Article de méthode

Un modèle de souris chimériques du foie humain de l’hypercholestérolémie utilisant des hépatocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites

DOI :

10.3791/57556

⸱

15 septembre 2018

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1Department of Medicine, University of Hong Kong-Shenzhen Hospital, 2The Cardiology Division, Department of Medicine, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, 3School of Biomedical Sciences, Institute of Vascular Medicine, Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Chinese University of Hong Kong, 4Key Laboratory of Regenerative Biology of the Chinese Academy of Sciences, Joint School of Life Sciences, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health and Guangzhou Medical University, 5Laboratory of RNA, Chromatin, and Human Disease, CAS Key Laboratory of Regenerative Biology and Guangdong Provincial Key Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences, 6Research Centre of Heart, Brain, Hormone, and Healthy Ageing, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, 7Hong Kong-Guangdong Stem Cell and Regenerative Medicine Research Centre, University of Hong Kong and Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole visant à créer un modèle de souris chimériques du foie humain de l’hypercholestérolémie familiale à l’aide des hépatocytes de dérivés de cellules souches humaines pluripotentes induites. Il s’agit d’un modèle précieux pour tester de nouvelles thérapies pour l’hypercholestérolémie.

Résumé

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Hypercholestérolémie familiale (FH) est principalement causé par des mutations du récepteur (LDLR) lipoprotéine de basse densité et entraîne un risque accru de maladie cardiovasculaire précoce en raison d’une élévation marquée du cholestérol LDL (LDL-C) dans le sang. Statins sont la première ligne de médicaments hypolipidémiants pour traiter les FH et autres types d’hypercholestérolémie, mais de nouvelles approches font leur apparition, en particulier PCSK9 anticorps, qui sont actuellement testés dans des essais cliniques. Afin d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour FH, soit de nouveaux médicaments ou de nouvelles formulations, nous avons besoin approprié en vivo modèles. Toutefois, les différences dans les profils métaboliques de lipides par rapport à l’homme sont un problème clé des modèles animaux disponibles de FH. Pour résoudre ce problème, nous avons généré un modèle de souris chimériques du foie humain à l’aide de FH induite par les cellules souches pluripotentes (CISP)-dérivé des hépatocytes (iHeps). Nous avons utilisé des souris/Ldlr- / -/Rag2- / -/Il2rg- / - (GRL) pour éviter le rejet immunitaire des cellules humaines transplantées et d’évaluer l’effet du gène LDLR-iHeps déficientes dans un gène LDLR null fond. Transplanté FH iHeps pourrait repeupler 5 à 10 % de la foie de souris LRG basé sur la coloration de l’albumine humaine. En outre, l’iHeps implantée a répondu aux médicaments hypolipidémiants et récapitulées observations cliniques d’efficacité accrue de PCSK9 anticorps comparée aux statines. Notre modèle chimérique du foie humain pourrait donc être utile pour les tests précliniques de nouvelles thérapies à FH. En utilisant le même protocole, semblables humains souris chimériques du foie pour d’autres variantes génétiques FH, ou correspondant aux autres maladies du foie héréditaires, des mutations peut-être également être généré.

Introduction

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Récepteur de lipoprotéines de basse densité (LDLR) capte le cholestérol LDL (LDL-C) dans le sang pour moduler la synthèse du cholestérol dans le foie. Des mutations dans le gène LDLR sont la cause la plus fréquente de l’hypercholestérolémie familiale (FH)1. Statins sont traditionnellement la première ligne de médicaments pour traiter les FH et autres types d’hypercholestérolémie (hérité ou acquis). Statines inhibent la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A réductase pour diminuer la synthèse du cholestérol dans le foie2. En outre, statines augmentent les niveaux de LDLR sur la surface des hépatocytes pour promouvoir plas....

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Protocole

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Toutes les méthodes décrites ici qui impliquent l’utilisation d’animaux ont été approuvés par le Comité sur l’utilisation des animaux vivants dans l’enseignement et de recherche (CULATR) de l’Université de Hong Kong.

1. préparation et analyse phénotypique de souris

  1. Génération d’un déficit immunitaire Ldlr chez des souris knockout (KO).
    1. Utilisez la souris souches Ldlr- / -, Rag2- / -et Il2rg- / - (voir Table des matières).
    2. Croix- / - souris Rag2 Il2rg- / - souris à géné....

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Résultats

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Dirigée CISP la différenciation de l’homme en iHeps
Lorsque vous atteignez 70 % confluence, CISP humaine est différenciées en iHeps avec un protocole de 3 étapes16 (du haut dela Figure 1 ). Après 3 jours de différenciation de l’endoderme, iPSC colonies devient desserrés et répartis à confluence complet (panneau inférieur dela Figure 1 ). Puis, avec 2 milieu de scène dend , ca.......

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Discussion

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Des études antérieures à l’aide d’iHeps chez les rongeurs ont confirmé qu’ils sont un moyen efficace pour étudier les maladies du foie héréditaires17. Afin d’étendre l’utilisation de cette technologie et parce que les modèles animaux actuels FH sont pas optimaux, nous greffée FH iHeps dans des souris LRG et a montré que l’implantée LDLR +/-ou hétérozygotes LDLR-muté FH iHeps peut réduire la concentration plasmatique LDL-C de souris et répondre aux hypolipidémiant drogue in vi.......

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Déclarations de divulgation

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H.-F.T. est le Coordonnateur National et l’investigateur de l’étude de résultats Odyssée parrainée par Sanofi et Regeneron Pharmaceuticals.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Science de Shenzhen et de la technologie Conseil base Research Programme (JCYJ20150331142757383), programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des Sciences (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Conseil thème recherche Régime (T12-705/11), programme de coopération du Soviet de subventions de recherche de la région Administrative spéciale de Hong Kong et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (N-HKU730/12 et 81261160506), l’équipe projet de recherche des sciences naturelles de Guangdong Foundation (2014A030312001), Guangzhou Science et Technology Program (201607010086) et la Province de Guang....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériaux
40 & micro ; m Crépineà cellules BDB4-VW-352340
Plaque à 6 puitsThermofisher140675Matrice extracellulaire revêtue
d’AccutaseMilliporeSCR005
AcétylcholineSigma AldrichA6625Dissoudre dans l’eau
de récupération d’antigèneIHC WorldIW-1100-1L
Chlorure de calciumSigma AldrichC8106CaCl2
Enzyme de dissociation cellulaireThermofisher12604-013TrypLE
D-glucoseSigma AldrichD8270
Dimethyl sulfoxydeSigma AldrichD5879DMSO
DMEMThermofisher10829Knockout DMEM
DNase IRoche11284932001
EDTAUSB156940,5 M, PH=8,0
Matrice extracellulaire (pour suspension cellulaire)Corning354234
Matrigel Matrice extracellulaire (pour la différenciation iHep)Corning354230Matrigel
Milieu basal hépatocytaireLonzaCC-3199
Milieu de culture hépatocytaireLonzaCC-3198
Régime riche en graisses et en cholestérolRégimealimentaire D12079B
Activine humaine APeprotech120-14E
Facteur de croissance des hépatocytes humainsPeprotech100-39
Milieu d’entretien iPSC humainSTEMCELL Technologies5850mTeSR1
Oncostatine humaine MPeprotech300-10
Kétamine 10 %AlfasanN/A
L-glutamineThermofisher35050
Kit de détection LDL-CWAKO 993-00404 et 993-00504
Magnésium  ; chlorureVWRP25108MgCl2
MeloxicamBoehringer IngelheimNADA 141-213
Phosphate monopotassiqueUSBS20227KH2PO4
Acides aminés non essentielsThermofisher11140
PBSGESH30256.02Sans calcium ni magnésium
Anticorps PCSK9Sanofi et Regeneron PharmaceuticalsSAR236553/REGN727Alirocumab
PhénobarbitalAlfamediccompany 013003
PhényléphrineRBIP-133Dissous dans l’eau
Chlorurede potassium Sigma AldrichP9333KCl
Povidone-iodeMundipharmaBétadine
Souris recombinante Wnt3aR& D Systems1324-WN-500/CF
Inhibiteur de ROCK Y27632Sigma AldrichY0503-5MG
RPMI 1640Thermofisher21875
Remplacement de sérumThermofisher10828
Boîte de Pétri recouverte de siliconeDow CorningSylgard 184 kit
SimvastatinMerck Sharp & DohmeZOCOR
Bicarbonate de sodiumSigma AldrichS6297NaHCO3
Chlorure de sodiumSigma AldrichS7653NaCl
Trypan blue solution 0,4 %Thermofisher15250061
U-46619Cayman16450Dissoudre dans du DMSO
Xylazine 2 %AlfasanN/A
&bêta ; -mercaptoethanolThermofisher31350
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
>Antibodies
AATDAKOA00121:400
ALBBethyl LaboratoiresA80-1291:200
ASGPRSanta CruzSc-289771:100
HNF4ASanta CruzSc-65571:35
NANOGStemgent09-00201:200
OCT4Stemgent09-00231:200
NomEntrepriseCatalog NombreComments
>Mice
Il2rg-/- Jacson lab003174
Ldlr-/- Jacson lab002077
Rag2-/- Jacson lab008449<
strong>NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Equipments
Compteur de cellules automatiséInvitrogenCountess
Gamma irradiatorMDS NordionGammacell 3000 Elan II
Seringue à insulineBD324911
PowerlabADInstrumentsModèle 8/30
Système de balayage de lamesLeica biosystemsAperio scanSystème
Microtome coulissantLeica biosystemsRM2125RT
StereomicrocopeNikonSMZ800
Système de traitement des tissusLeica biosystemsASP200S
Wire myographDMT610M
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Softwares
Digital slide viewing logicielLeicaAperio ImageScope Version 12.3.2
Image JNIHVersion 1.51e
Logiciel de traitement d’imageAdobePhotoshop CC Version 2015
Logiciel d’imagerie microscopeCarl ZeissAxioVision LE Version 4.7
Solution Recherche élastomère de siliconede lunette

Références

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  1. Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
  2. Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
  3. Dubuc, G., et al.

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Mots-clés

H patocytes d riv s d iPSCiHeps d ficients en LDLRsouris LRGfraction vasculaire stromaleisolement cellulairecytom trie en fluxWestern blotmicroscopie confocale

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