Article de méthode

Analyse moléculaire de Transition endothéliales-mésenchymateuses induite par le Transforming Growth Factor-β de signalisation

DOI :

10.3791/57577

⸱

3 août 2018

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1David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Hastings Center for Pulmonary Research, Division of Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, Department of Medicine, Keck School of Medicine, University of Southern California, 4Department of Molecular Pathology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

Dans cet article

Résumé

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Un protocole pour in vitro induction de transition endothéliales-mésenchymateuse (EndMT), qui est utile pour étudier les voies de signalisation cellulaires impliqués dans EndMT, est décrite. Dans ce modèle expérimental, EndMT est induite par le traitement avec le TGF-β dans les cellules endothéliales MS-1.

Résumé

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Plasticité phénotypique des cellules endothéliales sous-tend le développement du système cardio-vasculaire, les maladies cardiovasculaires et diverses affections associées à la fibrose orgue. Dans ces conditions, différenciés de cellules endothéliales acquièrent mésenchymateuses comme phénotypes. Ce processus est appelé transition endothéliales-mésenchymateuse (EndMT) et se caractérise par une diminution des marqueurs endothéliales, upregulation de marqueurs mésenchymateux et changements morphologiques. EndMT est induite par plusieurs voies de signalisation, y compris le facteur de croissance (TGF) transformant-β, Wnt et Notch et régulé par des mécanismes moléculaires semblables à ceux de transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) importante de gastrulation, fibrose tissulaire, et métastases du cancer. La compréhension des mécanismes de EndMT est importante de développer des approches diagnostiques et thérapeutiques ciblant les EndMT. Induction robuste de EndMT in vitro est utile pour caractériser des signatures d’expression génique communes, identifier des mécanismes moléculaires thérapeutiques et dépister les modulateurs de EndMT. Nous décrivons ici une méthode in vitro pour l’induction de EndMT. Cellules endothéliales microvasculaires du pancréas de souris MS-1 subissent EndMT après une exposition prolongée au TGF-β et montrent upregulation de marqueurs mésenchymateux et changements morphologiques ainsi que l’induction de multiples cytokines et de chimiokines inflammatoires. Méthodes d’analyse de la modulation de microARN (miARN) sont également inclus. Ces méthodes fournissent une plate-forme pour étudier les mécanismes sous-jacents à l’EndMT et la contribution des miARN à EndMT.

Introduction

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Transition mésenchymateuses endothéliales (EndMT) est le processus par lequel une cellule endothéliale différenciée subit diverses modifications moléculaires, ce qui entraîne un fibroblaste cellules mésenchymateuses1. EndMT a été initialement décrite comme une transformation des cellules endothéliales au cours du développement du coeur2,3. Dans le développement précoce de cœur, le tube de coeur se compose de l’endocarde intérieure et une extérieure myocarde. Ces deux couches sont séparées par une couche de la matrice extracellulaire appelée la gelée cardiaque. Les cellules embryonnaires endocardiques, d’acquérir un des marqueurs de cellules endothéliales, transit en cellules mésenchymateuses, envahissent la gelée cardiaque sous-jacente et favorisent la formation des coussins cardiaques, prévoyant la Fondation les valves atrioventriculaires et septum et les valves semilunaires. Par ailleurs, EndMT a été suggéré d’être sources de péricytes et les cellules musculaires lisses vasculaires dans d’autres systèmes vasculaires embryonnaires, y compris les vaisseaux coronaires, aorte abdominale et l’artère pulmonaire4,5,6. En outre, EndMT est impliquée dans physiologique angiogénique germination7.

Accumulation de preuves a suggéré que l’EndMT est également impliquée dans plusieurs maladies cardiovasculaires et autres maladies1,8. Problèmes associés à EndMT comprennent la calcification vasculaire, l’athérosclérose, l’hypertension artérielle pulmonaire, malformation caverneuse, orgue fibrose, transformant le greffe veineuse, dysfonction de l’allogreffe en transplantation rénale et le cancer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. un récent rapport décrit que plusieurs marqueurs moléculaires de EndMT peuvent être un outil de prédiction de diagnostic et le pronostic de dysfonction du greffon rénal en transplantation de rein17. Modulation des voies de signalisation cellulaires liés EndMT auraient dû être divulgués afin d’améliorer plusieurs conditions de maladie dont la fibrose cardiaque et veine greffon remodelage chez les animaux modèles8,15. La compréhension des mécanismes sous-jacents EndMT est donc important d’élaborer des stratégies diagnostiques et thérapeutiques ciblant les EndMT.

EndMT se caractérise par la perte de jonctions cellule-cellule, l’augmentation du potentiel migratoire et la diminution de l’expression des gènes endothéliales spécifiques comme la VE-cadhérine et stimulation de l’expression des gènes mésenchymateuses y compris actine muscle lisse-α (α-SMA). En outre, les EndMT et transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), un processus similaire qui convertit des cellules épithéliales cellules mésenchymateuses, sont associés à production altérée des divers constituants de la matrice extracellulaire, qui peuvent contribuer au développement des tissus fibrose8,19.

Récemment, plusieurs études in vitro de EndMT ont élucidé les détails des mécanismes moléculaires de l’EndMT15,20. EndMT est induite par diverses voies de signalisation dont le facteur de croissance (TGF) transformant-β, Wnt et Notch1. Parmi eux, le TGF-β joue un rôle essentiel dans l’induction de EMT et EndMT. Dans EndMT, exposition prolongée aux résultats du TGF-β dans EndMT dans diverses cellules endothéliales, alors que l’exposition courte semble être insuffisante21. Ici, nous avons décrit un protocole simple pour l’induction de EndMT, dont 1 de SVEN MILE (MS-1) cellules endothéliales microvasculaires du pancréas de souris subissent EndMT in vitro après une exposition prolongée au TGF-β,20. Dans ce modèle, plusieurs analyses en aval peuvent être effectués afin d’étudier les caractéristiques de marque de EndMT, y compris les changements morphologiques, diminution de l’expression des marqueurs endothéliales, upregulation de marqueurs mésenchymateux et gènes inflammatoires, du cytosquelette réarrangements et la contraction du gel de collagène.

MicroARN (miARN) sont 22 ~ nt petits ARN réglementaire qui dirigent la répression post-transcriptionnelle des différents ARNm cibles22,23. Par la reconnaissance de graine d’induite par la séquence cible, miRNAs supprimer des centaines de gènes cibles et moduler diverses fonctions cellulaires tels que la différenciation cellulaire, la prolifération et la motilité. C’est également le cas pour le règlement des EMT et EndMT, et plusieurs des miARN ont été signalés comme régulateurs de EMT et EndMT24,25. Le modèle de EndMT présenté dans cette revue peut être facilement combiné avec miRNA procédures de modulation pour tester les rôles des miARN dans EndMT. Cette revue résume nos procédures expérimentales pour étudier la EndMT induite par TGF-β dans les cellules MS-1 et inclut également la comparaison des conditions d’induction EndMT TGF-β dans d’autres cellules endothéliales.

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Protocole

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1. l’induction de la EndMT

  1. Maintenir les cellules MS-1 dans des conditions de culture standard et d’éviter la confluence. Une source de cellules MS-1 est décrite dans la Table des matières. Pour MS-1 de cellules, utilisez milieu Minimum essentiel-α (MEM-α) avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), 50 U/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine.
  2. MS-1 laver les cellules 10 cm plat avec 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 1,0 mL de trypsine à la plaque. Incuber 5 min à 37 ° C.
  3. Détacher les cellules à l’aide de 9 mL de milieu de culture. Recueillir la suspension de cellules dans un tube de 15 mL.
  4. Centrifuger la suspension de cellules à 300 – 400 g pendant 5 min à température ambiante.
  5. Avec précaution, retirez le surnageant et suspendre le culot cellulaire dans les milieux de culture pré chauffé.
  6. Compter les cellules viables à l’aide de solution de bleu de Trypan et un hémocytomètre standard ou un compteur de cellule automatique.
  7. Plaque MS-1 cellules sur des plaques de culture standard non couché à 0,5 x 103 cellules / cm2 pour long terme culture. Par exemple, plaque 5.0 x 103 cellules / puits dans un 6 culture bien plat. Utilisez les même milieux de culture dont la même concentration de FCS. Dans les cellules de MS-1, TGF-β induit EndMT dans la culture à long terme (au moins 48 à 72 h) avec l’utilisation des centres d’amitié.
  8. Stimuler les cellules endothéliales avec TGF-β2 (une concentration finale de 1 ng/mL) après 24h.
  9. Cellules en culture dans un incubateur humidifié (5 % de CO2, 37 ° C). Surveiller tous les jours des cellules lorsque nous nous concentrons sur des changements morphologiques.
  10. Remplacer les médias avec frais préchauffé milieu de culture contenant des TGF-β2 après 48 h de traitement avec le TGF-β dans la culture à long terme.
  11. Procéder à des analyses en aval. En général, réorganisation de l’actine est observée après 24 h de traitement, et une diminution des marqueurs endothéliales et upregulation des marqueurs mésenchymateux sont observés après 48 à 72 h de traitement avec le TGF-β.

2. analyse immunocytochimique

  1. Maintenir les cellules en conditions de culture standard MS-1.
  2. Cellules de plaque MS-1 sur 4 puits cellulaire diapositives de chambre de culture à 1,0 x 103 cellules par puits (1,7 cm2). Diapositives sont recouverts de gélatine. Utilisation de 0,5 à 1,0 mL de milieu de culture par puits.
  3. Stimuler les cellules endothéliales avec TGF-β2 (une concentration finale de 1 ng/mL) après 24h. Lors de l’analyse de la participation de roche dans EndMT, ajouter un avant 1 h ROCK inhibiteur Y-27632 (10 μM) au traitement du TGF-β. Lorsqu’on évalue l’effet d’inhibition de signalisation TGF-β, inhibiteurs de kinase des récepteurs TGF-β peuvent être utilisés.
  4. Cellules en culture dans un incubateur humidifié (5 % de CO2, 37 ° C). Réorganisation de l’actine est observée dans les cellules MS-1 après 24 h de traitement avec le TGF-β. Autres changements deviennent évidentes après 48 à 72 h de traitement. Pour la culture de 72 h, remplacer les médias avec les supports neufs contenant du TGF-β après 48 h de traitement avec le TGF-β.
  5. Actine F coloration
    1. Après 24 h de traitement du TGF-β, retirez les supports, fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS 1 x pendant 20 min à température ambiante et rincer les cellules avec du PBS 1 x.
    2. Incuber à 0,2 % Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante.
    3. Rincer les cellules trois fois avec du PBS 1 x.
    4. Incuber à phalloïdine-tétraméthylrhodamine B l’isothiocyanate de Amanita phalloides dilué 150 fois avec un tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante.
    5. Rincer les cellules trois fois avec du PBS 1 x.
    6. Tacher les noyaux avec des teintures de liaison de l’acide nucléique cyanine pendant 5 min à température ambiante.
    7. Rinçage lames et lamelles de Mont face contre terre sur une diapositive à l’aide de diapositives, support de montage.
    8. Observer avec un microscope confocal. Utiliser un laser à 543 nm et un filtre d’émission de 560 – 615 nm pour la détection de la fluorescence de la phalloïdine. Utiliser un laser à 633 nm et un filtre d’émission plu de 650 nm pour la coloration des noyaux. Par traitement avec du TGF-β, formation de fibres de stress épais serait observée.
  6. VE-cadhérine et coloration α-SMA
    1. Après 72 h de traitement du TGF-β, retirez les supports, fixer les cellules avec froid 50 % de méthanol et de l’acétone 50 % (0,5 à 1,0 mL / puits) pendant 5 min.
    2. Rincer les cellules trois fois avec du PBS 1 x (0,5 à 1,0 mL / puits).
    3. Incubez avec des anticorps primaires dans un tampon bloquant toute la nuit à 4 ° C dans le noir selon la concentration recommandée par le fabricant. Utilisez la VE-cadhérine anticorps monoclonal (BV13, dilution au 1/100) et α-SMA Cy3-conjugués anticorps monoclonal (1 a 4, dilution de 1 : 200)20.
    4. Rincer les cellules trois fois avec du PBS 1 x.
    5. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire conjugué colorant vert d’anticorps de la VE-cadhérine dans un tampon bloquant pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité selon la concentration recommandée par le fabricant.
    6. Rincer les cellules trois fois avec du PBS 1 x.
    7. Tacher les noyaux avec des teintures de liaison de l’acide nucléique cyanine pendant 5 min à température ambiante.
    8. Rinçage lames et lamelles de Mont face contre terre sur une diapositive à l’aide de diapositives, support de montage.
    9. Observer avec un microscope confocal. Utiliser un laser à 543 nm et un filtre d’émission de 560 – 615 nm pour la détection des α-SMA (Cy3). Utiliser un laser à 488 nm et un filtre d’émission de 505 – 550 nm pour la détection de la VE-cadhérine. En général, par traitement avec traitement de TGF-β, diminution de la VE-cadhérine signaux et augmentation des signaux de le α-SMA serait observée.

3. trois dimensions collagène Gel Contraction Assay

  1. Effectuer la culture des cellules MS-1 avec ou sans le TGF-β pendant 72 h avant les tests de contraction pour le gel de collagène.
  2. Préparer le type j’ai gel de collagène sur la glace. Mélanger la solution de collagène froid, milieu MEM 10 x concentré et tampon de dilution de collagène contenant 0,05 N NaOH, 2,2 % NaHCO3et 200 mM HEPES pH 7,4 à un 8:1:1 ratio.
  3. Mélanger 200 mL de contrôle ou des suspensions de cellules endothéliales traitées au TGF-β (1,0 x 106 cellules/200 μL) et 800 μl de la solution de gel de collagène. Pour le TGF-β des échantillons traités, ajoute TGF-β2 (1 ng/mL) à la suspension cellulaire.
  4. Ajouter 1,0 mL du mélange dans chaque puits de plaques de culture de 12 puits et laisser pour solidifier dans l’incubateur à 37 ° C pendant 30 à 60 min.
  5. Après la gélatinisation, recouvrez de 1,0 mL de MEM-α contenant 10 % FCS, 50 U/mL de pénicilline, 50 μg/mL de streptomycine et de laisser flotter le gel. Pour le TGF-β des échantillons traités, ajoute TGF-β2 (1 ng/mL) aux médias.
    Remarque : Pour les échantillons traité de TGF-β, ajouter le TGF-β au gel et au milieux de culture.
  6. Incuber les gels flottants à 37 ° C pendant 48 h.
  7. Numériser les images des gels du fond de plaques à l’aide d’un scanner. Vous pouvez également enregistrer les images des gels à l’aide d’un appareil photo numérique à une distance fixe au-dessus les gels.
  8. Quantifier la surface du gel basée sur le nombre de pixels à l’aide de ImageJ. Le gel à l’aide d’une sélection à main levée ou outils de sélection, ou sélectionnez l’à l’aide de gel « Image | Ajuster | Seuil de couleurs » tool et ensuite déterminer la zone de l’utilisation de gel « Analyze | Commande de mesure ».

4. inhibition de miRNA activités par Locked Nucleic Acid-base miRNA inhibiteurs

  1. Maintenir les cellules en conditions de culture standard MS-1.
  2. Transfecter Locked Nucleic Acid (LNA) inhibiteurs de la miRNA, miRNA synthétique duplex ou siRNAs (20 ou 50 nM) à l’aide de réactifs lipofection selon les instructions du fabricant. Détails et sources de LNA miRNA inhibiteurs synthétiques miARN duplex et siRNAs ont été décrits dans nos précédents rapports26,27. Dans les cellules de MS-1, les procédures standard de transfection basées sur les instructions du fabricant fonctionnent bien pour introduction de LNA inhibiteurs de miRNA, miRNA synthétique duplex ou siRNAs.
  3. Après 16 à 48 h, stimuler les cellules endothéliales avec TGF-β2 (une concentration finale de 1 ng/mL).
  4. Procéder à diverses analyses en aval, y compris les ARN analyse de l’expression (RNA-sequencing (RNA-seq) analyses et RT-PCR quantitative), analyses immunocytochimiques et dosage de journaliste. Analyses en aval ont été décrites dans nos précédents rapports20,26,27.

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Résultats

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TGF-β est un puissant inducteur des EndMT dans les cellules endothéliales divers. Après 24 h de traitement avec le TGF-β dans les cellules MS-1, coloration pour l’actine F montre la réorganisation de l’actine stress fibres (Figure 1 a)20. Un prétraitement avec un inhibiteur de la roche Y-27632 inhibe l’induction de l’actine réorganisation20. Les cellules endothéliales MS-1 changement d’une morphologie pavées cla...

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Discussion

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Il a été signalé que le traitement Ras et TGF-β activé pendant 24 h induit EndMT dans les cellules de MS-1, tandis que le TGF-β seul n’a provoqué aucune EndMT dans cette courte période21. Régulièrement, nous avons observé que TGF-β substantiellement induite EndMT après un traitement plus long (48 à 72 h) en MS-1 cellules20. EndMT a été observé à plusieurs reprises après un traitement prolongé avec le TGF-β (2 à 6 jours) dans les cellules endothéliales divers tels qu’ombilic...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions Zea Borok et Kohei Miyazono de suggestions dans la préparation du manuscrit. H.I.S. et M.H. sont pris en charge par la bourse de recherche Uehara Memorial Foundation et H.I.S. est soutenu par la bourse d’études commémorative de Osamu Hayaishi pour études à l’étranger. Ce travail a été soutenu par une subvention de Takeda Science Fondation (A.S.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules MS-1American Type Culture CollectionCRL-2279
MEM-alphaThermo Fisher Scientific32571036
TGF-beta2R& D302-B2-002
Lame de chambre Lab-Tek II 4 puitsThermo Fisher Scientific154526
Y-27632  ;Sigma-AldrichY0503
Blocking Onenacalai tesque03953-95
phalloidin-tétraméthylrhodamine B isothiocyanateSigma-AldrichP1951
TOTO-3 iodureThermo Fisher ScientificT3604
VE cadhérine monoclonal antibody (BV13)Thermo Fisher Scientific14-1441-82
alpha-SMA Anticorps monoclonal Cy3 (1A4)Sigma-AldrichC6198
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11001
HousseThermo Fisher Scientific174934
Solution de collagèneNitta gelatin Inc.Cellmatrix I-P
Tampon de dilution de collagèneNitta gélatine Inc.Cellmatrix I-P
Inhibiteur de miARN de l’ARNEXIQON  ;miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (contrôle B négatif et miARN cible)
miARN duplex synthétiqueQiagen  ;miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778030
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668027

Références

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Mots-clés

Signalisation du TGF b tacellules endoth liales MS 1contraction de gel de collag nemicroscopie confocaleactine des muscles lissesexpression de la VE cadh rinemodulation par les micro ARNanalyse de l expression g niqueplasticit ph notypique

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