protocole standard de ChIP-seq nécessite environ 20 millions de cellules par réaction, ce qui rend l’application de cette technique difficile lorsque le nombre de cellules est limité, tels que l’isolement de cellules primaires et populations cellulaires rares.

Oligodendrocytes lignée, y compris les cellules de précurseurs d’oligodendrocytes (OPC) et des oligodendrocytes sont largement distribués dans tout le cerveau et sont essentiels pour le développement et le fonctionnement du cerveau. Comme un type de cellules précurseurs, OPCs sont capables d’auto-renouvellement et de différenciation. OPC non seulement service de progéniteurs d’oligodendrocytes, mais joue également un rôle important dans la propagation de la signalisation neuronale en communiquant avec d’autres types de cellules de cerveau². Des études antérieures ont suggéré que le développement des oligodendrocytes est régulée par des facteurs de transcription spécifiques lignée telles que Olig2 et Sox10^3,4. Ces facteurs de transcription ont été trouvés pour lier aux régions promoteur ou exhausteur de certains gènes cruciaux pour influencer leur expression au cours de la spécification de l’oligodendrocyte et la différenciation. Toutefois, il est difficile d’identifier la liaison ADN des protéines (ou complexe protéique) présentant un intérêt en aiguë purifiées OPCs primaires avec un nombre très limité de cellules.

Ce protocole décrit comment examiner systématiquement l’immunoprécipitée ADN génomique par Olig2 en OPCs purifié de la souris à l’échelle du génome en utilisant la technique de ChIP-seq. OPCs de cerveaux de souris ont été intensément purifiées par immunopanning et utilisés dans une expérience de puce sans prolifération in vitro. Un nombre limité de l’OPCs peut être obtenu par immunopanning et est insuffisant pour des expériences de ChIP-seq standards. Dans les présentes, un protocole de ChIP-seq basse-cellule avec aussi peu que 20 mille cellules par réaction de la puce pour les facteurs de transcription est décrit. En bref, réticulé de cellules ont été lysées et sonication par un dispositif de sonication pour cisailler la chromatine. La chromatine cisaillée est incubée avec Olig2 anticorps, mais aussi des protéines A recouvert de perles pour précipiter l’ADN génomique anticorps lié Olig2. Après élution de billes de protéine A revêtu et réticulation inverse, précipitée par les anticorps Olig2 de l’ADN génomique a été purifiée par extraction au phénol-chloroforme. Le produit obtenu a été quantifié et T-tailing, apprêt recuit changement de modèle et de l’extension, l’ajout d’adaptateurs et amplification, sélection de la taille de bibliothèque et de purification les étapes pour la construction de bibliothèque de ChIP-seq.

Après le séquençage, la qualité des lectures brutes de l’échantillon préparé avec de l’anticorps de Olig2 transcription factor et l’échantillon de contrôle a été analysée. Paires de bases de faible qualité et adaptateur contenant lire des fragments ont été taillés. Ensuite, parés de lectures étaient alignés sur le génome de référence de souris. Les régions génomiques qui ont considérablement enrichies pour les lectures de puce, par rapport au témoin, ont été détectés comme des pics. Des pics importants, représentant de potentiels sites de fixation de facteurs de transcription, ont été filtrés et visualisés dans un navigateur de génome.

Notamment, la méthode décrite dans le présent protocole peut être largement utilisée pour ChIP-seq, d’autres facteurs de transcription avec n’importe quel type de cellule d’un nombre limité.

Toute utilisation animale et les protocoles expérimentaux ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par le Comité institutionnel de biosécurité et le Comité sur le bien-être Animal à l’Université du Texas Health Science Center à Houston.

1. purification de PDGFRα positifs Oligodendrocyte lignée cellules de cerveau de souris (modifié d’après immunopanning décrites précédemment protocoles^5,6,,⁷)

1. Préparation d’une plaque d’immunopanning pour la sélection positive de cellules PDGFRα et 2 plaques pour l’appauvrissement de la couche de cellules endothéliales et les cellules microgliales.
   Remarque : Veuillez noter que boîtes de Pétri, mais pas les récipients de culture cellulaire travaillent pour immunopanning expérience ; Si les cellules purifiées seront utilisés pour la culture, immunopanning étapes doivent être effectuées dans la prévention des risques biotechnologiques armoire
   1. Enduire un 10 cm Pétri avec 30 µL chèvre anti-rat IgG dans 10 mL de pH 9.5, Tris-HCl 50 mM durant la nuit à 4 ° C. Agiter la plaque pour s’assurer que les surfaces des plaques sont uniformément et entièrement couverts par la solution de revêtement.
   2. Préparer PDGFRα anticorps solution en diluant à 40 µL d’anticorps anti-PDGFRα rat avec 12 mL de tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD) contenant 0,2 % de BSA.
   3. Après 3 lavages des IgG enduit plaque 10 ml 1 x DPBS chaque, incuber IgG-enduit plaque avec la solution d’anticorps PDGFRα à température ambiante pendant 4 h.
   4. Laver la plaque de recouverts d’anticorps anti-PDGFRα rat 3 fois 10 ml 1 x DPBS chaque. Ajouter doucement la solution de SPD le long du mur du côté de la plaque et ne pas déranger les surfaces revêtues.
   5. Manteau 2 nouveaux plats de Pétri de 15 cm pour l’appauvrissement de la couche de cellules endothéliales et les cellules microgliales avec 20 mL de SPD contenant 2,3 µg/mL de Banderiaea simplicifolia lectine 1 (BSL-1) pendant 2 h.
   6. Laver que le BSL-1 enduit plaques 3 fois avec 20 mL 1 x DPBS. Ajouter doucement la solution de SPD le long de la paroi latérale des plaques et ne pas déranger les surfaces revêtues.
2. Purification de PDGFRα positifs oligodendrocytes lignée est modifié à partir de méthodes publiées antérieurement^{6 , 7 , 8}.
   1. Disséquer les tissus corticaux de postnatal 2 jour 7 (P7) cerveaux de souris selon précédemment protocoles publiés^5,6.
   2. Dissocier les tissus afin de générer une suspension de cellules individuelles avec dissociation de tissu neural Kit (P) selon les instructions du fabricant détaillée.
   3. En bref, couper les tissus corticaux découpées en morceaux avec un scalpel et les soumettre à une digestion enzymatique à 37 ° C. Après digestion, manuellement dissocier les morceaux avec verre poli feu que pipettes Pasteur dans une suspension de cellules individuelles.
   4. Centrifuger la suspension monocellulaire à 300 x g pendant 10 min à température ambiante et suspendre le culot cellulaire à l’aide de 15 mL de tampon d’immunopanning (immunopanning tampon est SPD avec 0,02 % de BSA et de 5 µg/mL d’insuline).
   5. Incuber la suspension monocellulaire de cerveaux de souris 2 séquentiellement sur 2 plaques de BSL-1 enduit pendant 15 min à température ambiante avec une agitation modérée de la plaque toutes les 5 min afin d’assurer une meilleure déplétion de la microglie et les cellules endothéliales.
   6. Agiter doucement de la plaque afin de recueillir les cellules non adhérentes de la suspension cellulaire et les incuber sur la plaque de recouverts d’anticorps rat-PDGFRα pendant 45 min à température ambiante.
   7. Après l’incubation de la suspension cellulaire sur la plaque de recouverts d’anticorps rat-PDGFRα, doucement agiter la plaque pour collecter la suspension cellulaire et rincer la plaque 8 fois avec SPD pour se débarrasser des cellules non adhérentes. Doucement, ajouter la solution de lavage le long du mur du côté de la plaque et agiter la plaque plusieurs fois pour se débarrasser des cellules non adhérentes.
   8. Détacher les cellules de la plaque de rat-PDGFRα recouverts d’anticorps utilisant un 4 mL de traitement de solution pour le détachement cellulaire pendant 10 min à 37 ° C. Secouer la plaque pour déloger les cellules adhérentes.
   9. Recueillir l’OPCs purifiées par centrifugation à 300 x g à la température ambiante, de suspendre le culot cellulaire avec milieu de culture cellulaire OPC 2 mL et de compter les cellules en utilisant le bleu trypan et un hémocytomètre (milieu de culture cellulaire de 500 mL est un milieu DMEM/F12 contenant 5 mL solution de pénicilline-streptomycine (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 µg/mL d’insuline, 0,1 % de BSA, 20 ng/mL bFGF et 10 ng/mL PDGFRα).
3. Validation de la pureté de l’OPCs après immunopanning.
   1. Afin d’évaluer l’enrichissement de l’OPCs, après immunopanning, utiliser une partie de l’OPCs purifiées pour l’extraction de l’ARN avec une extraction de thiocyanate basé de guanidium conformément aux instructions du fabricant.
   2. Effectuer qRT-PCR en utilisant le mélange principal colorant vert fluorescent à vérifier pour l’enrichissement de l’expression de PDGFRα dans OPCs purifiées par rapport aux neurones dissociés selon les documents publiés antérieurement⁴.
   3. Des graines en outre, certains OPCs purifiées dans la Poly-D-Lysine enduite 24 plaques bien immunomarquage avec anti-NG2 chondroïtine sulfate protéoglycane (NG2) anticorps précédemment publié matériaux⁹.

2. basse-cellule puce préparation et Construction de bibliothèque de puce pour le séquençage haut débit

1. Préparation puce basse-cellule OLIG2 avec un système de sonication commercialement disponibles et un certain nombre de cellules faible commercialement disponibles puce kit (voir Table des matières) en suivant les procédures standards d’instructions du fabricant.
   1. Après avoir détaché de l’anti-PDGFRα rat plaque revêtus d’anticorps et la cellule de comptage avec le bleu trypan et un hémocytomètre mettent 20 000 OPCs purifiées dans le milieu de culture cellulaire OPC 1 mL pour chaque réaction de puce.
   2. Ajouter 27 µL de 36,5 % de formaldéhyde de fixer la suspension cellulaire pendant 10 min à température ambiante.
      ATTENTION : Veuillez noter que le formaldéhyde doit être utilisé sous la hotte chimique pour des raisons de sécurité.
   3. Arrêter l’ADN-protéines de réticulation avec glycine de M 2,5 µL 50 pendant 5 min à température ambiante.
      NOTE : Tous les étapes doivent être effectuées sur la glace ou dans la chambre froide de 4 ° C de ce point.
   4. Laver les granules cellulaires réticulé avec 1 mL de glacee Hanks Balanced sel Solution (HBSS) avec inhibiteur de protéase cocktail et obtenir des cellules granulés par une centrifugeuse refroidie à 300 x g à 4 ° C.
   5. Lyse le culot cellulaire à 25 µL remplir le tampon de lyse pendant 5 min sur la glace.
      NOTE : Agiter le tube pour suspendre les cellules dans le tampon de lyse.
   6. Compléter la cellule lysate glacee HBSS contenant de cisaillement et inhibiteur de la protéase cocktail la chromatine des lysats de cellules préalablement refroidi système sonication avec 5 cycles de 30 : ON s et 30 s OFF programme 75 µl. Toujours laisser agir 6 tubes ensemble et s’assurer que les tubes de solde contiennent 100 µL d’eau.
   7. Après la tonte, centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min 4 ° C et recueillir le surnageant dans un nouveau tube après centrifugation.
   8. Diluer 100 µL de chromatine cisaillée avec le volume égal de glacée complet puce tampon avec l’inhibiteur de la protéase.
   9. Économisez 20 µL de la chromatine cisaillée diluée comme exemple de contrôle d’entrée.
      Remarque : Exemple de contrôle d’entrée est également nécessaire que la comparaison à échantillon immunoprécipitée Olig2 pour identifier Olig2 anticorps immunoprécipitée ADN.
   10. Ajouter 1 µL d’anticorps de lapin anti-olig2 180 µL du dilué cisaillé la chromatine et incuber le tube de réaction sur une roue rotative à 40 tr/min pendant 16 h à 4 ° C.
       Remarque : Exécutez cette étape dans une chambre froide.
   11. Pour chaque réaction de puce, laver 11 µL protéine magnétique A enduit perles avec 55 µL tampon de lavage de perles et de mettre le talon de granule dans 11 µL de tampon de lavage Perle après 2 lavages.
       Remarque : Exécutez cette étape dans une chambre froide.
   12. Pour chaque réaction de puce, ajouter 10 µL de prélavée perles A revêtu de protéine au tube de réaction de puce. Effectuez cette étape dans une chambre froide.
   13. Incuber le tube de réaction de puce à 4 ° C pour un autre 2 h sur une roue en rotation.
   14. Mettre le tube de réaction de ChIP sur la grille magnétique pendant 1 min.
       Remarque : Exécutez cette étape dans une chambre froide.
   15. Retirez le surnageant et ne pas déloger la pastille de perle.
   16. Laver le culot de perle avec 100 µL de chacune des 4 tampons de lavage respectivement pendant 4 min sur une roue tournante à 4 ° C.
   17. Après lavages, ajouter 200 µL de tampon d’élution au culot perle et incuber le tube de réaction de puce à 65 ° C pendant 4 h inverser les ADN-protéines de réticulation.
   18. En outre, ajouter 180 µL de tampon d’élution de l’exemple de contrôle de 20 µL d’entrée et incuber à 65 ° C pendant 4 h inverser la réticulation protéine-ADN ainsi.
   19. Ajouter 200 µL 25:24:1 (v/v) mélange de phénol chloroforme et isoamylique alcool dans chaque tube de réaction de puce.
   20. Vortex vigoureusement pendant 1 min et centrifuger à 13 000 x g pendant 15 min à température ambiante. Transférer la phase supérieure dans un nouveau tube.
   21. Ajouter la solution d’acétate de sodium 3M µL 40, 1 000 µL d’éthanol à 100 % et 2 µL de glycogène precipitant liées de façon covalente à un colorant bleu dans chaque tube de réaction de ChIP pendant la nuit à-20 ° C.
   22. Centrifuger à 13 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
   23. Jeter le surnageant, laver avec l’éthanol à 70 % froid 500 µL et centrifuger à 13 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
   24. Jeter le surnageant, gardez le granulé air sec pendant 10 min et dissoudre le culot avec 50 µL d’eau.
2. Construction de bibliothèque de puce pour le séquençage haut débit
   1. Nettoyer et concentrer le DNA ChIP avec un kit de nettoyage selon les instructions du fabricant.
   2. Quantifier l’échantillon de la puce pico-vert selon les instructions du fabricant.
   3. Utiliser un kit de ChIP-seq pour T-tailing, réplication et résidus, changement de modèle et extension, l’ajout d’adaptateurs et amplification, sélection de la taille de bibliothèque et la purification selon les instructions du fabricant.
      1. Après dénaturation de l’ADN double brin, déphosphorylent l’extrémité 3' de l’ADN simple brin de phosphatase alkaline de crevette et ajouter une queue poly (T) à l’ADN simple brin de transférase terminale de deoxynucleotidyl.
      2. Recuire le Primer d’ADN Poly (dA) pour le modèle de l’ADN simple brin pour la réplication de l’ADN et le changement de modèle.
      3. Après le modèle de commutation, amplifient la bibliothèque ChIP-seq par PCR avec des amorces pour l’indexation de l’avant et arrière.
      4. Sélectionnez la PCR amplifiés ChIP-seq bibliothèque avec des fragments allant de 250 à 500 bp par des billes paramagnétiques en option 2 pour la sélection de la taille double.
      5. Analyser la qualité de la bibliothèque de ChIP-seq sélectionnée à l’aide d’un appareil d’électrophorèse capillaire-puce microfluidique.

3. analyse des données

1. Préparer la structure du répertoire.
   1. Créez un répertoire pour l’analyse de données de ChIP-seq. Dans le répertoire nouvellement créé, créez les six sous-répertoires portant les noms suivants : raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis et des rapports.
2. Préparer les données et effectuer des analyses de contrôle de la qualité des données de séquence brute.
   1. Déplacer vers le répertoire « raw.files » et téléchargez les fichiers de données de ChIP-seq.
   2. Vérifiez les noms de fichiers. Si le séquençage a été jumelé-fin, il y aura 4 fichiers (deux pour le traitement) et deux pour les entrées avec des noms similaires de base : PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq et PDGFRα_input.read2.fastq. Si les fichiers sont différents, les renommer en utilisant la commande « mv ».
   3. Déplacer vers le répertoire « fastqc.output ».
   4. Obtenir des mesures de contrôle de la qualité des lectures brutes à l’aide d’un fastq fichier contrôle qualité logiciel¹⁰. Utilisez la commande Figure S1A pour exécuter le processus de contrôle de la qualité séparément pour chaque fichier de fastq. Le logiciel affiche plusieurs mesures de contrôle de la qualité dans un fichier html.
   5. Ouvrez le fichier de contrôle de la qualité de html et de vérifier le nombre de lectures, de lire la longueur, par la qualité de la séquence de base, par scores de qualité de séquence, contenu en GC séquence, niveaux de duplication de séquences, contenu de l’adaptateur et contenu kmer.
3. Garniture arrière lectures de faible qualité et le contenu de l’adaptateur.
   1. Respecter les « par la qualité de la séquence de base » et « Adaptateur contenu » parcelles. Déterminez la longueur de coupe pour la tête et la queue de chaque lecture. Une longueur suffisante pour que la suppression est où la qualité de base inférieure à 30 et il n’y a preuve du contenu de l’adaptateur.
   2. Déplacer vers le répertoire « raw.files ».
   3. Téléchargez et installez un logiciel pour le règlage lectures¹¹. Utilisez la commande dans Figure S1B pour tailler le traitement tant l’entrée séparément. Paramètre « Récolte » indique la durée de lecture restante après rognage des bases de la fin et « HEADCROP » spécifie le nombre de bases d’être éliminé dès le début de la lecture.
   4. La commande rognage comprend également le minimum lire longueur pour être accepté après filtrage dans le paramètre « DIFOK ». Si les lectures sont au moins 50 bp, bp utilisation 35 sous le seuil de durée de lecture.
   5. Déplacer vers le répertoire « fastqc.output ».
   6. Effectuer l’analyse de contrôle de la qualité du fichier fastq après la coupe des lectures. Vérifiez que les problèmes de contrôle de la qualité ont été résolus. Utilisez la commande Figure S1C pour obtenir les paramètres de contrôle de la qualité.
4. Alignez l’extrémité simple ou jumelé-fin ChIP-seq lectures au génome de référence de la souris.
   1. Déplacer vers le répertoire « bowtie.output » pour la cartographie.
   2. Télécharger le génome de référence GENCODE mm10 souris. Renommez le génome de référence mm10 souris comme « mm10.fa ».
   3. Téléchargez un mappeur lire¹² et installez-le dans le système.
   4. Créer un fichier d’index du génome référence téléchargés à l’aide de la commande en Figure S2A. Six dossiers sont créés automatiquement : mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 et mm10.rev.2.bt2.
   5. Utilisez la commande en Figure S2B pour exécuter l’alignement et de régler le paramètre «-p » au nombre de cœurs de traitement selon vos paramètres système. Si l’exécution en mode couplé-fin, paramètres « -1 » et « -2 » indiquent les noms des fichiers fastq Paré.
      Remarque : La cartographie est effectuée séparément pour les échantillons de traitement et d’entrée et sortie métriques de journaux sont créés pour chaque échantillon.
   6. Télécharger un logiciel permettant de manipuler des fichiers en format de SAM¹³ et l’installer dans le système. Convertissez le fichier SAM aligné dans un fichier BAM à l’aide de la commande en Figure S2C.
5. Obtenir des métriques de contrôle de la qualité de lectures mappés avant l’appel pour les deux échantillons de traitement et de contrôle de jumelé-fin de pic.
   1. Une des plus importantes mesures contrôle qualité à l’adresse est la profondeur de séquençage. Ouvrir les fichiers « log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt » et « log.bowtie.PDGFRα_input.txt » dans le répertoire bowtie.output et vérifiez que le nombre de paires de lecture unique mappés dans chaque échantillon est supérieur à 10 millions.
   2. Déplacer vers le répertoire « homer.output ».
   3. Télécharger un logiciel pour la découverte de motif et séquençage de prochaine génération analyse¹⁴ et l’installer dans le système.
   4. Créez un répertoire nommé « tagDir ».
   5. Pour vérifier la clonalité de la balise, utilisez la commande représentée dans la Figure S3A. La commande « makeTagDirectory » va générer des quatre files:tagAutocorrelation.txt de sortie de contrôle de la qualité, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt et tagLengthDistribution.txt.
   6. Déplacer vers le répertoire « tagDir ».
   7. Copiez le fichier « tagCountDistribution.txt » dans le répertoire « rapports ».
   8. Déplacer vers le répertoire « rapports ».
   9. Ouvrez le fichier tagCountDistribution.txt à l’aide d’un tableur et créer une barre de terrain le nombre d’étiquettes par poste génomique. Stockez le fichier histogramme avec le nom « tag.clonality.xlsx ».
   10. Installer R¹⁵ de la langue de programmation dans le système.
   11. Dans le terminal, tapez « R » et appuyez sur entrée pour accéder à l’environnement de programmation R.
   12. Télécharger un package R pour le traitement des données de ChIP-seq¹⁶ et installez-le à l’aide de la commande représentée dans la Figure S3B.
   13. Utilisez le script de R dans Figure S3C pour tracer la corrélation croisée strand.
6. Détection de pics en utilisant un mappeur de pointe.
   1. Déplacer vers le répertoire « macs2.output ». Téléchargez et installez un mappeur de crête¹⁷ dans votre système.
   2. Utilisez la fonction « callpeak » avec le traitement et contrôler les fichiers BAM générés à l’étape 3.4.6.
      Remarque : Autres paramètres incluent «-f » pour le format de fichier d’entrée, «-g » pour obtenir la taille du génome «-nom » permettant d’indiquer le nom de base de tous les fichiers de sortie, et «-B » pour stocker le carambolage de fragment au format bedgraph. Le pic complet appelant commande est inclus dans la Figure S4A. Utilisez BEDPE pour échantillons appariés en bout.
   3. Vérifiez que le mappeur de pointe généré six dossiers : PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg et PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
   4. Ouvrir le fichier PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls pour voir les pics appelés, localisation, longueur, sommet position, carambolage et Etendue de l’enrichissement de la pointe :-log10(pvalue), plier l’enrichissement et - log10(q-value).
7. Filtrer et annoter appelés pics.
   1. En utilisant le fichier ouvert dans l’étape précédente, filtre résultant des pointes selon l’enrichissement du pli, la p-valeur et/ou la valeur de q. Pour décider des seuils de filtration adéquates, faire un complot de l’histogramme pour déterminer la densité de chaque indicateur. Filtrer les valeurs inférieures à un seuil sélectionné pour obtenir des pics importants.
   2. Télécharger la blacklist mm10 (régions sont connues pour avoir artificiellement élevé signal) et filtrent le ChIP-seq pics qui sont à l’intérieur de ces régions de l’artefact.
   3. Créez un fichier de lit avec les pics filtrés contenant les colonnes suivantes : chromosome, début, fin, peakID, mock et strand. Remplir la colonne simulée par un point «. » car il n’est pas utilisé. Dans la colonne de brin, définissez toutes les valeurs « + ». Enregistrez le fichier lit comme « filtered.peakData2.bed ».
   4. Copiez le fichier « filtered.peakData2.bed » dans le répertoire « rapports ».
   5. Déplacer vers le répertoire « rapports ».
   6. Pour annoter les pics filtrés à une région de gènes spécifiques, utilisez la fonction « annotatePeaks » avec le fichier lit créé à l’étape précédente. La commande utilisée est illustrée à la Figure S5A.
   7. Ouvrez le fichier « filtered.annotatedPeaks.txt » à l’aide d’un logiciel de statistique.
   8. Filtrer les pics qui en résulte se trouvant dans une région intergénique à une distance supérieure à 5 Ko d’une TSS annoté. Utilise la colonne « Distance à TSS » dans le fichier comme étant la distance pour le filtrage. Stocker les sommets filtrées dans un fichier excel nommé « 5kbup.geneBody.peakData.txt ».
   9. Magasin le résultat filtré pics dans un fichier bedGraph avec colonnes : chromosome, début, fin et - log10(q-value). Nommez le fichier « 5kbup.geneBody.peakData.bedGraph ».
8. Générer des fichiers de bigwig pour visualisation du navigateur.
   1. Télécharger et installer un logiciel pour génome arithmétique¹⁸.
   2. Télécharger un outil pour convertir bedgraph en gros bonnet et installer dans le système. Téléchargez le fichier « mm10.chrom.sizes ».
   3. Utilisez la commande dans Figure S6A pour générer un fichier de gros bonnet.
   4. Téléchargez et installez un navigateur de génome¹⁹ dans le système.
   5. Ouvrez le navigateur de génome et charger le fichier « 5kbup.geneBody.peakData.bigwig » pour visualiser les pics significatifs filtrées et leur position en ce qui concerne les gènes connus.
9. Recherche de motif.
   1. Déplacer vers le répertoire « motif.analysis ».
   2. Télécharger un motif de novo de balayage et le programme d’enrichissement de motif et l’installer dans votre système²⁰.
   3. Télécharger une base de données du motif complet qui comprend les motifs de Olig2.
   4. Obtenir les séquences génomiques de 500 régions bp centrées aux sommets de pointe importante. Stocker les séquences comme peak.sequences.txt. Utilisez la commande en S7 Figure pour rechercher des motifs Olig2 dans chacune des régions PIC bp 500.
   5. Filtrer les motifs résultants à l’aide d’une E-valeur adéquate (par défaut = 0,05).

Basse-cellule ChIP-seq a été réalisée et des analyses bioinformatiques ont été effectuées pour étudier les interactions potentielles de facteur de transcription Olig2 avec l’ADN génomique purifié aiguë cerveau OPCs. La figure 1 montre un flux de travail général d’expérimental et la procédure d’analyse de données. Dans ce protocole, les cerveaux de souris postnatal est dissociés en une suspension de cellules individuelles. Après dissociation tissulaire, immunopanning fut jouée pour purifier l’OPCs à l’aide d’anticorps PDGFRα. La figure 2 illustre l’enrichissement significatif de PDGFRα, peu d’expression du marqueur de neurone Tuj1 (neurone-spécifique classe III beta-tubuline), l’astrocyte marqueur GFAP (glial fibrillary protéine acide), adaptateur de liaison du calcium ionisé de marqueur de cellules microgliales molécule 1 (Iba1), myélinisantes mature protéine basique de la myéline marqueur oligodendrocytes (Mbp) et de la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (Mog) de l’OPCs purifiées, telle qu’évaluée par RT-qPCR. En outre, immunomarquage résultat indique la plupart des cellules sont NG2 positif tel qu’illustré à la Figure 2. Par la suite, 20 mille OPCs purifiées par réaction ont été fixés par le formaldéhyde et la chromatine a été cisaillée en utilisant un système de sonication. OLIG2 basse-cellule ChIP a été réalisée et la bibliothèque a été construite. Après préparation de puce de bibliothèque, la qualité du produit généré a été validée par un appareil d’électrophorèse capillaire-puce microfluidique. La figure 3 montre électrophorégramme exemple d’une bibliothèque de puce Olig2 basse-cellule. Un produit de bibliothèque pointe claire de Oligo2 variant de 250 à 500 bp doit être visible après sélection de la taille du produit PCR de bibliothèque. Les bibliothèques de ChIP-seq des deux l’échantillon préparé avec Olig2 anticorps de transcription factor et l’échantillon de contrôle ont été soumis au séquençage haut-débit pour produire 50 jumelé-fin cycle de lectures de séquençage. Lire plus longs les tarifs de la cartographie et réduira la probabilité de multi-cartographie, au détriment des coûts de séquençage. Avec 50 bibliothèques de séquençage jumelé-fin de ChIP-seq de bp, sont généralement obtenir de bons résultats.

Après l’évaluation de contrôle de la qualité initiale des lectures brutes et tailler des adaptateurs de début et de paires de bases de faible qualité, les parcelles de contrôle de qualité sont représentés dans la Figure 4. Lectures parés devraient avoir une qualité de base supérieure à 30, aucune séquence de l’adaptateur et ont un taux de reproduction faible (Figure 4 b-D). Bonne qualité parée lit augmentera le taux d’alignement global. Autres paramètres tels que le contenu en GC sont également importantes et devraient être envisagés pour tailler.

Une fois que les échantillons de séquençage sont alignés, il est nécessaire de vérifier la profondeur de séquençage. On sait que le nombre de pics appelés augmentera avec une profondeur de séquençage plus élevée puisque les sites faibles deviendra plus significative21. Une analyse de la saturation est nécessaire pour déterminer une profondeur suffisante de séquencement pour chaque facteur de transcription spécifiques utilisé, aux frais de temps et de budget. Une profondeur de séquençage d’un consensus pour la liaison de facteur de transcription a été suggérée par le consortium ENCODE au sujet des échantillons chez les mammifères : un minimum de 10 millions mappée unique lectures pour chacun au moins deux biologiques réplique22. Le nombre de lectures unique mappés et le taux global d’alignement ont été calculé par le mappeur de lecture. Un exemple de paramètres de mappage bon est illustré dans la Figure 5 a. Alignés lectures doivent être mappés à des emplacements distincts génomiques, indiquant une complexité bibliothèque adéquate, également dénommée clonalité tag. Le consortium ENCODE suggère qu’au moins 80 % de la 10 millions de lectures alignés doivent être mappé aux différentes régions génomiques22. Figure 5 b montre une clonalité tag adéquat dans lequel plus de 90 % les lectures sont mappés à un seul emplacement génomique. Bibliothèques de faible complexité se produisent généralement quand pas assez d’ADN est obtenue, et la PCR amplifiés fragments sont séquencés à plusieurs reprises. Une bibliothèque de faible complexité permettra d’obtenir un taux de détection de crête élevée de faux.

Lors de l’utilisation des données de ChIP-seq bout jumelé, fragments s’entortiller autour du facteur de transcription avec une certaine distance de séparation. Jumelé-fin séquençage permettra une estimation plus précise de la longueur des fragments de moyenne ce qui donne une meilleure estimation des régions génomiques où a eu lieu la plus contraignante. L’intrigue de corrélation brin représente un pic d’enrichissement correspondant à la longueur des fragments prédominant. Comme indiqué dans la Figure 5, la longueur des fragments calculée est de 130 bp alors que la longueur de lecture est 50 bp. Un dataset de ChIP-seq, où la longueur des fragments est plus longue que la durée de lecture est révélatrice de haute qualité,16.

La sortie de l’appel de pic est une liste de régions génomiques susceptibles d’être lié par le facteur de transcription (ou son complexe). La liste des régions génomiques ou pics est incluse dans un fichier de « lit » qui peut-être être affiché dans un navigateur de génome. Pour chaque pic, ce fichier contient un ID de pointe, l’emplacement génomique du sommet du PIC et le FDR-log10 (q-valeur). Les pics significativement enrichis sont ceux avec pli-enrichissement supérieur et mesures d’importance. Un exemple de fichier de sortie crête est montré dans la Figure 6 a. Après avoir sélectionné des pics importants personnalisé seuils, filtrage pics dans liste noire23 d’Encoderet identifier les pics dans la région de promoteur d’un gène (corps de gène en amont et tout 5 Ko), un fichier « gros bonnet » est utile pour l’affichage des sommets dans un génome Navigateur. Régions de pointe plus enrichi ont une probabilité plus élevée de liaison de facteur de transcription. Il est important de confirmer la présence de pointe dans les régions régulatrices de la transcription connue facteur ainsi qu’absence de crête dans les régions où la liaison de facteur de transcription est improbable. Figure 6 b -E montre des exemples de régions des gènes avec et sans enrichissement de pointe ainsi que leur emplacement en ce qui concerne les régions promotrices ENCODE.

In silico des méthodes complémentaires à ChIP-seq expérience sont analyse enrichissement de motif et de novo recherche de motif. Puisque Olig2 liaison dans l’OPCs n’a pas été étudiée avant, Olig2 ChIP-seq dérivé des pics dans les cellules progénitrices des motoneurones et les cellules souches embryonnaires ont été utilisés pour novo de motif d’identification4,24. OLIG2 de novo identifié motifs ont été ajoutés à la complète ENCODE motif de base de données25 et motif enrichissement analyse a été effectuée. Hautement enrichi de l' de novo identifié OLIG2 motifs et connu transcription factor (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 et ASCL1) des motifs ont été trouvés dans la ChIP-seq pics de PDGFRα purifiée cellules. Un enrichissement de 30 motifs de novo identifié avec une E-value < 0,05 a été découvert. La figure 7 montre les motifs de de novo identifié deux principaux de Olig2. Ces deux motifs de Olig2 de novo identifiés ont été trouvés à > 60 % des pics ChIP-seq obtenu à partir cellules PDGFRα purifié, en outre pour des motifs connus.

Figure 1 : vue d’ensemble du flux de protocole. PDGFRα positifs OPCs ont été isolées de cerveaux de souris après la naissance et ont été soumis à Olig2 puce expérimenter. Les précipité des fragments d’ADN ont été utilisés pour la préparation de la bibliothèque de puces. Après évaluation de la qualité de la bibliothèque, les échantillons ont été utilisés pour l’ordonnancement. Ensembles de données ont été analysées et sommets ont été identifiés, indiquant d’éventuels sites de fixation de Olig2 en OPC purifiée cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : évaluation de la pureté des immunopanned OPCs par qPCR et immunostaining. (A) PDGFRα anticorps immunopanned des cellules ont été ensemencées et immunomarquage a été réalisée à l’aide d’anticorps de marqueur NG2 lignée OPC. Bleu : DAPI, vert : NG2. Echelle = 10 µm. (B) le niveau de l’expression relative des marqueurs de neurone Tuj1 dans OPCs purifiées (PDGFRα +) et dans les cellules du cerveau dissociés (mix) ont été évalués. Tuj1 expression dans les cellules du cerveau dissocié a été définie sur 1. (C), le niveau de l’expression relative d’astrocyte marqueur GFAP dans OPCs purifiées (PDGFRα +) et dans les cellules du cerveau dissociés (mix) a été évaluée. Expression de GFAP dans les cellules du cerveau dissocié a été définie sur 1. (D), le niveau de l’expression relative de l’OPC marqueur PDGFRα dans OPCs purifiées (PDGFRα +) et dans les cellules du cerveau dissociés (mix) a été évaluée. Expression de PDGFRα dans les cellules du cerveau dissocié a été définie sur 1. Mog (E), le niveau de l’expression relative du marqueur d’oligodendrocytes matures myélinisantes dans OPCs purifiées (PDGFRα +) et dans les cellules du cerveau dissociés (mix) a été évaluée. MOG expression dans les cellules du cerveau dissocié a été définie sur 1. Mbp (F), le niveau de l’expression relative du marqueur d’oligodendrocytes matures myélinisantes dans OPCs purifiées (PDGFRα +) et dans les cellules du cerveau dissociés (mix) a été évaluée. MBP expression dans les cellules du cerveau dissocié a été définie sur 1. (G), le niveau de l’expression relative des microglies marqueurs Iba1 dans OPCs purifiées (PDGFRα +) et cerveau dissociés des cellules (mix) a été évaluée. Iba1 expression dans les cellules du cerveau dissocié a été définie sur 1. Données en B-G représentent des expériences en triple et barres d’erreur indiquent erreur standard. T-test analyse * P < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : électrophorégramme exemple d’une bibliothèque de puce basse-cell Olig2. Après sélection de la taille double, la qualité de la bibliothèque Olig2 ChIP a été analysée par un appareil d’électrophorèse capillaire-puce microfluidique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : contrôle de la qualité représentative des résultats pour un échantillon du ChIP-seq basse-cellule de lecture longueur bp 50. (A) tableau récapitulatif représentant le nombre total de lectures, nombre de lectures de mauvaise qualité, la longueur de la séquence et global contenu en GC. (B) représentation graphique indiquant la distribution des scores de qualité de base à différentes positions dans le lit. (C) terrain montrant le contenu potentiel d’adaptateur à différentes positions dans le lit. (D) ligne dupliquée de parcelle indiquant le pourcentage de séquences. La majorité des lectures proviennent des séquences qui ne se produisent une fois au sein de la bibliothèque, donc ce qui indique un taux de reproduction faible ou la complexité de la grande bibliothèque. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : mesures de contrôle de la qualité obtient avant d’appeler Pic : paramètres d’alignement bowtie2, chapelet de corrélation croisée et tag clonalité. (A) mesures d’alignement obtient le mappeur de lecture. Les plus importantes représentent le nombre de paires de lecture unique mappés, signalées comme « aligné aujourd'hui exactement 1 fois » et le taux d’alignement global. Histogramme (B) montrant la clonalité de la balise. Les barres indiquent le pourcentage de génomiques postes où les balises trouvées. (C) un exemple d’un complot de corrélation croisée qui indique des données de bonne qualité. Lignes rouges représentent la longueur de lecture à 50 points de base et la longueur des fragments prédominant à 130 b/s. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : ChIP-seq pic régions et vues navigateur du génome des pics de ChIP-seq significatives à différents endroits génomiques. (A) exemple des régions identifiées avec l’appelant pic Pic. (B) significative ChIP-seq pics trouvés dans le corps de gène de Cspg4, un gène marqueur connu de OPC. B aucun pics de ChIP-seq ont été trouvés dans les régions promotrices ou au sein des organes de gène du Mbp gène, un marqueur pour les oligodendrocytes matures, (C) Tubb3, un marqueur des cellules neuronales, ou GFAP (D), un marqueur de cellules des astrocytes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : hautement enrichi de novo identifié les motifs de Olig2 trouvé dans les pics de PDGFRα-Olig2 ChIP-seq. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure S1 : préparation des ensembles de données de ChIP-seq. (A) définition d’architecture de répertoire. (B) calcul brut lire les mesures de contrôle de la qualité. (C) coupe de lectures. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

S2 figure : alignement lectures et le génome de référence. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure S3 : contrôle de la qualité des lectures alignées, et adresse des brins d’intercorrélation et déterminer la clonalité de la balise. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure S4 : appel pic. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure S5 : Annotation des pics importants. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure S6 : Conversion de format de fichier bedGraph en gros bonnet pour la visualisation de pointe dans le navigateur de génome. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure S7 : De novo motif motif et de la recherche de l’enrichissement. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Figure S8 : diagramme décrivant l’analyse bioinformatique des données ChIP-seq. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.