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Article de méthode

Isolement des ganglions de la racine dorsale et la Culture primaire afin d’étudier la libération des neurotransmetteurs

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⸱

DOI :

10.3791/57569

⸱

6 octobre 2018

 , 
1Graduate Institute of Biomedical Sciences, Department of Physiology and Pharmacology, Chang Gung University, 2Healthy Aging Research Center, Chang Gung University, 3Neuroscience Research Center, Chang Gung Memorial Hospital

Dans cet article

Résumé

Les cultures primaires (DRG) les ganglions de la racine dorsale sont fréquemment utilisés pour étudier les fonctions physiologiques ou pathologie imprévisibles dans les neurones sensoriels. Ici, nous montrent l’utilisation de cultures DRG lombaires pour détecter la libération de neurotransmetteurs après le type de récepteur de neuropeptide FF 2 stimulation avec un agoniste sélectif.

Résumé

Les ganglions rachidiens (DRG) contiennent les corps cellulaires des neurones sensoriels. Ce type de neurone est Pseudo-aléatoire unipolaire, avec deux axones qui innervent les tissus périphériques, tels que peau, muscles et organes viscéraux, ainsi que la corne dorsale de la colonne vertébrale du système nerveux central. Les neurones sensoriels transmettent la sensibilité somatique, y compris le touch, des douleurs, des sensations thermiques et proprioceptives. Par conséquent, les cultures primaires de DRG sont largement utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires de la nociception, fonctions physiologiques des neurones sensoriels et développement neural. Les neurones en culture peuvent être appliquées dans les études impliquant l’électrophysiologie, transduction du signal, la libération des neurotransmetteurs ou imagerie calcique. Avec des cultures primaires de DRG, scientifiques peuvent culture dissociés DRG neurones pour surveiller les modifications biochimiques en seul ou plusieurs cellules, surmonter beaucoup des restrictions associées à des expériences in vivo . Par rapport à commercialement disponible DRG-hybridome lignées cellulaires ou immortalisé des lignées de cellules neuronales DRG, la composition et propriétés des cellules primaires sont beaucoup plus semblables à des neurones sensoriels dans les tissus. Toutefois, en raison du nombre limité de cellules cultivées de primaire DRG qui peuvent être isolés dans un seul animal, il est difficile d’effectuer des écrans de haut-débit pour médicament ciblant les études. Dans l’article actuel, procédures pour collection DRG et la culture sont décrites. En outre, nous montrons le traitement des cellules cultivées de DRG avec un agoniste du type de récepteur neuropeptide FF 2 (NPFFR2) pour induire la libération de neurotransmetteurs peptidiques (peptide lié au gène de la calcitonine (CRGP) et la substance P (SP)).

Introduction

Les corps cellulaires des neurones sensitifs sont contenues au sein de la DRG. Ces neurones sont Pseudo-aléatoire unipolaires et innervent les tissus périphériques et le système nerveux central. Les terminaisons nerveuses périphériques de neurones sensoriels sont trouvent dans le muscle, peau, organes viscéraux et OS, entre autres tissus. Ils transmettent les signaux de sensation périphériques au nerf terminaisons dans la corne dorsale de la colonne vertébrale et les signaux sont ensuite transmis au cerveau par différentes voies ascendantes de la sensibilité somatique1,2. La sensibilité somatique permet au corps de se sentir (c'est-à-dire, touch, la douleur et les sensations thermiques) et de percevoir le mouvement et l’orientation spatiale (les sensations proprioceptives)1,3. Il y a quatre sous-classes de primaires axones afférents, y compris groupe I fibres (Aα) qui répondent à la proprioception des muscles squelettiques, les fibres II (Aβ) groupe répondant aux mécanorécepteurs de la peau, et le groupe III (Aδ) et fibres de V (C) groupe qui réagissent à la douleur et température. Seulement les fibres C sont amyélinisés, tandis que le reste sont myélinisées à différents degrés.

Nocicepteurs sont des neurones sensitifs primaires, qui sont activés par des stimuli nociceptifs (stimulation mécanique, thermique et chimique) qui portent le risque de lésions tissulaires. Ces neurones sont composées de fibres Aδ myélinisées et amyélinisés C fibres1,4. Les fibres Aδ expriment les récepteurs du facteur de croissance de nerf (NGF, récepteur trkA), CGRP et SP. Les fibres C sont classés comme des fibres C soit peptidergiques et non-peptidergiques. En revanche, les fibres C non-peptidergiques expriment les récepteurs du facteur neurotrophique dérivé du glial (récepteurs GDNF, RET et GFR), isolectine IB4 et ATP-gated ion channel sous-type (P2X3)5,6,7. Nocicepteurs peuvent être distinguées par l’expression des canaux ioniques et activées par facteurs neurotrophiques, cytokines, neuropeptides, ATP ou autres produits chimiques composés de8. Lors de la stimulation, neurotransmetteurs, y compris le CGRP, SP et glutamate peuvent être libérés des terminaisons de neurone sensitif dans la corne dorsale spinale pour transmettre des signaux nociceptifs2. DRG ne sont pas seulement composé de neurones, mais contiennent également des cellules gliales par satellite. Cellules satellites entourent les neurones sensoriels et fournir un appui mécanique et métabolique9,10. Fait intéressant, il y a un nombre croissant de preuves indiquant que les cellules gliales par satellite dans le PMSI pourraient être impliqués dans la régulation de la douleur sensation11.

Les neurones sensoriels ont été signalés le plus fréquemment utilisé des cellules neuronales primaires12 et ont été utilisé pour l’électrophysiologie, transduction du signal et des études de libération neurotransmetteur. Ils sont aussi couramment utilisés pour explorer les mécanismes cellulaires du développement neuronal, douleur inflammatoire, douleur neuropathique, sensation de peau (comme les démangeaisons) et axon excroissance12,13,14,15. Les cultures primaires de DRG peuvent être cultivées comme des neurones dissociés pour évaluer les changements biochimiques dans une ou plusieurs cellules, permettant aux scientifiques d’effectuer des études qui ne peuvent être effectuées chez des sujets expérimentaux. Récemment, DRG provenaient d’échantillons avec succès de donneurs d’organes humains qui pourraient grandement bénéficier de recherche translationnelle16. En revanche, les neurones sensoriels peuvent être aussi cultivées comme explants de DRG. Les explants DRG préserver l’architecture originale de tissu des neurones, y compris les cellules de Schwann et de cellules gliales par satellite et sont particulièrement utiles pour étudier les interactions entre cellules neuronales et non neuronales17. Les cultures primaires de DRG peuvent être facilement établis au sein de 2,5 h. Les propriétés et la composition cellulaire sont hautement réfléchissantes de la source de la DRG, et à ce titre, DRG spécifique (DRG lombaire ou thoracique) peut être collecté selon les demandes expérimentales. Les cultures de neurones DRG embryonnaires et néonatales nécessitent NGF à survivre et à induire l’excroissance des axones, mais les cultures de neurones adultes ne nécessitent pas l’ajout de facteurs neurotrophiques aux médias12,17. Il y a aussi des lignées de cellules DRG-hybridome disponibles dans le commerce comme ND7/23 et F11, qui ne nécessitent pas l’utilisation des animaux d’expérimentation. Toutefois, l’absence du cation potentiel récepteur transitoire canal membre du subfamily V 1 (TRPV1) expression (un marqueur important de petits neurones nociceptifs sensoriels) et les profils d’expression génique incongrues limitent leurs demandes18. Récemment, immortalisé les cellules neuronales de DRG lignes ont été dérivées du rat (50B11)19 et20de souris (MED17.11), qui conviennent à utilisent dans les écrans de haut-débit pour médicament ciblant les études. Toutefois, l’expression de gènes de ces lignées cellulaires n’a pas encore à accomplir. Ainsi, les expériences de validation en comparant ces cellules immortalisées à neurones sensoriels sont toujours en cours.

NPFFR2 est synthétisé dans le PMSI et transloqué aux bornes du nerf sensitif dans la corne dorsale de la moelle21. Dans cet article, nous fournissons un protocole pour la mise en culture des cellules GRD lombaires et traiter avec un agoniste de NPFFR2 pour provoquer la libération de neurotransmetteurs, CGRP et SP. La dépendance sur NPFFR2 est soumise à d’autres NPFFR2 petits ARN interférents (siARN), qui peut être transfecté dans des cellules cultivées de la DRG.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites dans les présentes et qui utilisent des animaux de laboratoire ont été approuvés par le Comité utiliser (IACUC) de l’Université Chang Gung (CGU 13-014) et d’institutionnels animalier.

1. Récupérez les DRG lombaire des Rats expérimentaux

  1. Utiliser 2 à 3 rats Sprague-Dawley (SD) de la semaine pour la collecte de DRG lombaire.
    Remarque : Les neurones DRG recueillies des rats pendant 4 semaines d’âge ne poussent pas bien dans les conditions de culture décrites dans les présentes.
  2. Stériliser tous les instruments chirurgicaux en autoclave.
  3. Anesthésier le rat avec un mélange de 1:1 de tiletamine et zolazepam (20 mg/kg ; injection intrapéritonéale (IP)) et attendez que l’animal ne présente aucune réponse de pied-retrait lors d’un test d’orteil-pincement.
    NOTE : Anesthésie différentes stratégies peuvent être utilisées avec succès dans le présent protocole.
  4. Sacrifier le rat par décapitation avec une guillotine commerciale.
  5. Utilisez la guillotine pour isoler le tronc du corps du rat du membre antérieur et du fémur. Voir Figure 1 a pour un diagramme de la région à collecter.
    Remarque : La ligne de découpe caudale devrait être juste rostrale sur le fémur. Le DRG L6 lombaire va être excisée si le site de coupe est trop élevé dans la colonne vertébrale.
  6. Coupez le long du sternum et enlevez tous les organes/tissus avec des ciseaux de dissection (Figure 2 a-a).
  7. Couper le long du côté du tronc pour recueillir la partie dorsale du rat et enlever la peau. Voir Figure 1 b pour prendre une photo du tronc dorsal disséqué.
  8. Préparer le tissu sur la glace avant de recueillir les DRG. Nettoyer la fourrure et le sang de gants et les stériliser avec de l’éthanol 75 % avant de passer à l’étape suivante.
  9. Supprimer les muscles couvrant la colonne lombaire. Tout d’abord, faire deux coupes le long des côtés de la colonne vertébrale (gauche et droite) et une coupe latérale pour marquer la mesure rostrale de la colonne lombaire. Puis, retirez les muscles dorsaux de la colonne vertébrale avec une pince de coupe osseuse (Figure 2 a-b).
  10. Enlever la partie dorsale de la vertèbre avec une pince coupe osseuse et exposer la moelle épinière.
  11. Enlever la moelle épinière avec des ciseaux de dissection (Figure 2 a-c) et les pinces (Figure 2 a-d).
  12. Identifier la DRG lombaire en comptant les vertèbres de la dernière côte (13 de vertèbre thoracique). Voir Figure 1 pour un diagramme de la position des vertèbres.
  13. Recueillir la DRG lombaire bilatérale (L1-L6) avec micro-ciseaux (Figure 2 a-f) dans une boîte de Petri de 35 mm avec un milieu sans sérum glacé 2 mL. Enlever les fibres neuronales (comme indiqué dans la Figure 1) de se connecter DRG, puis transférez-le dans la boîte de Pétri pour améliorer la pureté des cultures.
    Remarque : Le PMSI recueilli peut être conservé dans un milieu sur la glace pendant environ 1 h. Pendant ce temps, plusieurs rats peuvent être euthanasiés pour créer un plus grand bassin de DRG.

2. première Culture de Rat bois DRG

NOTE : Les étapes suivantes doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire.

  1. Préparer le milieu de culture contenant 10 % sérum de veau fœtal, pyruvate de sodium de 100 mM et 1 x pénicilline/streptomycine dans 1 x DMEM-F12.
  2. Manteau de la culture de cellules traitées plaque 24 puits avec 200 µg/mL poly-L-lysine pendant 2 h puis laver avec de l’eau stérilisée.
  3. Les incuber la boîte de Petri avec 1 mL de milieu de culture dans un incubateur à 37 ° C CO2 avant utilisation pour moins de 30 min.
  4. Transférer le plat contenant du DRG de 35 mm dans une hotte laminaire et laver le PMSI avec un milieu sans sérum 3 fois la pipette.
    Remarque : L’extérieur du plat doit être nettoyé avec 75 % d’éthanol avant de les transférer dans la hotte. Le plat 35 mm peut contenir DRG d’un certain nombre de rats (cela dépendra des exigences du plan expérimental).
  5. Déplacer la DRG (un rat seul ou combiné de plusieurs rats) à une nouvelle boîte de Petri 35 mm, qui contient 2 mL de collagénase de type IA (1 mg/mL dans un milieu sans sérum) avec des pinces stériles (Figure 2 a-e).
    Remarque : La solution de collagènase doit être stérilisée en le faisant passer à travers un filtre de seringue 0,22 µm.
  6. Digérer la DRG dans la solution de collagénase dans un incubateur à 37 ° C CO2 pendant 30 min.
  7. Enlever la solution de la collagénase et lavage les DRG 3fois dans 2 mL Hank équilibré de solution saline (HBSS).
    Remarque : Il peut y avoir des fibres résiduelles ou des tissus qui sont détache de la DRG dans la solution. Retirez-les avec la solution de lavage à l’aide d’une pipette.
  8. Ajouter 2 mL préchauffée 0.05 % trypsine-EDTA dans le plat de 35 mm contenant du DRG et digérer la DRG dans un incubateur à 37 ° C CO2 pendant 30 min.
  9. Transfert le 2 mL de solution contenant du DRG dans un tube à centrifuger 15 mL de pipette en verre.
    Remarque : Le PMSI pourrait tenir à la pipette en verre, alors cette étape doit être effectuée avec soin. Perte DRG peut être évité en gardant la solution contenant DRG à l’extrémité effilée de la pipette de verre (environ 0,5 mL) et le transfert de la solution dans le tube à centrifuger lentement mais sans pause.
  10. Centrifuger la solution à 290 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et ajouter un autre milieu sans sérum, 2 mL pour remettre en suspension le PMSI.
  11. Répétez l’étape 2.10 2 fois mais changement du milieu sans sérum, au milieu de culture pré chauffé sur la dernière fois.
  12. Triturer manuellement la DRG environ 60 fois en utilisant une pipette Pasteur flamme-poli (longueur 230 mm et pointe tête diamètre intérieur 1 mm). Voir la Figure 2 b pour prendre une photo en comparant l’orifice de la pipette Pasteur flamme-poli pour une pipette non poli.
    Remarque : L’intérieur diamètre de la pipette Pasteur flamme-poli est d’environ 10 % plus petite que la pipette de contrôle et de l’intérieur de l’embout conique doit être plus fluide. Veillez à ne pas créer des bulles quand qui triturent les cellules.
  13. Retirer le plat de la poly-L-lysine-enduits de l’incubateur à CO2 . Aspirez le milieu de culture couvé du plat et les cellules dissociées sur le plat enduit des graines.
  14. Les cellules DRG d’un rat (collection bilatéraux de L1-L6, pour 12 total DRG) des graines dans quatre puits d’une plaque 24 puits ; Il y a environ 5 x 104 cellules dans un puits d’une plaque 24 puits.
    Remarque : Cette densité est approprié pour la détection du CGRP libérés ou SP et aussi approprié pour immunostaining. Pour la tache occidentale ou extraction de l’ARN, graines cellules DRG chez un rat (bilatéraux L1-L6) dans un puits d’une plaque de 6 puits.
  15. Remplacer le milieu de culture le lendemain avec l’ajout de 10 µM cytarabine (Ara-C) et 100 ng/mL NGF et actualiser le support par la suite tous les deux jours.
    Remarque : Le PMSI thoracique aussi peut également être cultivé par le présent protocole, si elles ont été recueillies de la colonne thoracique.

3. la transfection des siARN NPFFR2 dans les cellules GRD

  1. Effectuer la transfection des siARN NPFFR2 et contrôler des siARN selon protocole du fabricant.
    Remarque : Le protocole devra être adaptée si le réactif de transfection choisie est différent de celle que nous avons utilisé (voir la Table des matières).
  2. Le jour 3 après le placage de la cellule, changer le support d’un milieu sans sérum Préchauffez 0,5 mL et incuber la DRG dans un incubateur à 37 ° C CO2 pendant 1 h.
  3. Ajouter 50 nM de siARN (dans 1 eau exempte de RNase µL) dans le milieu sans sérum 12,5 µL.
  4. Ajouter 2,5 µL de réactif de transfection dans un milieu sans sérum 10 µL.
  5. Mélanger la solution de la solution d’étapes 3.3 et 3.4 de pipette et incuber cette transfection mixte pendant 10 min à température ambiante.
  6. Ajoutez la solution de transfection dans une plaque de 24 puits contenant des DRG et mélanger la solution avec un moyen en agitant doucement.
    Remarque : Plusieurs solutions de transfection doivent être déployées en même temps si besoin de plusieurs puits à transfecter.
  7. Incuber le PMSI dans une étuve à 37 ° C CO2 pendant 6 h.
  8. Ajouter 0,5 mL/puits de milieu de culture contenant 20 % sérum de veau fœtal, pyruvate de sodium de 100 mM et 1 x pénicilline/streptomycine dans 1 x DMEM-F12, avec l’addition de 10 µM Ara-C et 100 ng/mL NGF, dans la plaque 24 puits.
  9. Incuber le PMSI dans un incubateur à 37 ° C CO2 pendant un autre 66 h (actualiser le support après 48 h).

4. libération de neurotransmetteurs de cellules primaires GRD

  1. Sur 6 jours après que les cellules ont été plaqués (72 h après la transfection de siARN), changer le milieu de culture à 200 µL de milieu sans sérum et incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C CO2 pendant 30 min.
  2. Ajouter 1 µL stimulation ou des substances chimiques et mélanger doucement le support en pipettant également. Incuber le plat dans un incubateur à 37 ° C CO2 pendant l’heure réglée.
    Remarque : Dans cet article, les cellules cultivées ont été stimulés par l’agoniste NPFFR2, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 nmol), pendant 1 h.
  3. Recueille le milieu de culture de la boîte de Petri et centrifuger à 5 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer les impuretés en suspension.
  4. Récupérer le surnageant de la centrifugation et diluer les échantillons avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), selon les besoins. Doser les niveaux de neurotransmetteurs avec kits d’enzyme immunoassay (EIE).
    NOTE : Ici, les surnageants sont dilués au 1/100 avant d’analyser le niveau de CGRP. Le surnageant n’était pas dilué avant d’analyser le niveau de SP.

5. CGRP et SP EIA

  1. Analyse des échantillons immédiatement selon le protocole du fabricant kit CGRP ou EIA SP.
    Remarque : Le protocole variera selon le kit utilisé.
  2. Rincer les puits CGRP EIA 5 fois avec le tampon de lavage fourni dans le kit.
  3. Ajouter 100 µL échantillons avec traceur de l’acétylcholinestérase (AChE) 100 µL anti-CGRP dans les puits de CGRP EIA et ajouter 50 µL échantillons, traceur de AChE 50 µL anti-SP et l’antisérum d’anti-SP 50 µL dans les puits de SP EIA.
  4. Sceller les puits CGRP et SP avec un film plastique qui est fourni dans les kits.
  5. Incuber les puits durant la nuit à 4 ° C.
  6. Laver les puits 5 fois avec CGRP ou SP laver tampon et enlever toute la solution résiduelle provenant des puits.
  7. Ajouter réactif de 200 µL Ellman dans les puits CGRP ou SP, qui est fourni dans les kits EIA correspondants.
  8. Incuber les puits CGRP pendant 30 min à température ambiante et incuber les puits SP pendant 90 min à température ambiante. Protéger les puits de lumière pour les deux tests.
  9. Lire les plaques au nm de longueur d’onde 414 et calculer les résultats selon l’instrument EIE correspondant.
    Remarque : Évitez de toucher le fond des puits à la main tout le temps et nettoyer les taches d’eau par le bas bien de lingettes avant d’ajouter le réactif de la Ellman de nettoyage pour lentilles.

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Résultats

Les neurones DRG lombaires rat, cultivées dans une plaque 24 puits, ont été cultivées dans un milieu de culture avec l’Ara-C supplémentaire pour inhiber la prolifération des cellules gliales et NGF pour soutenir la croissance neuronale. La morphologie de la vie les cellules GRD a été observée. Comme illustré à la Figure 3, le corps cellulaire d’un neurone unique était attaché au fond d’un plat au jour 1 et sélectionné pour l’observation. Croissance de l’axone...

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Discussion

Dans le présent article, nous démontrons la collection, enzyme-dissociation et la culture des lombaires rat DRG. Avec le soutien de neurotrophique de NGF, les axones des neurones DRG étendu dans les 3 jours après l’ensemencement de la cellule. Les axones prolongées ont été clairement observables après que les cellules ont été colorés pour une protéine CGRP, qui est synthétisé dans le soma de la cellule et transporté le long des fibres de l’axone. Les procédés de cellules satellites aussi étendus, permettant à ces Divisio...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr M. Calkins pour l’édition anglaise. Ce travail a été soutenu par le Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), l’Université Chang Gung, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) et ministère de la Science et technologie (105-2320-B-182-012-MY2).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mélange de tilétamine et de zolazépam (Zoletil)VirbacZoletil 50anesthésique
Sérum fœtal bovinBiological Industries04-001-1Milieu de culture
Pyruvate de sodiumSigmaS8636Milieu de culture
pénicilline/streptomycineBiological Industries03-033-1Milieu de culture
DMEM-F12Invitrogen12400024Milieu de culture
Poly-l-lysineSigmaP9011Plat d’enrobage
Collagénase IASigma9001-12-1Digestion enzymatique
saline équilibréeHank Invitrogen14170-112Milieu de culture
Trypsine EDTABiological Industries03-051-5Digestion enzymatique
Pasteur pipetteHilgenberg3150102Trituration cellulaire
Cytarabine (Ara-C)SigmaC6645Milieu de culture
NGFMilliporeNC011Milieu de culture
NPFFR2 siRNADharmaconL-099691-02-0005Transfection
SiRNA non cibléDharmaconL-001810-10-05Transfection
NeuroPORTER RéactifGenlantisT400150Réactif de transfection
dNPAGenemed SynthesisN/ANPFFR2 agoniste
CGRP ELISACayman589001EIA
SP ELISACayman583751EIA
CGRP anticorpsCalbiochemPC205L
IHC DAPIRoche10236276001IHC
Solution de

Références

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