Nous présentons ici un protocole d’expériences électrochimiques cellule entière pour étudier la contribution du transport de protons au taux de transport des électrons extracellulaire par les cytochromes de la membrane externe complexes de Shewanella oneidensis MR-1.
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Article de méthode
Électrochimique détection de cinétique effet isotopique sur extracellulaire Transport d’électrons dans Shewanella oneidensis MR-1
Dans cet article
Résumé
Résumé
Direct de détection électrochimique de c-type incorporés dans la membrane externe bactérienne du cytochrome complexes (membrane externe c-type du cytochrome complexes ; OM c- Cyts) a récemment émergé comme nouvelle méthode analytique cellule entière pour caractériser le transport des électrons bactérien de la chaine respiratoire à l’extérieur de la cellule, dénommé le transport des électrons extracellulaire (EET). Alors que la voie et la cinétique de l’écoulement d’électron au cours de la réaction de EET ont été étudiés, une méthode électrochimique cellule entière pour examiner l’impact du transport de cations associé à EET n’a pas encore été établie. Dans la présente étude, un exemple d’une technique biochimique pour examiner l’effet isotopique deutérium (KIE) sur EET par OM c- Cyts utilisant un microbe modèle, Shewanella oneidensis MR-1, est décrite. L’EIC sur le processus EET peut être obtenue si l’EET par OM c- Cyts agit comme l’étape cinétiquement limitante dans la production actuelle microbienne. À cette fin, avant l’ajout de D2O, le surnageant a été remplacé avec les supports neufs contenant une quantité suffisante de donneur d’électrons pour soutenir le taux de réactions métaboliques en amont et de retirer les cellules planctoniques un uniforme monocouche biofilm sur l’électrode de travail. Méthodes alternatives pour confirmer la limitante étape dans la production actuelle microbienne comme EET par OM c- Cyts sont également décrites. Notre technique d’un dosage électrochimique cellule entière pour étudier la cinétique du transport proton peut être appliquée à d’autres souches microbiennes électroactif.
Introduction
Des techniques électrochimiques de qualifier directement une protéine d’oxydo-réduction dans une cellule bactérienne intacte ont récemment émergé depuis la découverte de souches microbiennes-réduction des métaux, tels que S. oneidensis MR-1 ou Geobacter sulfurreducens PCA, qui ont des complexes de cytochrome c-type de membrane externe (OM c-Cyts) exposés à la cellule extérieur1,2,3,4,5. L' OM c- Cyts médiation transport des électrons de la chaine respiratoire à des substrats solid....
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Protocole
1. formation d’un Biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 sur une électrode ITO (Figure 1)
Remarque : Pour éviter la contamination du réacteur électrochimique avec d’autres microbes, tous les médias, outils et composants du réacteur électrochimique doivent être stérilisés à l’avance. Quand à l’aide de cellules de S. oneidensis MR-1 et la construction des réacteurs électrochimiques, toutes les procédures doivent être réalisées sur un banc propre.
- Culture de cellules de S. oneidensis MR-1
Remarque : Un biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 a été formé sur l’OIC....
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Résultats
Après 25 h de demande potentielle, à + 0,4 V (par rapport à elle), un biofilm monocouche a été formé sur l’électrode de travail du verre ITO, qui a été précédemment confirmée par un microscope électronique à balayage ou une microscopie confocale4. L’évolution temporelle représentatifs de la production actuelle de M. S. oneidensis -1 lors de la formation d’un biofilm monocouche est montrée dans la Figure 2. Bien que le courant .......
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Discussion
Notre essai électrochimique cellule entière a plusieurs avantages techniques par rapport à l’électrochimie de protéine. Tandis que la purification de la protéine nécessite des procédures fastidieuses multi-étapes, notre méthode de cellule entière prend une journée de formation de biofilm auto-organisé après culture cellulaire. Pour parvenir à une interaction stable entre OM c- Cyts et l’électrode, nous avons besoin seulement de stérilisation et de nettoyage de la surface de l’électrode ; il ne nécessite pas de m.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention pour spécialement favorisé la recherche de la Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 24000010, 17H 04969 et JP17J02602, la nous Bureau du Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. est chercheur JSPS et pris en charge par JSPS grâce au programme pour les écoles supérieures menant (mérite).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cylindre en verre | N/A | N/A | Sur mesure, utilisé comme |
| couvercle et base en PTFE | N/A | N/A | Fabrication sur mesure, utilisé comme couvercle et base du réacteur électrochimique |
| Caoutchouc buthyle | N/A | N/A | Sur mesure, inséré entre chaque composant du réacteur électrochimique |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Utilisé comme orifice d’injection d’un réacteur électrochimique |
| Électrode d’oxyde dopé à l’indium et à l’étain (ITO) | GEOMATEC | n° 0001 | Utilisé comme électrode de travail, électrode saturée 5&Omega ;/ |
| sq Ag/AgCl KCl | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Utilisé comme électrode de référence, &Phi ; Fil de platine de 0,30 mm |
| The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Utilisé comme contre-électrode | |
| Luria-Bertani (LB) Broth, Miller | Becton, Dichkinson and Company | 244620 | Milieu pour la préculture de S. oneidensis MR-1 |
| Gélose Bacto | Becton, Dichkinson and Company | 214010 | |
| Anthraquinone-1-sulfonate (&alpha ;-AQS) | TCI | A1428 | |
| Flavin mononucléotide (FMN) | Wako | 184-00831 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Utilisé pour les milieux définis (DM) |
| CaCl2 · ; 2H2O | Wako | 031-00435 | Utilisé pour DM |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Utilisé pour DM |
| MgCl2 · ; 6H2O | Wako | 135-00165 | Utilisé pour DM |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Utilisé pour |
| l’acide éthanesulfonique DM 2-[4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinyl] (HEPES) | DOJINDO | 346-08235 | Utilisé pour la |
| solution de lactate de sodium | DM Wako | 195-02305 | |
| Extrait de levure Bacto | Becton, Dichkinson and Company | 212750 | |
| Oxyde de deutérium (D, 99,9 %) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-PK | Additif pour les expériences d’effet isotopique cinétique |
| Incubateur | TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD. | LTI-601SD | Utilisé pour la pré-culture |
| Shaker | TAITEC | NR-3 | Utilisé pour la pré-culture |
| Machine autoclave | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Utilisé pour la stérilisation du réacteur électrochimique et du milieu |
| Banc propre | SANYO | MCV-91BNF | Utilisé pour prévenir la contamination du réacteur électrochimique et du milieu par d’autres microbes |
| Séparateur | Eppendorf | 5430R | Vitesse de rotation jusqu’à 6000× ; g est nécessaire |
| Générateur d’azote gazeux | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | La bouteille d’azote gazeux peut également être utilisée à la place du générateur de gaz |
| Spectromètre UV-vis | SHIMADZU | UV-1800 | Utilisé pour l’optimisation de la densité cellulaire |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Utilisé pour la formation de biofilms et les expériences d’effet isotopique cinétique |
| Circulateur d’eau thermique | AS ONE | TR-1A | Utilisé pour le maintien de la température du réacteur électrochimique |
| Cage de Faraday | HOKUTO DENKO | HS-201S | Utilisée pour les expériences électrochimiques |
Références
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
- Bretschger, O., et al.
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Réimpressions et autorisations
